全 文 ：植　　　物　　　研　　　究
BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH
第 18 卷　第 4 期 1998 年　10 月
Vol.18　No.4 Oct., 　1998
用基因枪法将 GUS 基因导入烟草脱外壁花粉及其瞬间表达
王　劲1　施华中1　周　嫦1　杨弘远1　张献龙2　章荣德2
(1.武汉大学生命科学学院植物生殖生物学研究室 ,武汉　430072)
(2.华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室 ,武汉　430070)
摘　要　以 β—葡糖苷酸酶(β —glucuronidase , GUS)基因作为报告基因 ,用基因枪
法将其导入烟草(Nicotiana tabacum L .)脱外壁花粉和作为对照系统的完整花粉 ,
探讨了启动子及不同轰击条件对外源基因瞬间表达的影响 ,比较了二者的转化频
率。结果表明:玉米花粉特异启动子能启动 GUS 基因在脱外壁花粉和完整花粉中
表达 ,而 CaMV35S启动子则不能 。靶距离越近 ,着弹率越高 ,GUS 基因瞬间表达频
率越高;当进气压力为 900psi(pounds per sq.in.)、靶距为 6cm 时 ,脱外壁花粉的瞬
间表达频率达最高 ,为 0.45%,约为完整花粉的 6 倍 。表达的蓝色反应花粉经
DAPI荧光染色后细胞学观察表明 ,金粉粒能够打入营养核和生殖核 。
关键词　脱外壁花粉;基因枪;GUS 基因;瞬间表达;烟草
TRANSIENT EXPRESSION OF GUS GENE DELIVERED
INTO DE-EXINED POLLEN IN NICOTIANA TABACUM
BY MICROPROJECTILE BOMBARDMENT
Wang Jin1　Shi Hua-zhong1　Zhou Chang1
Yang Hong-yuan1　Zhang Xian-long2　Zhang Rong-de2
(1.College of Life Science , Wuhan University , Wuhan 430072)
(2.State Key labora tory of Crop Genetic Improvement , Huazhong Agricultural University , Wuhan 430070)
Abstract　As a part of our research to develop an alternative sy stem for gene t ransfor-
mation we investigated the possible usage of de-exined pollen(DEP)as a foreign gene
vector in comparision w ith the control intact pollen(IP).Bombardment of β -glu-
curonidase(GUS)gene controlled by pollen -specific promoter Zml3 -260 into the
高等学校博士点专项基金和湖北省自然科学基金资助课题。
　收稿日期:1997-9-4
both kinds of pollen of Nicot iana tabacum resulted in t ransient expression of GUS
gene.No activity of CaMV35S promo ter was detected in both cases.The results
showed that under optimal bombardment conditions , ie.6cm of bombardment distance
and 900psi of rupture disk pressure , the f requency of t ransient GUS gene expression
was 0.45% in the DEP , six times higher than the control , indicating that DEP re-
sponded much bet ter to foreign gene t ransfer than IP.Cytological observations on GUS
-expressed pollen showed that int roduced gold particles w ere visible in the cy toplasm ,
vegetative nucleus as were as the generative nucleus.
Key words　De-exined pollen;Gene bombardment;GUS gene;Transient expres-
sion;Nicotiana tabacum
基因枪转化技术自发明以来〔7〕 ,已广泛应用于各类基因工程实验中 。利用花粉作为媒
介 ,通过授粉 、受精将外源 DNA 带入受精卵从而获得转基因植株 ,可克服组织培养过程中
的遗传变异及转基因植株的嵌合现象 ,是一条有潜力的遗传转化途径〔5〕 。应用基因枪进行
花粉的转化近年已有不少报道〔11-14〕 ,但利用该转化体系获得转基因植株仍十分困难 ,原因
之一是花粉具厚的外壁 ,致使转化频率偏低 。脱外壁花粉是本实验室建立的独特体系〔1〕 ,
它由于去除了花粉的外壁 ,已证实有利于外源基因的电激导入〔2〕 。为了进一步提高转化频
率 ,本实验采用基因枪法将含玉米花粉特异启动子 Zm l3-260 的 GUS 基因导入烟草脱外
壁花粉 ,并以完整花粉作为对照系统 ,取得如下结果。
1.材料与方法
1.1　质粒
pBS-260gn 质粒由美国纽约州立大学 J.P.Mascarenhas教授惠赠 ,它是带有由玉米
花粉特异启动子 Zml3-260 、GUS 编码区及 NOS 终止子组成的融合基因的表达载体〔4〕 。
pBI121是带有CaMV35S-GUS-NOS 融合基因的双元表达载体〔6〕 。
1.2　金粉粒—质粒 DNA微弹的制备
在 50μL 金粉悬液(金粉直径 1μm ,浓度 60mg/mL)中 ,依次加入 10μg 纯化的质粒
DNA 、50μL 2.5mol/L CaCl2 、20μL 0.1mol/L 亚精胺 ,振荡 3min ,置冰上 1min ,10000rpm 离
心 3s ,去上清液 ,用 250μL 无水乙醇清洗 ,去上清液 ,加 60μL 无水乙醇 ,混匀 ,用于轰击 。
1.3　花粉的制备
按王劲等的方法〔1〕制备脱外壁花粉 ,充分洗涤后悬于附加 30%PEG的 D2 基本培养基
中〔8〕 。取开花当天的花药于附加 20%蔗糖的 BK培养基〔3〕中压出花粉 ,45μ不锈钢网过滤 ,
离心收集后用培养基洗涤 3次 ,重悬于少量培养基中。
1.4　微弹轰击
利用 PDS-1000/He 型(Bio-Rad)基因枪 ,取 10μLDNA—金粉粒悬液 ,采用不同的进
气压力和靶距 ,按仪器使用说明书对样品进行微弹轰击。以未包裹 DNA 的金粉粒轰击的
样品及未轰击的样品作为对照。处理后的脱外壁花粉和完整花粉重悬于上述培养基中 ,
25℃静置培养。
1.5　GUS 基因瞬间表达检测及着弹位点分析
4234 期　　　　　　王　劲等:用基因枪法将 GUS 基因导入烟草脱外壁花粉及其瞬间表达
轰击后的花粉镜检统计着弹率 ,培养 24h后统计萌发率 ,收集样品进行 GUS 组织化学
染色 ,染液为:1mg/mL X-gluc、0.5mmol/L Ks〔Fe(CN)6〕、0.5mmol/L K4〔Fe(CN)6〕、
0.03%Triton X-100 、0.1mmol/L 磷酸缓冲液(pH7.0), 37℃温育 24h 后统计蓝色反应花
粉的频率。在光镜下或经 DAPI(10μg/mL)荧光染色后在荧光显微镜下镜检金粉粒打入花
粉的部位 。
2.结　　果
2.1　不同启动子的影响
本实验使用的两种质粒 ,其 GUS 基因受两种不同的启动子控制 ,分别为 CaMV35S 和
花粉特异启动子 Zm l3-260 。结果表明 ,Zml3-260能启动 GUS 基因在脱外壁花粉和完整
花粉中表达 ,而 CaMV35S则不能 。用 pBI121 质粒轰击脱外壁花粉与成熟花粉 ,然后进行
授粉 ,已获得种子 ,转基因植株的筛选正在进行中 。
2.2　金粉粒打入花粉的部位
花粉经轰击后 ,在光镜下可见打入其中的金粉粒 ,从一粒到数十粒不等(图 1 , a , b)。花
粉萌发后 ,金粉粒可随细胞质流入花粉管(图 1 , c)。转化后的花粉经过 DAPI 荧光染色显示
细胞核部位后发现 ,金粉粒不仅可打入花粉的细胞质 、亦可打入营养核和生殖核中(图 1 , d ,
e)。
图 1
a.示花粉粒中的金颗粒 , ×240;b.示脱外壁花粉中的金颗粒 , ×150;c.示花粉管中的金颗粒 , ×590;d.示营
养核中的金颗粒 , ×380;e.DAPI 荧光染色 ,示生殖核中的金颗粒 , ×260
F ig.1
a.Gold part icles in the pollen grains , ×240;b.Gold particles in the de-exined pollen , ×150;c.Gold particles
in the pollen tube , ×590;d.Gold particle in the vegetative nucleus , ×380;e.DAPI f luorescent staining , show ing
gold particle in the generative nucleus , ×260
2.3　靶距对脱外壁花粉着弹率 、萌发率及GUS 基因瞬间表达的影响
脱外壁花粉和作为对照的完整花粉在靶距为 6cm 时的着弹率最高 ,分别为 82.1%和
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68.0%,且随靶距加大而降低(图 2)。靶距对完整花粉的萌发率影响不大 , 6cm 时其萌发率
仍有 70.3%;而对脱外壁花粉则有较大影响 ,其萌发率随靶距减小而降低(图 3)。
图 2　靶距对花粉着弹率的影响
IP:完整花粉;DEP:脱外壁花粉 ,下同
Fig.2 　Influence of bombardment distance on the
delivery o f g old particles
图 3　靶距对花粉萌发率的影响
F ig.3　 Influence of bombardment distance on the
pollen germination
靶距影响脱外壁花粉的GUS 基因瞬间表达频率。图 4显示 ,当进气压力为 450psi时 ,
GUS基因瞬间表达频率随靶距变小而增大。脱外壁花粉的 GUS 基因瞬间表达频率(以 X
-gluc蓝色反应花粉频率为指标)在靶距为 6cm时可高达 0.33%,约为完整花粉的 6倍 。
图 4　靶距对 GUS 基因瞬间表达频率的影响
Fig.4 　Influence of bombardment distance on the
GUS gene transient expression
图 5　进气压力对 GUS 基因瞬间表达频率的影响
F ig.5 　I nfluence of rupture disk pressure on the
GUS gene transient expression
此外 ,还比较了转化花粉的 X-gluc温育时间对检测结果的影响。转化花粉以 X-gluc
温育 5h可观察到蓝色花粉 ,蓝色花粉比率随温育时间的延长而增加 , 24h 时达到稳定;继续
延长温育时间 ,蓝色花粉数几乎不变。未包裹 DNA 的金粉粒轰击及未轰击的两个对照中
都观察不到蓝色花粉 。
2.4　进气压力对脱外壁花粉 GUS基因瞬间表达的影响
当靶距为 6cm时 ,脱外壁花粉的 GUS 基因瞬间表达频率因进气压力不同而异。当压
力为 900psi时 ,其 GUS基因表达频率最高 ,可至 0.45%,亦为完整花粉的 6倍(图 5)。
4254 期　　　　　　王　劲等:用基因枪法将 GUS 基因导入烟草脱外壁花粉及其瞬间表达
3.讨　　论
用基因枪法转化花粉 ,所得到的瞬间表达频率有不同的报道。 Tw ell 等〔14〕和 Nishi-
hara
〔11〕利用从番茄中得到的花药特异启动子 LAT52 控制的 GUS 基因转化烟草的成熟花
粉 ,瞬间表达频率分别为 0.1%和 0.7%;而 Stöger等〔13〕用从矮牵牛中分离的花粉特异启动
子 PA2控制的GUS 基因转化烟草成熟花粉 ,表达频率却只有 0.025%。本实验所用的花粉
特异启动子Zml13是从玉米中分离的〔4〕 ,所得到的 GUS基因瞬间表达频率 ,脱外壁花粉为
0.45%,完整花粉为 0.072%。这些差异可能与使用的基因枪类型 、培养基以及启动子有
关。Morikaw a等〔10〕认为 LAT52启动子在双子叶中的表达水平高于单子叶植物 ,而从单子
叶植物中分离的 Zm l13启动子则相反。
花粉富含细胞质 ,缺乏液泡 ,因而能忍受多个金粒打入的损伤〔10〕。本实验中观察到 ,打
入几粒乃至几十粒金粉的花粉 ,仍然能萌发和表达外源基因 。脱外壁花粉和完整花粉的着
弹率高达 82.1%和 68.0%,而它们的 GUS 基因瞬间表达频率却只有 0.45%和 0.072%。
为什么着弹率与表达率之间有这么大的差异 ? Yamashita等〔15〕发现 ,表达 GUS基因的烟草
悬浮液细胞中 , 90%以上的核都被击中了一粒金粉 。他们认为 DNA 导入靶细胞的核中有
最高的基因表达频率 。金粉粒经过轰击 ,绝大部分打入花粉的细胞质 ,只有少部分打中花粉
的营养核和生殖核。Miyoshi等〔9〕发现 ,Zml13启动子在生殖细胞中不表达。因此 GUS 基
因只有在打中营养核的那部分花粉中表达的可能性最大。
脱外壁花粉是近年建立的独特体系〔1〕 ,本实验首次用基因枪法将 GUS 基因导入烟草
脱外壁花粉 ,并检测到瞬间表达。由于除去了坚厚的外壁 ,已证实脱外壁花粉有利于外源基
因的电激导入〔2〕 ,本实验表明 ,利用基因枪转化法 ,脱外壁花粉的 GUS 基因瞬间表达频率
高于完整花粉(约为 6倍)。可能由于脱外壁花粉没有了外壁的屏障 ,金粉粒更易打入其营
养核 ,从而提高了外源基因的表达频率 。因此 ,利用脱外壁花粉作为外源 DNA 的媒介进行
植物遗传转化 ,可能成为一条有潜力的技术途径。
参　　考　　文　　献
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