全 文 ：第 22卷　第 3 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2002 年　7月
Vol.22　No.3　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH July , 　2002
基因芯片与植物基因差异表达分析
李同祥1 , 2 　王进科1
(1.东南大学教育部分子与生物分子电子学重点实验室 ,南京　210096)
(2.甘肃广播电视大学 ,兰州　730030)
摘　要　基因芯片为研究植物不同个体或物种之间以及同一个体在不同生长发育阶段 、正常和疾
病状态下基因表达的差异 、某一性状多基因的协同作用 , 寻找和定位新的目的基因等方面带来了
革命性的变革 。与传统研究基因差异表达的方法相比 ,它具有微型化 、用材少 、快速 、准确 、灵敏度
高 、能基在因同等一研究方面已取得了显著的成绩 ,如拟南芥 、酵母 、水稻等 。
关键词　基因芯片;差异表达;植物
DNA MICROARRAY AND ANALYSIS OF DIFFERENTIAL
GENE EXPRESSION IN PLANT
LI Tong-xiang1 , 2　WANG Jin-ke1
(1.National Laboratory of Molecular and Biomolecular Electronics , Southeast University ,Nanjing 210096)
(2.Gansu Radio &TV University , Lanzhou 730030)
Abstract　DNA microarray technology has made a revolutionary transformation in studying differential gene
expression , the collaboration of multigene for one trait , discovering and locating target genes , among different
individual in a same or different species and one plant individual in different development stage as well as be-
tween normal and diseased condition.The major advance of DNA microarray technology , as compared to con-
ventional techniques , results from the small size of the array , which allows for a higher accurate , a quicker
process and a higher sensitivity enables the parallel screening of larger number of genes simultaneously on one
chip and provides the opportunity to use smaller amounts of starting material.Many significant achievements
have been obtained in picturing the expression profiles of genes , discoverying the target genes and elucidating
gene functions with DNA microarray on plant , such as Arabidopsis and yeast , rice.
Key words　DNA microarray;differential gene expression;plant
1.引言
基因的差异表达是调控生命过程的核心 ,基因
的表达 、关闭 、以及表达量的变化 ,决定了每一个生
命体的生长发育 、表型差异以及细胞周期调控 、衰
老 、死亡等生命过程 。因此 ,比较不同个体或物种之
间或者同一个体在不同生长发育阶段 、正常和疾病
状态下基因转录及表达的差异 , 寻找 、发现和定位
新的目的基因 ,如高产 、抗虫 、抗病 、耐寒 、耐旱基因
等 ,已成为植物学研究领域的方向和热点之一 。目
前 ,从不同样本中获取差异表达基因的方法有:基因
芯片 ,mRNA差显技术(DDRT-PCR),基因表达的系
列分析(SAGE),差异 cDNA 扫描 ,大规模 cDNA 测
第一作者简介:李同祥(1966-),博士生 ,从事生物芯片与植物遗传研究。 ltxiang@seu.edu.cn
　收稿日期:2001-03-10
序 ,表达序列标签(EST)数据库的比较和蛋白质双
向电泳 ,差异文库的构建 , cDNA 代表性差异分析法
(cDNA RDA),减法杂交 ,细胞核持续转录法(Nuclear
run-on transcription)等[ 1, 2] 。然而 ,这些方法与基因
芯片相比 ,在同时进行大规模基因检测分析时都存
在一定的缺陷或局限性 。DDRT-PCR重复性差 ,难
以标准化 ,对高拷贝数mRNA有很强的倾向性 ,不能
反映低拷贝mRNA ,特异性差异片段的假阳性率高 ,
有时甚至高达 85%。虽然 cDNA RDA具备了 DDRT
-PCR的多数优点 ,且分析结果更可靠 ,但仍存在一
定的假阳性率。减法杂交只能检测在特定类型细胞
中表达而在另一类细胞中不能表达的基因 ,不能反
映表达强弱的变化 ,难以分离低丰度 mRNA 。蛋白
质双向电泳不能分辨低丰度mRNA表达的低含量蛋
白 ,常因特异蛋白的量太少而无法继续对氨基酸的
序列进行分析。细胞核持续转录法只能用于对已知
基因表达水平变化的检测 。而基因芯片的出现为在
基因水平上大规模同时平行检测基因表达谱及基因
表达差异提供了强有力的工具。目前 ,国际上利用
DNA芯片技术进行植物基因表达谱分析研究工作
的相关报道并不多 ,主要的工作集中在拟南芥(Ara-
bidopsis)、酵母(Yeast)、草莓(Strawberry)和牵牛花
(Petunia)等方面[ 3 ～ 5] 。用DNA芯片检测植物激素对
植物基因表达的影响 ,环境因素如干旱 、肥力对植物
分子生态分化影响 ,植物对环境耐受力和抗虫病害
能力等的基因差异表达都可以用芯片进行快速分
析 ,大大促进植物育种和新品种的产生 。
2　基因表达芯片的检测与基因定位
参比样品所得的总 RNA分别用Cy-3(红色)及
Cy-5(绿色)-dUTP 于转录时引入标记后 ,荧光标
记靶标混合后在严谨条件下与芯片上克隆阵列杂
交 ,芯片上杂交固定的荧光靶标用激光光源激发
(Cy3为 550nm , Cy5 为 649nm)[ 6 , 7] ,发射出特定波长
的荧光用激光共聚焦扫描仪检测 ,如 General Scan-
ning 公司的 Scan Array 3000是双色荧光标记双激光
激发的 ,其后的 Scan Array 4000和 5000则是四激光
激发荧光标记的。采集各杂交点的荧光信号位置 ,
荧光强弱 ,双色荧光测定则分别测读两种荧光的强
度 ,然后用软件进行计算机运算 ,测得各点上的信息
包括:基因名称 ,克隆鉴定 、强度和比例 ,归一化参数
和可信限。1 次杂交试验的数据用归一化(Cy3:
Cy5)表示:比例为 1表示测试与参比样品基因表达
水平无变化 ,比例>1 表示增高 , 比例 <1 表示降
低[ 8] 。也即用双色荧光激光扫描仪获得的图中有伪
色的出现 ,黄色表示两个信号强度相同 ,即表示该基
因在两个不同的样品中的表达水平一样 ,红色表示
红色探针信号较强 ,绿色表示绿色探针信号较强[ 9] 。
3　差异表达芯片的应用
3.1　两类用于基因差异表达研究的芯片
在利用芯片技术进行基因表达研究时 ,根据集
成在芯片上 DNA片段的不同来源 ,主要有两种:基
于寡核苷酸微阵列芯片和基于 cDNA片段的微阵列
芯片。虽然寡核苷酸阵列芯片的检测灵敏度高 ,可
检测出一个碱基的错配 ,但寡核苷酸芯片的制作是
基于 DNA序列已知的基础上 ,而 cDNA片段可以来
自序列未知的 cDNA 克隆 、EST 克隆 ,隐含的基因组
克隆 ,或已知的基因组序列的扩增 ORFs[ 10 , 11] 。而目
前能用于寡核苷酸阵列芯片的序列已知的植物数量
极少 ,如有集胞藻(Synechocystis PPC6803)、荚膜红细
菌(Rhodobacter capsulatus)、拟南芥 、酵母[ 9] 。cDNA阵
列芯片是以定量的方式同时监测大量基因相对表达
的新方法 ,它已成功地用于同时检测 1000多个基因
的表达 ,如测定拟南芥 、酵母 、病毒样品的基因表达
水平。Schena 等人用含 48种成对的 cDNA 材料的
DNA芯片测定了拟南芥的基因差异表达[ 12] 。Schena
等人还用热休克或佛波酯调节基因的双色差异监测
分析了 1046种人的未知序列的 cDNA[ 12] 。Monsanto
Co.和 Synteni Incyte公司合作开发了拟南芥的玻璃
微阵列芯片 ,使用 1443 个基因不同表达对叶子 、根
和花序组织的基因表达进行了比较研究 。基因芯片
经由荧光标记 ,其检测灵敏度非常高 ,且检测范围
大 ,不同强弱信号在同一芯片上同时检测 ,获得大量
关于基因水平的信息 。
3.2　基因表达图谱的绘制
斯坦福大学的 Brown研究小组应用自制的点样
仪制备了酵母基因芯片 ,对不同细胞周期和外界环
境下酵母基因的表达谱图进行了检测[ 13] ,用酵母
6220个基因中的 2473个基因点样放置于芯片的相
应位置上 ,通过杂交获得了处于不同周期状态的细
胞在热休克 、冷休克以及二硫苏糖醇(DTT)处理后
细胞的表达图谱 ,根据获得的全部 79张基因表达图
谱 ,以表格方式绘制出了新的酵母表达图谱 ,直接揭
示出基因组中各基因相互关系 ,直观地反映出了在
不同状态和条件下基因转录 、调控和表达差异 ,从而
可以通过基因组转录效率来获得共同表达基因组及
其调控信息。加利福尼亚大学对 10 , 000 个小麦
EST 的研究及对55 ,000个马铃薯 EST 序列的 cDNA
微阵列的研究 ,爱荷华州立大学进行的高通量图谱
3113期　　　　　　　　　　　　　　李同祥等:基因芯片与植物基因差异表达分析
工具在玉米的研究项目中对 20 , 000个玉米 EST 序
列 3′端的研究等[ 14, 15] 。且研究表明 ,禾本科不同亚
科之间存在广泛的 DNA共线性 ,可以使用一套锚定
cDNA探针来绘制各个物种的表达图谱 ,在此基础上
绘制出禾本科复合图谱。这样的一套探针已经建
立 ,它包括选自水稻 、燕麦 、大麦和小麦 cDNA 文库
的152个 cDNA克隆[ 16] ,为 DNA 芯片研究基因组表
达及相互关系提供丰富的数据库资源。
3.3　寻找目标基因和基因功能
利用基因芯片进行基因表达差异分析 ,找出表
达差异的目的性状基因 ,使植物改良和作物育种工
作实现从表型选择到基因选择的根本性转变 ,特别
是对许多由多基因控制的数量性状遗传 ,基因芯片
可同时平行检测不同层次多基因协调作用。一些学
者将基因芯片技术与差异表达技术有机地结合 ,通
过对两种组织进行差异比较 ,提供差异表达基因的
浓聚库 ,将这些克隆 cDNA点到基因芯片上 ,快速筛
查目标基因[ 17] 。Derisi(1997)等应用酵母 cDNA基因
芯片研究在有丝分裂和孢子状态下基因转录和表达
水平的差异。他们发现有上千条基因在转录水平上
发生了变化。其中大部分是首次发现与酵母的孢子
状态有关[ 18] 。Selinsky 和 Samson(1999)运用基因芯
片在转录水平上对酵母细胞中大约 6 ,200个基因同
时进行了检测 ,并考察了它们受环境影响的情况 。
研究表明 ,当细胞用甲基甲磺酸进行脂化处理后 ,大
约325条基因表达增加 ,有 18条基因是预期响应 ,
但许多新确认的基因比这 18 条基因的信号更强 。
而76条基因表达下降 ,其中 21条基因已知与 DNA
损伤试剂有关[ 11] 。
3.4　分子生态机理的研究
用于大规模研究外部环境因素和内部生境条件
对植物的遗传组成及基因表达的影响 ,为分子生态
学的研究提供了新的研究手段[ 19] ,Affymetrix 公司制
备的酵母基因表达型芯片 ,包括酵母基因组开放读
码框中的 260 ,000个 25mer探针阵列。采用这种基
因芯片对不同生活环境状态下酵母细胞的基因表达
进行了研究 。他们发现 ,对于在营养丰富或贫乏的
培养基中生长的酵母 ,90%以上的酵母基因(包括结
构基因和核糖体基因等)没有明显的表达差异 。但
有36个基因在营养丰富的培养基中生长时 ,有较多
的表达 ,而另 140 个基因在营养贫乏的培养基中生
长时表达增加 。森林是世界上最大的自然资源之
一 ,但它的培育期长 ,育种困难 ,生长迅速 ,纤维素含
量高 ,木质素低的树木有很高的经济价值 ,用芯片技
术检测生态环境对树木基因表达的影响 ,加速育种 。
如Sederoff(1999)提出用反义技术用合成木质素的
相关基因进行反义寡核苷酸抑制效果观察[ 20] 。
4　现状与展望
虽然基因芯片在植物的研究中才刚刚开始 ,但
已取得了重大的成果 。模式植物拟南芥 、酵母的研
究已为其它植物的研究建立良好的模式[ 21] ,德国的
Gene-Scan GmbH 公司开发的品种已公开的有:大
豆 、玉米 、油菜 、西红柿及马铃薯等植物的基因芯片 ,
用草莓和牛蒡进行的基因表达的芯片监测是 DNA
芯片在植物生物工艺学中直接应用的例证。但随着
大量植物基因序列的确定 ,基因芯片技术更广泛地
应用到植物的各项研究中 。
利用基因芯片通过平行对比监测基因表达差异
来进行功能分析 ,有助于研究人员更好地了解植物
生长和发育的根本机理 ,快速筛查目的性状基因 ,对
每一种类型的组织 ,积累其发育阶段激素和除草剂
处理 ,遗传背景和环境条件等一系列影响因素数据 ,
将有可能了解植物众多基因。同时可将基因序列信
息和功能分析相结合 。基因芯片在植物学研究中的
应用具有重要的商业价值 ,如生物工程公司借助芯
片可快速分析转基因植物 ,从基因角度与表达形式
找出与肥力 、种籽 、产量 、环境耐受力和抗虫害的关
系 ,免除费钱耗时的大田试验 ,加快发现杀草剂 ,并
阐明其分子生态作用机理[ 22 ～ 24] 。总之 ,基因芯片将
给植物学的研究带来革命性改变 ,开辟植物学研究
的新纪元 。
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