全 文 ：植物保护学报 !"#$%&"()&%*)$"*+,*-"%! ./01! 2."2#$ 150 4155 678$ 0/90:3/.;<=,%>-=?@ABCA=./019/29/02
基金项目$ 国家质检总局项目"./0.8f.3E!./0:8f.D/#!国家%十二五&科技支撑计划"./0.WFf00W/.#
!通讯作者"F#*B"$("$,"$+GH"%I+%,+#! JKL&-$ M$-0DE:N0.E=,"L
收稿日期$ ./02 4/5 4/E
李属植物检疫性丁香疫霉和栗黑水疫霉的
三重 D@!分子检测
刘跃庭
0!.O朱林慧0O李培江0O廖O芳.O任学毅:O李关荣0!
"0=西南大学! 南方山地农业教育部工程研究中心! 重庆 2//501 .=天津出入境检验检疫局!
天津 ://2E0 :=重庆市食品药品检验所! 重庆 2/00.0#
摘要! 为建立我国禁止进境的 . 种检疫性真菌丁香疫霉 !2($),2$2).& *(./30&%和栗黑水疫霉 !=
4&9A/B).& 的同步分子检测方法!根据疫霉属的 RW+ .GF?N+!XY 和T,$R 基因分别设计通用引物丁
香疫霉和栗黑水疫霉的特异性引物!建立三重)TZ检测方法!并进行灵敏度测试和模拟带菌试验"
结果表明!可同时检测李属植物上丁香疫霉和栗黑水疫霉的特异三重 )TZ检测体系为%最佳引物
浓度组合 03[U\;03[UZ)T[\;)T[Z和 )[[\;)[[Z依次为 /9./9309/ "P!最佳退火温度为
E:p!最佳退火时间为 ./ G" 该体系扩增丁香疫霉出现 332 AH 的 RW+ .GF?条带和 E3: AH 的
N+!XY 基因特异条带!扩增栗黑水疫霉出现 332 AH的 RW+ .GF?条带和 :02 AH 的T,$R 基因特异条
带!对照菌只出现 RW+ .GF?条带#三重 )TZ反应体系检测灵敏度低于单重)TZ#模拟带菌试验可
同时扩增出 : 个片段" 表明该三重)TZ检测方法能实现丁香疫霉和栗黑水疫霉的同步特异性检
测!可有效改进李属类水果及其种苗上检疫性疫霉的快速检测"
关键词! 李属# 检疫性真菌# 丁香疫霉# 栗黑水疫霉# 三重)TZ检测
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#%-V+$G&H$-L+$G03[U\;03[UZ&%I *B+GH+,-(-,H$-L+$G)[[\;)[[Z("$!=*(./30&%&%I )T[\;)T[Z
("$!=4&9A/B).& @+$+I+G-M%+I A&G+I "% *B+RW+ .GF?! N+!XY &%I T,$R M+%+G! $+GH+,*-V+S! *"
+G*&A-GB &*$-H+CK)TZI+*+,*-"% &%I ,&$S"#*-*GG+%G-*-V-*S*+G*&%I G-L#&*-%M,&$-+$I+*+,*-"%=YB+
+G*&A-GB+I GH+,-(-,*$-H+C)TZ$+&,*-"% GSG*+L*B&*,"#I G-L#*&%+"#GSI+*+,*!=*(./30&%&%I !=
4&9A/B).& "(!.#3#*@&G&G(""@G$*B+"H*-L&H$-L+$G,"LA-%&*-"% "(03[U\;03[UZ!)T[\;)T[Z&%I
)[[\;)[[Z@&G/9.! /93! &%I 09/ "P! $+GH+,*-V+S! &%I *B+"H*-L&&%%+&-%M*+LH+$&*#$+&%I *-L+
@+$+E:p &%I ./ G! $+GH+,*-V+S=FHH-,&*-"% I+*+,*+I &% 332 AH A&%I "(RW+ .GF?&%I &E3: AH
GH+,-(-,A&%I *"*B+N+!XY M+%+-% !=*(./30&%! &%I &% 332 AH A&%I "(*B+RW+ .GF?&%I &:02 AH
GH+,-(-,A&%I "(*B+T,$R M+%+@+$+&G"I+*+,*+I -% !=4&9A/B).&! @B-+"%S&A&%I "(RW+ .GF?@&G
I+*+,*+I -% *B+,"%*$"=YB+G+%G-*-V-*S"(*B+*$-H+CK)TZ@&G"@+$*B&% *B&*"(,"%V+%*-"%&)TZ=YB+
G-L#&*+I ,&$-+$I+*+,*-"% I+*+,*+I *B+*B$++A&%IGG-L#*&%+"#GS=YB++G*&A-GB+I *$-H+CK)TZ,"#I
&,B-+V+GS%,B$"%"#G&%I GH+,-(-,I+*+,*-"% "(!=*(./30&%&%I !=4&9A/B).&! &%I *B#G,"#I A+
+(+,*-V+S#G+I *"H$"L"*+h#-,> I+*+,*-"% "(!.#3#*($#-*G&%I -*GG++I-%MG=
3"4 5.%(#$ !.#3#* h#&$&%*-%+(#%M#G !2($),2$2).& *(./30&% !=4&9A/B).& *$-H+CK)TZI+*+,*-"%
OO李属!.#3#*P=水果是我国重要水果之一!包括
甜樱桃(杏(李(桃等"王晓燕等!./00#) 近年来!由
于我国李属果品品种老化(产量低(质量差等问题
"张静茹等!.//:#!使得该属水果及种苗进口量持
续增长!而有害生物随之传入我国的风险也增大)
疫霉属!2($),2$2).& GHH=真菌是侵染李属果树的重
要病菌!据报道全世界为害李属植物的疫霉约有 0/
种"]-,"C`a-$,+*-,B!0D31& A\€-CKR&G*€#L`
a-$,+*-,B!.//1#!其中丁香疫霉 !=*(./30&%"王英超
等!./00#和栗黑水疫霉 !=4&9A/B).&"封立平等!
./00#侵染引起的疫病是毁灭性的!为我国禁止进
境的植物检疫性真菌) ./00 年天津检验检疫局在
美国脐橙上检测出丁香疫霉!系我国首次截获"罗
加凤等!./0.#!./0: 年又在以色列葡萄柚上再次截
获丁香疫霉!为防止其传入我国!快速而准确的检测
鉴定尤为必要)
疫霉属常多种病菌复合侵染同株果树!可造成
果树果腐(根腐(树干基部的脚腐"T"$I-+$+*&=!
0DDE\€-CKR&G*€#L`a-$,+*-,B!.//1王英超等!
./00#等多种病害) 栗黑水疫霉(大雄疫霉 !=9%7
0&*,%.9&和掘氏疫霉 !=-.%42*"%./混合侵染樱桃树
可致其停止生长!出现植株矮化(黄萎(落叶和枝干
坏死等病症!最终导致整株死亡!0D5E 年美国加利
福尼亚出现此病害!樱桃树发病率达 31e!造成严
重损失"a-$,+*-,B +*&=!0D5E#) 大量而频繁引进李
属水果及其种苗!增大了检疫性李属疫霉传入我国
的风险!对我国水果产业构成严重威胁!因此急需建
立李属果树及其种苗上检疫性疫霉的检测技术和
方法)
目前疫霉菌的常规检疫方法主要依据病原菌的
形态特征(生物学特性等差异鉴定!而传统的形态学
鉴定方法周期长!步骤繁琐"吴品珊等!./0/王英
超等!./00#!已不能满足口岸快速检测的要求) 近
年来国内外用于快速检测疫霉的主要方法有 )TZ(
多重)TZ(Z+&K*-L+)TZ等!其中多重 )TZ以其特
异性强(成本低(快捷等优点!可实现对多种菌的同
步检测!节约了时间和成本!成为口岸快速检测技术
的重要研究方向) 目前!多重)TZ已被应用于疫霉
菌检测!P-+*&="./00#根据烟草疫霉 !=3/4)$/&3&%
的DH+基因和恶疫霉 !=4&4$).#9的 T,$R 基因分别
设计其特异性引物!建立了草莓上烟草疫霉和恶疫
霉的三重)TZ检测方法) 但尚未见同时检测李属
植物上丁香疫霉和栗黑水疫霉的相关报道) 因此!
本研究以丁香疫霉和栗黑水疫霉 . 种检疫性真菌为
对象!通过疫霉 RW+ .GF?(N+!XY 和 T,$R 基因序列
分别设计了疫霉属通用引物(丁香疫霉和栗黑水疫
霉的特异性引物!并结合 )TZ技术!以期建立李属
植物上丁香疫霉和栗黑水疫霉的三重 )TZ检测方
法!为我国口岸李属水果及其种苗快速(准确(灵敏
的检测提供技术支持)
6 材料与方法
686 材料
供试菌株$本研究所用的 0. 株供试菌株$. 株
丁香疫霉 FYTT:2//. 和 P-(./0.K2. 株栗黑水疫霉
FYTT:E..3 和FYTT:3300另外 3 株为丁香疫霉和
栗黑水疫霉的近似种"表 0#)
供试甜樱桃$品种为红灯 !.#3#*&B/#9P=,V=
X"%MI+%M!产地为山东烟台)
OO引物设计$比对R+%W&%>公布的李属 0/ 种疫霉
菌的 RW+ .GF?基因序列!在其保守区设计疫霉属的
通用引物 03[U\;03[UZ以樟疫霉 !=4/33&9)9/
N+!XY 基因"JU/5D5E/#设计引物 X[)\;X[)Z!用
于扩增供试材料的N+!XY 基因!根据其N+!XY 基因
序列差异设计丁香疫霉的特异性引物 )[[\;)[[Z
以棕榈疫霉 !=,&"9/B).& 的 T,$R 基因"Xd31//00#
设计引物 cH*\;cH*Z!用于扩增供试材料的 T,$R 基
因序列!根据其T,$R 基因序列差异设计栗黑水疫霉
的特异性引物 )T[\;)T[Z"表 .#!引物设计采用
)$-L+$)$+L-+$19/ 软件!由上海英骏生物技术有限
公司合成)
试剂及仪器$ )TZ缓冲液(H&M6bF聚合酶(
IbY)等购自宝生物工程"大连#有限公司6bF提
取试剂盒 6b+&GS)&%*a-%-f-*购自美国 d8FRJb
公司) YH$"(+GG-"%&梯度 )TZ仪!德国 ]B&*L&% W-K
"L+*$&公司8%(-%-*SK:/.E 凝胶成像系统!法国g8PWJZ
.51 植O物O保O护O学O报 2. 卷
OOO 表 6 供试菌株代码#种类#寄主#收集年份及产地
Y&A+0 YB+,"I+G! GH+,-+G! B"G*G! S+&$G&%I &$+&G"(G*$&-%G#G+I -% *B-GG*#IS
序号
b"=
代码
T"I+
种类
[H+,-+G
寄主
X"G*
收集年份
c+&$
产地
F$+&
0
.
:
2
1
E
5
3
D
0/
00
0.
FYTT:2//.
P<(./0.K2
FYTT:E..3
FYTT:3300
FYTT:.DDE
P<(./00KD
FTTT:5:3/
FTTT:E.32
FTTT:E.3.
TW[.D.9:1
TW[002/3D
TW[0.2EDE
丁香疫霉!=*(./30&%
丁香疫霉!=*(./30&%
栗黑水疫霉!=4&9A/B).&
栗黑水疫霉!=4&9A/B).&
大雄疫霉!=9%0&*,%.9&
柑橘褐腐疫霉!=4/$.),2$2).&
隐地疫霉!=4.(,$)0%&
樟疫霉!=4/33&9)9/
柑橘生疫霉!=4/$./4)"&
掘氏疫霉!=-.%42*"%./
恶疫霉!=4&4$).#9
!=.)*&4%&.#9
柠檬 1/$.#*"/9)3
脐橙 1/$.#*,&.&-/*/
欧洲苹果 ;&"#**("B%*$./*
苹果 ;&"#*,#9/"&
苜蓿 ;%-/4&0)*&$/B&
柑橘 1/$.#*.%$/4#"&$%
橡树 N%B%& A.&*/"/%3*/*
香兰草 S&3/"& <.&0.&3*
柑橘 1/$.#*GH=
甜菜 5%$& B#"0&./*
苹果 ;&"#*,#9/"&
苹果 ;&"#*,#9/"&
./0:
./0:
./0:
./0:
./0:
./0:
./0:
./0:
./0:
./0:
./0:
./0:
美国U[F
以色列8G$&+
澳大利亚F#G*$&-&
日本!&H&%
美国U[F
澳大利亚F#G*$&-&
中国TB-%&
中国TB-%&
中国TB-%&
美国U[F
美国U[F
美国U[F
表 7 本研究使用的引物序列及其参数
Y&A+. )$-L+$G#G+I -% *B-GG*#IS&%I *B+H&$&L+*+$G
扩增基因
R+%+
引物O
)$-L+$O
序列 1mK:m
[+h#+%,+1mK:m
长度 "%*#
P+%M*B
退火温度 "p#
YL
预期产物大小 "AH#
JCH+,*+I G-?+
RW+ .GF? 03[U03[UZ
TRTRRYFFYYTTFRTYTTFFYFFRF
FTFYTYFFRRRTFYTFTFRFTT
..
.1
E: 33.
N+!XY X[)X[)Z
RYRFFRFFRTFTYTRRFRYY
TTYYTYYTYYRFRTYYTYTFFYR
./
.:
E: 3D/
)[[)[[Z
FRRFRRFFRRTRFRFFRRTT
RYFRYFRFYRTTRRRTYRTR
./
./
E: E3:
T,$R cH*cH*Z
YTRRYRYRRFTYYYRYRFRYR
FTRYYTYTRTFRRTRYFYTY
.0
./
E/ 25/
)T[)T[Z
TFFRTYTTFRFYYRYRTRYR
TRFFYTFFFRTRRYTTFFTT
./
./
E2 :02
P7UZaFY公司岛津 UVL-%-K0.2/ 紫外分光光度
计!日本岛津公司)
687 方法
68786 菌丝6bF提取扩增测序及引物的验证
将供试菌培养(收集菌丝!按照 6bF提取试剂
盒提取菌丝 6bF!并将菌丝 6bF溶于 0// "P0 u
YJ缓冲液中!其余菌丝 6bF置于 45/p保存) 对
0. 株菌株菌丝基因组 6bF进行通用引物 03[U\;
03[UZ扩增!反应体系为 :/ "P$0/ u)TZW#(+$:9/
"P"含终浓度为 091 LL";PaMT. #(.91 LL";P
IbY)G.9/ "P(0/ "L";P引物 03[U\;03[UZ各
/9. "P(1 U;"PH&M6bF聚合酶 /9: "P(6bF模板
09/ "P"约为 ./ %M#(加 IIX.7至 :/ "P!以 IIX.7
为模板作为阴性对照) 反应程序$D2p预变性 2
L-%D2p变性 :/ G!E:p复性 ./ G!5.p延伸 21 G!:1
个循环5.p延伸 5 L-%) .e琼脂糖凝胶电泳!溴乙
锭染色并成像观察!对各产物进行测序和序列比对
分析)
对 0. 株菌株菌丝基因组6bF进行引物X[)\;
X[)Z及 cH*\;cH*Z的扩增!反应体系中除引物浓
度各为 09/ "P外!其余参数同上反应程序除退火
温度不同外其余条件均相同!5.p延伸 5 L-%) .e
琼脂糖凝胶电泳!溴乙锭染色及成像观察!对各产物
进行测序和序列比对分析!并设计各自的特异性引
物) 对 0. 株菌株菌丝基因组6bF进行特异性引物
)[[\;)[[Z及)T[\;)T[Z的扩增!反应体系与反应
程序均同 X[)\;X[)Z引物扩增) .e琼脂糖凝胶
电泳!溴乙锭染色及成像观察)
68787 三重)TZ扩增体系的优化
在其它因素保持不变的条件下!对通用引物浓
度(特异性引物浓度(退火温度(退火时间 2 方面进
行优化) 通用引物 03[U\;03[UZ扩增效率较高!设
置其优化范围为 /90 /^9E "P!梯度为 /90 "P0/
"L";P特异性引物 )T[\;)T[Z和 )[[\;)[[Z优
化范围均为 /9. 0^9. "P!梯度为 /9. "P退火温度
优化范围为 E/ E^1p!梯度为 0p退火时间进行优
:512 期 刘跃庭等$ 李属植物检疫性丁香疫霉和栗黑水疫霉的三重)TZ分子检测
化范围为 1 :^/ G!梯度为 1 G)
68789 菌丝基因组6bF三重)TZ检测方法的建立
利用通用引物 03[U\;03[UZ和 . 对特异性引
物)[[\;)[[Z()T[\;)T[Z扩增 0. 株菌株菌丝基
因组6bF!采用上述优化结果建立的扩增体系为 ./
"P$0/ uW#(+$.9/ "P"含终浓度为 091 LL";P的
aMT.#( .91 LL";PIbY)G.9/ "P( 1 U;"PH&M
6bF聚合酶 /92 "P(0/ "L";P引物 03[U\;03[UZ
")T[\;)T[Z和 )[[\;)[[Z#各 /9. "P"/93 "P和
09/ "P#(6bF模板 09/ "P(加 IIX.7至 ./ "P!以
丁香疫霉 "FYTT:2//. # 和栗黑水疫霉 "FYTTK
:E..3#混合6bF的三重 )TZ扩增为阳性对照!以
IIX.7为模板作阴性对照) 反应程序$D2p预变性
2 L-%D2p变性 :/ G!E:p复性 ./ G!5.p延伸 :1 G!
:1 个循环5.p延伸 5 L-%!.e琼脂糖凝胶电泳!溴
乙锭染色及成像观察目的条带)
6878; 三重)TZ检测灵敏度测试
将丁香疫霉和栗黑水疫霉菌丝基因组 6bF用
紫外分光光度计进行核酸浓度测定!定量 ./ %M;"P
作为初始浓度!再进行 0/ 倍梯度稀释!共设置 E 个
浓度梯度!作为)TZ扩增模板) 分别以不同浓度的
6bF为模板进行单重 )TZ和三重 )TZ反应!阴性
对照用 IIX.7代替模板 6bF) 单重)TZ反应体系
和程序同 09.9. 特异性引物 )[[\;)[[Z及 )T[\;
)T[Z扩增!三重 )TZ反应体系和程序同 09.9:!扩
增结束后经 .e琼脂糖凝胶电泳!溴乙锭染色并观
察是否出现特定大小的目的条带)
6878< 模拟带菌检测
将 0. 株疫霉菌菌丝"每种菌约 0 LM#与新鲜的
甜樱桃组织"约 ./ LM#混合提取 6bF!将提取的
6bF进行三重)TZ扩增!扩增体系及循环参数设置
同三重 )TZ扩增体系!以 IIX.7为阴性对照) .e
琼脂糖凝胶电泳!溴乙锭染色并观察特定目的大小
条带的有无)
7 结果与分析
786 引物的扩增及特异性引物的设计
通用引物 03[U\;03[UZ对 0. 株菌株菌丝基因
组6bF扩增!所有菌株均出现相同大小的目的条
带!经测序得到 RW+ .GF?区域扩增片段 332 AH) 引
物cH*\;cH*Z扩增得到大小约为 25/ AH 的片段!不
同种菌株之间大小存在差异!经 WPF[Y分析均为
T,$R 基因!且比对结果表明T,$R 基因能够提供足够
丰富的差异位点!据此设计栗黑水疫霉的特异性引
物)T[\;)T[Z) 引物X[)\;X[)Z扩增得到大小约
为 3D/ AH 的片段!根据差异位点设计丁香疫霉的特
异性引物 )[[Z;)[[Z) 经验证这 . 对特异性引物
的特异性均良好"图 0#)
图 6 丁香疫霉和栗黑水疫霉的通用引物
及特异性引物扩增结果
\-M=0 YB+&LH-(-,&*-"% "(!2($),2$2).& *(./30&%&%I
!2($),2$2).& 4&9A/B).& AS#G-%M*B+#%-V+$G&H$-L+$G
&%I GH+,-(-,H$-L+$G
a$ 6P./// AH L&$>+$ 0 0^.$丁香疫霉(丁香疫霉(
栗黑水疫霉(栗黑水疫霉(大雄疫霉(柑橘褐腐疫霉(隐
地疫霉(樟疫霉(柑橘生疫霉(掘氏疫霉(恶疫霉(!=.)*&7
4%&.#9 b$ 阴性对照 IIX.7) a$ 6P./// AH L&$>+$
0 40.$ !=*(./30&%! !=*(./30&%! !=4&9A/B).&! !=4&9A/B7
).&! !=9%0&*,%.9&! !=4/$.),2$2).&! !=4.(,$)0%&! !=
4/33&9)9/! !=4/$./4)"&! !=-.%42*"%./! !=4&4$).#9! !=
.)*&4%&.#9 b$ %+M&*-V+,"%*$""IIX.7#=
O
787 菌丝基因组ZX1三重D@!检测体系的建立
经过多次条件优化!确定最佳引物浓度组合
03[U\;03[UZ()T[\;)T[Z和 )[[\;)[[Z依次为
/9.(/93(09/ "P!最佳退火温度为 E:p!最佳退火
时间为 ./ G!建立了李属植物上丁香疫霉和栗黑水
疫霉的三重)TZ检测体系)
丁香 疫 霉 " FYTT:2//. # 和 栗 黑 水 疫 霉
"FYTT:E..3#混合 6bF的三重 )TZ扩增产生 RW+
.GF?区域 332 AH 的片段(N+!XY 区域 E3: AH 的特
异片段和T,$R 区域 :02 AH的特异片段丁香疫霉的
. 株菌株 FYTT:2//. 和 P<(./0.K2 三重 )TZ产生
RW+ .GF?区域 332 AH 的片段和N+!XY 区域 E3: AH
的特异片段栗黑水疫霉的 . 株菌株 FYTT:E..3 和
FYTT:3300 三重 )TZ扩增产生 RW+ .GF?区域 332
AH的片段和 T,$R 区域 :02 AH 的特异片段其它 3
251 植O物O保O护O学O报 2. 卷
株疫霉菌病菌三重)TZ扩增只产生 RW+ .GF?区域
332 AH条带!无丁香疫霉和栗黑水疫霉特异性引物
扩增片段阴性对照无以上条带) 表明通过 .e琼
脂糖凝胶电泳能够明确区分丁香疫霉和栗黑水疫霉
以及李属植物的其它疫霉菌病害"图 .#)
图 7 李属植物疫霉菌丝基因组ZX1三重D@!
扩增结果
\-M=. YB+*$-H+CK)TZ&LH-(-,&*-"% "(LS,+-&M+%"L-,
6bFG"(!.#3#*,2($),2$2).& "% !.#3#*H&%*G
)$ 阳性对照 0 0^.$ 丁香疫霉(丁香疫霉(栗黑水
疫霉(栗黑水疫霉(大雄疫霉(柑橘褐腐疫霉(隐地疫霉(
樟疫霉(柑橘生疫霉(掘氏疫霉(恶疫霉(!=.)*&4%&.#9
b$ 阴性对照 IIX.7 a$ 6P./// AH L&$>+$) )$ )"G-*-V+
,"%*$" 0 40.$ !=*(./30&%! !=*(./30&%! !=4&9A/B).&!
!=4&9A/B).&! !=9%0&*,%.9&! !=4/$.),2$2).&! !=4.(,$)7
0%&! !=4/33&9)9/! !=4/$./4)"&! !=-.%42*"%./! !=4&4$)7
.#9! !=.)*&4%&.#9 b$ %+M&*-V+,"%*$"" IIX.7# a$
6P./// AH L&$>+$=
O
789 三重D@!灵敏度检测
单重)TZ反应灵敏度检测中丁香疫霉灵敏度
达 /9. %M;"P!栗黑水疫霉灵敏度可达 . HM;"P"图
:#) 三重 )TZ反应灵敏度检测中!引物 03[U\;
03[UZ扩增丁香疫霉和栗黑水疫霉模板低限浓度
均为 . HM;"P!)[[\;)[[Z扩增丁香疫霉模板低限
浓度为 . %M;"P!)T[\;)T[Z扩增栗黑水疫霉模板
低限浓度为 /9. %M;"P!与单重)TZ相比!丁香疫霉
和栗黑水疫霉特异性扩增灵敏度均有所降低)
78; 模拟带菌检测
6bF样品经 :1 个循环的三重 )TZ扩增!0. 株
疫霉菌与甜樱桃混合 6bF三重 )TZ均产生 RW+
.GF?区域 332 AH 的扩增片段(N+!XY 区域 E3: AH
的特异片段和T,$R 区域 :02 AH的特异片段"图 2#!
阴性对照则无相应目的片段)
9 讨论
在以)TZ方法为基础的病原菌检测中!靶基因
的选择对)TZ的特异性非常重要) $6bF的 8Y[ 区
域具有在真菌种间变异度高(在种内稳定性好等特
图 9 丁香疫霉和栗黑水疫霉D@!扩增产物的
灵敏度检测电泳图谱
\-M=: J+,*$"HB"$+G-GH&*+$% "(G+%G-*-V-*SI+*+,*-"% "(
*$-H+CK)TZH$"I#,*G"(*B+G*$&-%G!2($),2$2).& *(./30&%
&%I !2($),2$2).& 4&9A/B).&
F W^$ 丁香疫霉(栗黑水疫霉单重 )TZ灵敏度
T 6^$ 丁香疫霉(栗黑水疫霉三重 )TZ灵敏度 a$ 6P
./// AH L&$>+$ 0 E^$ 模板量分别为 ./(.(. u0/ 40 (. u
0/ 4.(. u0/ 4:(. u0/ 42 %M b$ 阴性对照 IIX.7) F4W$
YB+G+%G-*-V-*S"(,"%V+%*-"%&)TZ T46$ *B+G+%G-*-V-*S
"(*$-H+CK)TZ a$ 6P./// AH L&$>+$ 0 4E$ 6bF&K
L"#%*G&$+./! .! . u0/ 40! . u0/ 4. ! . u0/ 4: ! &%I . u
0/ 42 %M! $+GH+,*-V+S b$ %+M&*-V+,"%*$"=
O
图 ; 混合ZX1三重D@!扩增产物的模拟带菌检测
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V&$-"#G!2($),2$2).& &%I !.#3#*&B/#9G*$&-%G
AS*B+*$-H+CK)TZ
b$ 阴性对照 IIX.7 0$ 0. 株疫霉菌与甜樱桃混合
6bF a$6P./// AH L&$>+$)b$b+M&*-V+,"%*$" 0$L-C
6bF a$ 6P./// AH L&$>+$=
O
点!是病原菌分子检测理想的靶序列!以8Y[ 序列分
析为基础!已成功开发了多种疫霉的分子检测引物
"W"%&%*G+*&=!0DD5P&,"#$*+*&=!0DD5_B&%M+*
&=!.//E#) 张雪等"./0.#针对丁香疫霉(冬生疫霉
!=2/A%.3&"/*和大豆疫霉!=*)I&%的DH+基因建立了
多重)TZ检测体系P&%M$++*&="./00#根据樟疫
1512 期 刘跃庭等$ 李属植物检疫性丁香疫霉和栗黑水疫霉的三重)TZ分子检测
霉和栗黑水疫霉的 DH+ 基因建立了多重 )TZ检测
体系8HH"-*"+*&=".//.#根据烟草疫霉 !=3/4)$/7
&3&%和柑橘褐腐疫霉 !=4/$.),2$2).& 的 DH+ 基因设
计引物!建立)TZ检测方法) 目前针对疫霉检测的
多重 )TZ检测体系!大多扩增 6bF模板的同一区
域!且主要为8Y[ 区域!使用同一基因多重扩增时!
由于引物间的竞争配对!出现非特异扩增!特异性下
降) 本研究通过对 RW+ .GF?(N+!XY(T,$R 基因序列
进行比对分析!发现 RW+ .GF?基因序列的相似性为
DDe!丁香疫霉N+!XY 基因序列与其它疫霉的相似
性在 D1e以下!栗黑水疫霉T,$R 基因序列与其它疫
霉的相似性为 D:e!最终选定以 RW+ .GF?设计疫
霉属通用引物!以N+!XY 和T,$R 这 . 个基因分别设
计丁香疫霉和栗黑水疫霉的特异性引物)
影响多重)TZ反应体系的因素很多"X+%+M&$-#
+*&=!0DD5#!本研究选择从通用引物浓度(特异性
引物浓度(退火温度(退火时间 2 个方面进行优化)
引物是多重)TZ反应的关键!RW+ .LF?基因为多拷
贝基因!而T,$R 基因为单拷贝基因"TB+% `Z"CAS!
0DDE#!引物对 03[U\;03[UZ的扩增效率高于
)T[\;)T[Z!同理 03[U\;03[UZ的扩增效率也高于
)[[\;)[[Z!所以引物对 03[U\;03[UZ用量少丁
香疫霉特异性引物 )[[\;)[[Z和栗黑水疫霉特异
性引物)T[\;)T[Z特异性良好!二者可扩增不同的
基因片段引物量的比例对扩增结果影响很大!可调
节引物比例以达最佳化) 退火温度影响 )TZ体系
扩增的特异性!在多重 )TZ体系中!综合各个解链
温度YL!在 YL值允许范围内!选择较高的复性温
度以减少引物和模板间的非特异性结合!确保 )TZ
反应的特异性"陈明洁等!.//1#) 退火时间决定了
解链是否完全!多重 )TZ反应中有多对引物!退火
时间要根据引物的扩增效率而定!退火时间不宜过
短!否则解链不完全!也不宜过长!否则引物对间的
竞争导致扩增效率较低的引物反应不充分) 基于
此!本试验确定的最佳引物浓度组合 03[U\;
03[UZ()T[\;)T[Z和)[[\;)[[Z依次为 /9.(/93(
09/ "P!最佳退火温度为 E:p!最佳退火时间为 ./
G!建立了李属植物上丁香疫霉和栗黑水疫霉的三重
)TZ检测方法但此多重)TZ体系的灵敏性与单重
)TZ相比有所降低!分析原因可能为多重)TZ在反
应体系中加入了多对引物!而引物彼此间会形成引
物二聚体或错配!并且可能会发生引物和非模板间
的非特异性结合!导致引物的利用率降低!灵敏度下
降"王慧等!./00#)
本研究建立了李属植物上检疫性真菌丁香疫霉
和栗黑水疫霉的三重)TZ同步分子检测方法!该方
法试验材料包括可以侵染李属植株的 0/ 种疫霉!菌
株收集较为齐全!: 对引物扩增片段大小差异大!便
于琼脂糖凝胶电泳观察) 模拟带菌试验可实现对带
菌水果的直接检测!全部检测可在 0 I 内完成!可有
效促进进境水果的快速通关!为检疫性病原菌的口
岸检测和田间监测提供了可靠方法)
参 考 文 献 "Z+(+$+%,+G#
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中国标准出版社,
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TB-%&FM$-,#*#$&[,-+%,+&%I Y+,B%""MS)$+GG! HH=1/ 410
"-% TB-%+G+# +张雪! 章桂明! 周德群! 程颖慧! 王颖! 陈明
爱=./0.=多重)TZK6X)PT检测三种检疫性疫霉研究=;;
郭泽建! 李宝笃=中国植物病理学会 ./0. 年学术年会论文
集=北京$ 中国农业科学技术出版社! HH=1/ 410,
_B&%M_R! P-cd! \&% X! ]&%McT! _B+%MQW=.//E=a"+,#&$
I+*+,*-"% "(!2($),2$2).& 4&,*/4/-% -%(+,*+I H&%**-GG#+G! G"-
&%I @&*+$=)&%*)&*B""MS! 11"E#$ 55/ 4551
$责任编辑%李美娟&
5512 期 刘跃庭等$ 李属植物检疫性丁香疫霉和栗黑水疫霉的三重)TZ分子检测