全 文 ：第 20 卷　第 4 期　　　　　　　　木　　本　　植　　物　　研　　究 2000 年　10 月
Vol.20　No.4　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Oct., 　2000
异戊烯基转移酶基因转化胡卢巴的研究
黄永红　尤凤丽　孔若东　王付德
(大庆高等专科学校 ,大庆　163712)
汪清胤　付桂荣　黄永芬
(哈尔滨师范大学 ,哈尔滨　150080)
摘　要　将含有生长素诱导的小分子 RNA 启动子与异戊烯基转移酶基因的融合
基因(pSAUR—ipt)的 Ti质粒作为供体 DNA ,通过花粉管通道法导入胡卢巴中。
D1 、D2代植株经 Southern杂交检测 ,有杂交带出现 ,获得了转基因胡卢巴。对转基
因胡卢巴 D3 、D4 和 D5 代进行了生理生化指标及田间性状分析 ,发现转基因胡卢巴
与CK 相比有植株略矮 、分枝数增多 、双角数增多等表型变化 ,D4 代叶绿素含量 、半
乳甘露聚糖含量增加 ,D5 代可溶性蛋白和细胞分裂素含量增加 ,它们都与产量呈正
相关性。从而证明了 pSAUR—ipt基因已导入胡卢巴中。
关键词　胡卢巴;Ti质粒;pSAU R—ipt基因;花粉管通道法
STUDY ON SAUR-IPT GENE TRANSFORMED
TRIGONELLA .FOONELLA.FOENUM .GRAECUM
HUANG Yong-Hong　YOU Feng -Li　KONG Ruo-Dong　WANG Fu-De
(Daqing high training school , Daqing , Post code　163712)
WANG Qing -Yin　FU Gui-Rong　HUANG Yong-Fen
(Harbin normal univ ersity , Harbin , Post code　150080)
Abstract　By means of the pollen tube pathw ay , the Ti plasmid which carrying the
SAUR-ipt gene was t ransferred into Trigonel la .Foonella.Foenum .graecum .We
tested D1 generation plants w ith DNA southern blot hybridization and got f ive t rans-
formed plants.Analyzing the changes of morphology physiology and field characters of
D3 , D4 and D5 generation t ransfo rmed plants , we found that the plants were dw arf
slightly , amount of branch and double-legume increased , the shape of leaf became
第一作者简介:黄永红(1960-),女 ,副教授。主要从事:遗传学教学和遗传工程研究。本论文为大庆石油管理局科技资金资助项目和蔡火石生命科学资金部分资助项目。收稿日期:1999-7-29
narrow , the content of chlorophyll and plant pastern increased in D4 generation , and
solvable protein and ZRs increased in D5 generation.They are all reveal posit ive perti-
nence for the yield.Therefore , it is proved that SA UR-ipt gene already t ransferred
into Trigonella.foonella.foenum.g raecum.
Key words　Trigonella.foonella.foenum.g raecum;Ti plasmid;ipt gene;pollen tube
pathw ay
前　言
胡卢巴(Trigonella foenum —graecum L.)是一种半野生豆科植物。在我国安徽 、江
苏 、河北 、新疆 、内蒙古 、黑龙江等黄河以北地区均可种植[ 1] ,其茎可做绿肥 ,种子含有多种
药用成分 ,其中所含的半乳甘露聚糖(植物胶)可用于油田压裂生产 ,能提高原油产量 ,具有
重要的经济价值 。
定向地控制作物的生长发育对培养优良新品种是十分关键的问题。植物激素是植物体
内合成的一类调节植物生长发育的物质 ,其中生长素具有增加细胞壁可塑性和 RNA 诱导
下蛋白质合成 ,进而促进生长的机能。细胞激动素则具有促进细胞分裂和细胞扩大 、抑制衰
老的作用 。在植物体内二者比例不同 ,产生的生理效应不同 。ipt是与植物细胞分裂素合成
相关的基因 ,pSAUR是生长素诱导的小分子 RNA 启动子 , pSAU R-ipt融合基因在植物体
内的表达 ,可以从内源改善生长素和激动素的含量和比例 ,提高农作物光合作用效率 ,从而
提高作物产量。因此 ,为使胡卢巴提高产量和胶含量 , 1994年我们采用花粉管通道法 ,将整
合在 Ti质粒上的 pSAUR—ipt基因转移到胡卢巴中 ,获得了转基因胡卢巴。
本文首次报道了用花粉管通道法转化胡卢巴获得转基因胡卢巴植株。
1　材料和方法
1.1　实验材料
1.1.1　受体胡卢巴:由大庆市农业研究所提供。
1.1.2　供体基因:pSAUR—ipt基因整合在 Ti质粒 pMon505(代号 8SL)转移到 Ecoli DH5a
中保存。由哈尔滨师范大学分子生物学研究室克隆并提供 。
1.2　实验方法
1.2.1　胡卢巴转化
1.2.1.1　大量提取质粒方法(按《分子克隆实验指南》方法进行[ 2])。
1.2.1.2　花粉管通道注射法
当胡卢巴的花蕾伸长 3 ～ 5mm时 ,将柱头连同花瓣一起剪去 1/3 ,用微量注射器向柱头
注射 5 ～ 10μl的 8S L 质粒 DNA的 TE 溶解液(1μl/ml)。
1.2.2　酯酶同工酶检测:见文献[ 3] 。
1.2.3　转基因胡卢巴的 Southern杂交分析
1.2.3.1　转基因胡卢巴叶片总 DNA 的提取
选田间试验 、同工酶分析与对照组有差异的转基因胡卢巴 D1 代 、D2代植株 ,取其上部
幼嫩叶片为材料 ,按文献[ 4]方法进行。
1.2.3.2　探针制备
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以 8SL 为探针从受体菌中提取质粒 DNA ,经 HindⅢ酶切后获得 。D1 代标记按缺口平
移法进行 ,使用 Prom tga公司的 Nicktranslation Kit ,按厂家提供的程序进行操作 ,标记同位
素为α—32P—dCTP ,购自北京福瑞公司 。D2 代标记用地高辛做标记物 ,采用随机引物标记
法 ,使用德国宝灵曼公司的 DIG Kit Ⅰ ,按厂家提供的程序进行操作 。
1.2.3.3　Southern转移及分子杂交按文献[ 2]方法进行。
1.2.4　转基因胡卢巴细胞分裂素的检测
该检测采用的是酶联免疫吸附测定法(ELISA),是按南京农业大学植物激素实验室研
制的 ZRs(细胞分裂素的ZR组:核糖玉米素)ELISA试剂盒说明书方法进行 。酶联免疫测
读仪使用的是 ASSA —1612型植物同化分析仪 。
1.2.5　转基因胡卢巴可溶性蛋白测定
可溶性蛋白提取采用 Staples等[ 5] 方法进行 。其含量是用紫外吸收法测定 ,仪器采用
UV ～ 265岛津自动记录分光光度计。将待测蛋白质溶液稀释至光密度在 0.2 ～ 2.0 间 ,测
定OD260和 OD280 ,计算二者的比值 ,查表得校正因子 F 值 ,利用公式计算可溶性蛋白含
量[ 6] :
蛋白质浓度(μg/ml)=F ×1/d×OD280×D
OD280为该溶液在 280nm 波长下紫外吸收值;d为石英比色杯厚度(cm);D为溶液稀释
倍数 。
1.2.6　叶绿素含量测定用紫外吸收法测定见文献[ 7] ,仪器采用 UV —265岛津自动记录分
光光度计 。
2　实验结果
2.1　D0代转基因胡卢巴种子的获得
用花粉管通道法转化胡卢巴 ,注射 8SL 花数 249 朵 ,成熟角数 192个 ,平均结角率为
77.1%,共获得 D0 代种子 2447粒。
2.2　转基因胡卢巴酯酶同工酶检测
酶是基因的直接产物 ,其可靠性要比田间性状更直接和准确 ,因此我们的研究以酯酶同
工酶作为转基因植物的初选指标和基因整合与表达的间接证据 。研究结果表明 ,转化植株
与未转化植株的酯酶同工酶谱存在差异 ,主要表现在 Ⅱ ～ 1带酶含量减弱 , Ⅱ ～ 2 、Ⅱ ～ 8带
酶含量增高 ,在 Ⅱ～ 2和Ⅱ～ 4带之间增加了一条弱带[ 3](见图 1)。
2.3　转基因胡卢巴的 Southern杂交检测
对 D1 、D2代酯酶同工酶谱有差异的转基因胡卢巴植株进行 Southern 杂交检测 ,有杂交
带出现(图 2)直接验证了外源 DNA 已经整合到胡卢巴基因中 ,从而筛选出转基因胡卢巴新
种质 。
2.4　转基因胡卢巴 D3 、D4 、D5代田间性状
1997 ～ 1999年我们在大庆市布置了 7个 试验点 , 16点次 ,进行了转基因胡卢巴植株株
高 、分枝 、双角 、产量等田间性状统计 ,见表 1。由表1可以看出 ,转基因胡卢巴植株与 CK 相
比 ,出现双角数增多 、分枝数增多 、植株略矮等表型变化(图 3),转基因胡卢巴亩产量比对照
增加 10%以上。
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1、2为对照 , 4～ 10 为 D2代转基因胡卢巴 , 6 为酶带有
差异的转基因胡卢巴
1、2 is contrast , 4 ～ 10 is D2 generations transformed
plants , 6 is the transformed plants which have differentia
bands.
图 1　 D2代酯酶同工酶检测结果
Fig.1 Esterase isozyme test results of D2 generations
1 为阳性对照 , 2 为阴性对照 , 3 ～ 6 为转基因胡
卢巴
1 is negative contrast , 2 is po sitive contrast , 3 ～ 6
is transformed plants
图 2　D2代转基因胡卢巴 Southern 杂交结果
Fig.2 　DNA southern blot hybridization results
of D2 generations transformed plants
图 3　D5 代转基因胡卢巴植株田间性状比较
Fig.3 　Field characters comparison of D5
generations transfo rmed plants
2.5　转基因胡卢巴生理生化指标检测
2.5.1　转基因胡卢巴 D4 代叶绿素 、胶含量与产
量
　　由表 2可以看出 ,转 pSAUR—ipt基因
胡卢巴新品系 D4 代叶绿素含量 、胶含量与亩产
量呈正相关性 ,与 CK 相比 ,叶绿素总含量平均
增加 101.34%,植物胶含量平均增加 24.5%,亩
产量平均增加 11.68%。
2.5.2　转基因胡卢巴 D5代可溶性蛋白 、ZRs含
量与产量见表 3。
由表 3可见 ,转基因胡卢巴 D5 代可溶性蛋
白 、ZRs含量与亩产量也呈正相关性 ,与 CK 对
比转基因胡卢巴可溶性蛋白平均含量增加 93.
85%,ZRs平均含量增加 74.49%,亩产量平均增
加 13.36%。
3　讨　论
3.1 pSAU R-ipt基因在转基因胡卢巴中的表达
YiLi在研究烟草的实验中发现转 ipt 基因植株有明显矮化现象 。Partricia 等[ 8] 在
AT2S —ipt融合基因转化烟草的实验中发现 D1 代转基因植株的开花期分枝增多。 Roeckel
等[ 9]在细胞分裂素合成基因转化的油菜和烟草的研究中 ,发现转基因植株的平均结荚数提
高 ,前人的研究还表明 , ipt基因工程能提高作物产量 。根据这些研究结果 ,本研究在田间性
4234 期　　　　　　　　　　　黄永红等:异戊烯基转移酶基因转化胡卢巴的研究
状上从株高 、分枝 、结荚数 、产量等方面进行了统计 ,其结果显示 ,转基因胡卢巴与对照组有
明显的差异 ,从而 ,由田间性状上推测 pSAU R—ipt基因在转基因胡卢巴上已经表达 。
表 1 转基因胡卢巴 D3 、D4 、D5 代田间性状统计
Table 1 Statistics of field characters for D3 , D4 and D5 generations transformed plants
品种
Variety
统计参量
Statistical parameters
D3 代
(1997 年)
D4 代
(1998年)
D5代
(1999 年)
转基因胡卢巴
transformed plant
双角数(对/株)
Amount of
double-legume
28.67 27.57 28.4
分枝(个)
Amount of branch
7.44 7.2 7.5
株高(cm)
Height of the plants
61.35 55.95 58.9
产量(公斤/亩)Yield 117.2 111.9 108.3
CK
双角数(对/株)
Amount of
double-legume
2.9 6.3 6.7
分枝(个)
Amount of branch
5.67 4.49 4.93
株高(cm)
Height of the plants
66 61.83 63.7
产量(公斤/亩)Yield 100.2 100.2 97.77
表 2 转基因胡卢巴 D4代叶绿素含量 、胶含量与产量统计表
Table 2 Statistics of chlorophyll , pastern content andthe yield for D4 generations trans-
formed plants
参 数
Parameter
转基因胡卢巴
T ransformed plant
C K
增加百分率/ %
I ncrement percent
Ca(mg/ ml) 9.7 3.92 147.45
Cb(mg/ ml) 3.79 2.8 35
Ca+Cb(mg/ml) 13.49 6.7 101.34
Ca/Cb 2.56 1.4 82.86
胶含量(μg/ ml)
Content of pastern
153.9 123.3 24.5
产 量(公斤/亩)
Yield
111.9 100.2 11.68
注:植物胶含量检测由黑龙江省生物技术产品质量监督检测站测定。
424 木　本　植　物　研　究　　　　　　　　　　　　　　　20 卷
表 3 转基因胡卢巴 D5 代可溶性蛋白 、ZRs含量与产量统计表
Table 3 Statistics of solvable protein , phytochinin and the yield for D5 generations trans-
formed plants
参　　量
Parameter
转基因胡卢巴
T ransformed plant
C K
增加百分率/ %
I ncrement percent
可溶性蛋白(x)(mg/ m)l
Content of solvable protein
1.514 0.781 93.85
ZRs 含量(x)(pmol/g＊FN)
Content of ZRs pmol/ g＊FN 478.52 274.24 74.49
产量(公斤/亩)
Yield
110.83 97.77 13.36
＊ZRs含量测定是在东北农业大学植物生理实验室由李文华教授指导下完成的。
叶绿素含量的增加 ,会提高整个光系统的利用率 ,提高光合作用的效率 ,而光合速率的
提高有可能促进有机物质的积累[ 10] 。而且 YiLi的烟草转 ipt基因的研究表明 ,由于 ipt基
因的介入 ,转化植株的叶绿素含量比对照组高出 2 ～ 3倍。本研究对转基因胡卢巴 D4 代叶
绿素含量及产量进行了统计 ,与对照组相比 ,转基因胡卢巴叶绿素含量提高并与产量呈正相
关性 ,说明了由于 pSAU R—ipt基因的表达导致了叶绿素含量提高。
由于 ipt 基因编码的异戊烯基转移酶是细胞分裂素的前体 ,因此它的表达可引起转化
植株中内源细胞分裂素的升高 ,所以测定内源激素的变化可说明该基因是否表达 。而
Smigocki和 Owens等[ 11]用 ipt基因自身转化烟草 ,结果烟草组织中玉米素和玉米素核苷的
水平比对照增加 7倍 ,因此 ,从内源细胞分裂素的变化来筛选转基因后代和验证基因表达是
十分有效的方法 。本研究中应用酶联免疫法对转基因胡卢巴和对照组的 ZRs含量进行了
检测 ,其结果是:转基因胡卢巴 ZRs含量比 CK增加 74.49%,从而验证了 pSAUR—ipt基因
在转基因品系中已经表达 。
本研究中胡卢巴种子可溶性蛋白和植物胶含量增加 ,据推测可能是由于 ipt基因的表
达促使有机物质在体内积累的结果 。
3.2　用花粉管通道法将整合在 Ti质粒的外源基因导入植物是一种简单可靠的转基因途径
在植物转基因研究中 ,目前已成功地建立了农杆菌 Ti和 Ri质粒的转化系统及外源基
因的直接导入法 ,如 PEG法 、电激法 、基因枪法。通过 Ti和 Ri质粒可将外源 DNA插入到
植物染色体上目前已毫无异议 ,但这个体系操作 ,大多采用叶片法或原生质体感染途径进行
转基因 ,再经过组织培养或原生质体培养获得再生植株 。其操作与设备条件要求相对复杂 ,
特别是应用于对用组织培养不易获得再生植株的植物方面有一定的局限性 。因此 ,探索开
辟组织培养的其它有效途径就显得更加有意义。周光宇等[ 12]首创通过花粉管通道法直接
注射外源总 DNA进行分子育种。由于植物受精卵是一个天然原生质体 ,外源 DNA容易整
合进去 ,故这一方法已在棉花 、水稻 、大豆等作物获得了大量的变异株 ,但由于导入的外源
DNA整合到植物体的机理尚不清楚 ,定向性差 ,田间筛选工作量大 ,较难使用分子杂交检
测。而我们的研究工作则是用花粉管通道注射的方法将目的基因(即整合在 Ti质粒上
pSAUR—ipt基因)导入胡卢巴。这项研究工作进一步为花粉管通道法外源 DNA 转化提供
了分子生物学证据。
4254 期　　　　　　　　　　　黄永红等:异戊烯基转移酶基因转化胡卢巴的研究
3.3　同工酶分析可作为转基因植物筛选的指标和基因表达的间接证据
转基因植物的检测技术目前已经成熟 ,通常用 Southern杂交或 PCR扩增证明外源基因
是否整合到植物基因组中 。但这些工作技术难度大 ,耗资多 ,特别对 D2代以后大量转基因
后代的分析检测 ,困难较大 ,而同工酶分析与上述方法相比 ,相对来说比较简单 。
尽管同工酶在植物体内因不同发育时期 、不同部位有差异 ,但是在检测过程中充分考虑
了各种可能的影响因素 ,在植株的培养条件 、采摘日期 、取材部位及酶的提取方法等方面 ,使
转化株和未转化株条件保持一致 ,尽量避免干扰因素的存在 ,而在这种控制条件下转基因胡
卢巴已出现酯酶同工酶谱差异 ,我们认为是由于外源基因的插入 、整合和表达 ,引起转基因
胡卢巴生理生化变化 ,从而使酯酶同工酶谱发生变化 ,因此我们认为同工酶分析可作为转基
因植物初步筛选指标和基因表达的间接证据 。
4　结　论
4.1　通过对转 pSAUR—ipt基因胡卢巴后代进行酯酶同工酶及 Southern杂交检测 ,发现转
基因胡卢巴酯酶同工酶谱与 CK 酶谱有明显差异 , Southern 杂交出现杂交带 , 说明
pSAUR—ipt基因已导入胡卢巴 。
4.2　通过对转 pSAUR—ipt基因胡卢巴后代的田间性状 、产量的变化及生理生化指标 、内
源激素含量检测 ,说明了 pSAUR—ipt基因在胡卢巴中已经表达 。
参　　考　　文　　献
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