全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１６， ４３（２）： ２５５ － ２５９ ＤＯＩ： １０ １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１６ ０２ ０１１
基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（２０１２０３０７６⁃０１），中央高校基本科研业务费（ＸＤＪＫ２０１５Ａ００９）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｚｈｏｕｃｙ＠ ｃｒｉｃ． ｃｎ
收稿日期： ２０１４ － １０ － ０８
柑橘黄化脉明病毒巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测方法
的建立及应用
周 彦１ 陈洪明１ 王雪峰１ 李中安１ 王 亮２ 周常勇１∗
（１．西南大学柑橘研究所， 重庆 ４００７１２； ２．四川省安岳县柠檬科学技术研究所， 安岳 ６４２３００）
摘要： 为探索柑橘黄化脉明病毒（Ｃｉｔｒｕｓ ｙｅｌｌｏｗ ｖｅｉｎ ｃｌｅａｒｉｎｇ ｖｉｒｕｓ，ＣＹＶＣＶ）引起的柑橘新病害—柑橘
黄脉病的早期快速检测技术，针对 ＣＹＶＣＶ核酸结合蛋白基因的保守序列设计 ２ 对特异性引物，通
过优化退火温度，建立了 ＣＹＶＣＶ巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ 检测方法，并对采自不同柑橘品种的 ５４ 个 ＣＹＶＣＶ
疑似样品进行了检测。 结果表明，ＣＹＶＣＶ巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测中，以 ５５℃和 ６０℃分别作为第 １ 轮和
第 ２ 轮扩增的退火温度时检测效果最佳；该方法检测样品中病毒总核酸的最低浓度为 ２ ４０ μｇ ／ Ｌ，
灵敏度较 ＲＴ⁃ＰＣＲ提高 １００ 倍。 在 ＣＹＶＣＶ疑似样品检测中，巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ和 ＲＴ⁃ＰＣＲ的阳性检出
率分别为 ５９ ２６％和 ５７ ４１％ ，前者更适用于检测不同来源的 ＣＹＶＣＶ。 当尤力克柠檬、锦橙北碚⁃
４４７、天草和台湾椪柑嫁接接种 ＣＹＶＣＶ后，巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ比 ＲＴ⁃ＰＣＲ提前 １０ ～ ３０ ｄ检测出病毒。 表
明所建立的 ＣＹＶＣＶ巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测方法适用于田间病树的早期诊断。
关键词： 柑橘黄化脉明病毒； 巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ； 检测
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ⁃ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｃｉｔｒｕｓ ｙｅｌｌｏｗ ｖｅｉｎ ｃｌｅａｒｉｎｇ ｖｉｒｕｓ
Ｚｈｏｕ Ｙａｎ１ Ｃｈｅｎ Ｈｏｎｇｍｉｎｇ１ Ｗａｎｇ Ｘｕｅｆｅｎｇ１ Ｌｉ Ｚｈｏｎｇａｎ１ Ｗａｎｇ Ｌｉａｎｇ２ Ｚｈｏｕ Ｃｈａｎｇｙｏｎｇ１∗
（１． Ｃｉｔｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４００７１２， Ｃｈｉｎａ；
２． Ｌｅｍｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｙｕｅ Ｃｏｕｎｔｙ， Ａｎｙｕｅ ６４２３００， Ｓｉｃｈｕａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｙｅｌｌｏｗ ｖｅｉｎ ｃｌｅａｒｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｃｉｔｒｕｓ ｙｅｌｌｏｗ ｖｅｉｎ ｃｌｅａｒｉｎｇ ｖｉｒｕｓ （ ＣＹＶＣＶ） ｉｓ ａｎ
ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ． Ｔｏ ｒｅｓｏｌｖｅ ｔｈｅ ｄｅｆｅｃｔ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｉｓｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ ｔｏ
ｄｅｔｅｃｔ ＣＹＶＣＶ ａｔ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ， ｔｗｏ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｗｉｔｈｉｎ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ， ａｎｄ ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ⁃ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＣＹＶＣＶ
ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ５５℃ ａｎｄ ６０℃ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｔｏ ｔｈｅ
ｆｉｒｓｔ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ａｎｄ ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ⁃ＰＣＲ ｈａｄ ａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ２ ４０ μｇ ／ Ｌ ｏｆ
ｔｏｔａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ １００⁃ｆｏｌｄ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ＲＴ⁃ＰＣＲ． Ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ５４ ＣＹＶＣＶ⁃
ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ， ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ⁃ＰＣＲ ａｎｄ ＲＴ⁃ＰＣＲ ｗｅｒｅ ５９ ２６％ ａｎｄ
５７ ４１％ ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ⁃ＰＣＲ ｃｏｕｌｄ ｄｅｔｅｃｔ ＣＹＶＣＶ ｍｏｒｅ
ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｃｉｔｒｕｓ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ． Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ， ａｆｔｅｒ ＣＹＶＣＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｇｒａｆｔ⁃ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｏｎ Ｅｕｒｅｋａ
ｌｅｍｏｎ， Ｊｉｎｃｈｅｎｇ Ｂｅｉｂｅｉ⁃４４７， Ａｍａｋｕｓａ ａｎｄ Ｔａｉｗａｎ ｐｏｎｋａｎ， ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ １０ ｔｏ ３０ ｄａｙｓ ｅａｒｌｉｅｒ ｂｙ
ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ⁃ＰＣＲ ｔｈａｎ ＲＴ⁃ＰＣＲ． Ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ⁃ＰＣＲ ｉｓ ａ ｖａｌｕａｂｌｅ ｔｏｏｌ
ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＹＶＣＶ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｉｔｒｕｓ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｉｔｒｕｓ ｙｅｌｌｏｗ ｖｅｉｎ ｃｌｅａｒｉｎｇ ｖｉｒｕｓ （ＣＹＶＣＶ）； ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ⁃ＰＣＲ； ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
柑橘黄脉病是由柑橘黄化脉明病毒 （ Ｃｉｔｒｕｓ
ｙｅｌｌｏｗ ｖｅｉｎ ｃｌｅａｒｉｎｇ ｖｉｒｕｓ，ＣＹＶＣＶ）引起的一种新的柑
橘病害。 该病最早发现于巴基斯坦（Ｃａｔａｒａ ｅｔ ａｌ． ，
１９９３；Ｇｒｉｍａｌｄｉ ＆ Ｃａｔａｒａ，１９９６），随后在印度（Ａｌｓｈａ⁃
ｍｉ ｅｔ ａｌ． ，２００３）、土耳其（Öｎｅｌｇｅ ｅｔ ａｌ． ，２０１１）、中国
等国家相继被报道（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． ，２０１４）。 该病能够
危害大多数柑橘种类，其中柠檬和酸橙对此病最为
敏感，甜橙较为耐病，宽皮柑橘、葡萄柚、香橼和墨西
哥莱檬等最为耐病（Ｃａｔａｒａ ｅｔ ａｌ． ，１９９３；Ｇｒｉｍａｌｄｉ ＆
Ｃａｔａｒａ，１９９６；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． ，２０１４）。 植株感染此病后
叶脉黄化、透明，叶片脱落，产量降低，甚至绝收
（Ｃａｔａｒａ ｅｔ ａｌ． ，１９９３；Öｎｅｌｇｅ ｅｔ ａｌ． ，２０１０）。 目前该病
已对我国柑橘产业，尤其是柠檬生产造成了严重损
失，且发生范围逐渐扩大（周常勇等，２０１３；陈洪明
等，２０１５）。
ＣＹＶＣＶ为柑橘病毒属 Ｍａｎｄａｒｉｖｉｒｕｓ 成员，病毒
粒子呈弯曲线状，大小约为 ６７０ ～ ７００ ｎｍ × １３ ～ １４
ｎｍ。 ＣＹＶＣＶ基因组含有 ７ ５２９ 个核苷酸，可能包含
有 ６ 个开放阅读框 （ Ｌｏｃｏｎｓｏｌｅ ｅｔ ａｌ． ， ２０１２ ）。
ＣＹＶＣＶ除可以通过嫁接传播外，还能通过豆蚜 Ａ⁃
ｐｈｉｓ ｃｒａｃｃｉｖｏｒａ Ｋｏｃｈ 和绣线菊蚜 Ａ． ｓｐｉｒａｅｃｏｌａ Ｐａｔｃｈ
在柠檬和菜豆间进行传播（Öｎｅｌｇｅ ｅｔ ａｌ． ，２０１１），因
此，豇豆、菜豆、辣椒、藜麦等也是柑橘黄脉病的草本
寄主（Ｇｒｉｍａｌｄｉ ＆ Ｃａｔａｒａ，１９９６；Öｎｅｌｇｅ ｅｔ ａｌ． ，２０１１；
Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． ，２０１４）。 但目前尚不清楚 ＣＹＶＣＶ 是通
过何种媒介昆虫在柑橘间进行传播，通过防治媒介
昆虫来防控柑橘黄脉病尚不可行。
柑橘黄脉病是我国新生病害，目前尚缺乏有效
防治该病的药剂，因此种植无病毒苗木和加强病毒
检测成为防治该病的重要途径，建立快速、灵敏的病
毒检测技术是当前柑橘黄脉病防治的首要任务。
ＣＹＶＣＶ的检测鉴定通常以柠檬和酸橙作为指示植
物，但检测周期长，需 ２ ～ ３ 个月，且需要进行隔离处
理（Ｃａｔａｒａ ｅｔ ａｌ． ，１９９３）。 Ｃａｔａｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９３）曾通过
电镜技术检测 ＣＹＶＣＶ，但操作较为繁琐，且仅适用
于部分柑橘品种的检测。 近年来，Ａｌｓｈａｍｉ ｅｔ ａｌ．
（２００３）和 Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （２０１４）相继建立的血清学和
ＲＴ⁃ＰＣＲ检测方法，缩短了 ＣＹＶＣＶ 的检测时间。 但
对大量 ＣＹＶＣＶ 疑似样品进行检测时，这些方法在
灵敏度和检测范围上存在不足。 因此，本研究通过
建立 ＣＹＶＣＶ的巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测方法，以期进一步
提高检测范围和准确性，以满足当前柑橘生产中
ＣＹＶＣＶ快速检测的需要。
１ 材料与方法
１ １ 材料
供试毒源及植物样品：感染了 ＣＹＶＣＶ、柑橘衰
退病毒 （Ｃｉｔｒｕｓ ｔｒｉｓｔｅｚａ ｖｉｒｕｓ，ＣＴＶ）、柑橘碎叶病毒
（Ｃｉｔｒｕｓ ｔａｔｔｅｒ ｌｅａｆ ｖｉｒｕｓ，ＣＴＬＶ）、柑橘裂皮病类病毒
（Ｃｉｔｒｕｓ ｅｘｏｃｏｒｔｉｓ ｖｉｒｏｉｄ，ＣＥＶｄ）、温州蜜柑萎缩病毒
（Ｓａｔｓｕｍａ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ，ＳＤＶ）、柑橘鳞皮病病毒（Ｃｉｔｒｕｓ
ｐｓｏｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ， ＣＰＶ）、柑橘黄龙病 （ ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ，
ＨＬＢ）的病株，２ 年生无病毒尤力克柠檬 Ｃｉｔｒｕｓ ｌｉ⁃
ｍｏｎ、锦橙 Ｃ． ｓｉｎｅｎｓｉｓ 北碚⁃４４７、天草Ｃ． ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ ×
Ｃ． ｓｉｎｅｎｓｉｓ 和台湾椪柑 Ｃ． ｐｏｏｎｅｎｓｉｓ 实生苗，以及
柑橘溃疡病的总核酸提取物均由西南大学柑橘研
究所脱毒中心提供。 所有植物分别置于不同的
２０ ～ ２５℃隔离温室中生长备用。 供试 ５４ 份疑似
样品采自四川、重庆、云南、江西、湖南、福建等地
的甜橙、柚、宽皮柑橘、杂柑、柠檬、葡萄柚和枳类
等柑橘上。
引物：根据 ＧｅｎＢａｎｋ 中 ＣＹＶＣＶ 土耳其分离株
Ｙ１（ＪＸ０４０６３５ １）的基因组序列，针对其 ３′端保守的
核酸结合蛋白基因运用 Ｏｌｉｇｏ ６ ０ 生物学软件设计 ２
对引物。 其中外巢引物中上游引物为 ＣＹＶＣＶ⁃１ｆ：
５′⁃ＡＴＣＡＴＧＡＧＴＴＣＣＡＴＡＣＣＡＣＴＣＧＡＧ⁃３′，下游引物
为 ＣＹＶＣＶ⁃１ｒ：５′⁃ＡＡＡＴＡＴＴＣＡＧＧＣＴＴＴＣＡＧＴＴＴ⁃３′，预
期扩增片段长度为 ７０４ ｂｐ。 内巢引物中上游引物为
ＣＹＶＣＶ⁃２ｆ：５′⁃ＡＡＡＣＣＴＡＡＴＣＧＧＴＣＣＴＧＴＧ⁃３′，下游引
物为 ＣＹＶＣＶ⁃２ｒ：５′⁃ＧＡＧＡＣＡＣＣＣＴＡＣＴＴＣＡＧＣＧ⁃３′，预
期扩增片段长度为 ４６９ ｂｐ。 Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （２０１４）建立
的 ＲＴ⁃ＰＣＲ 所用上游引物为 ＶＦ⁃１：５′⁃ＴＡＣＣＧＣＡＧＣ⁃
ＴＡＴＣＣＡＴＴＴＣＣ⁃３′；下游引物为 ＶＲ⁃１：５′⁃ＧＣＡＧＡＡ
ＡＴＣ⁃ＣＣＧＡＡＣＣＡＣＴＡ⁃３′。 所有引物均由英潍捷基
（上海）贸易有限公司合成。
培养基及试剂：ＬＢ（Ｌｕｒｉａ⁃Ｂｅｒｔａｎｉ）液体培养基：
１％氯化钠、０ ５％ 酵母提取液、１％ 蛋白胨。 Ｐｒｉｍ⁃
Ｓｃｒｉｐｔ １ Ｓｔｅｐ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶、胶纯
化试剂盒、ｐＭＤ１９⁃Ｔ 载体、感受态细胞 ＪＭ⁃１０９ 和质
粒纯化提取试剂盒等均购于宝生物工程（大连）有
限公司；限制性内切酶 ＸｍａＩ 和 ＨｉｎｄＩＩＩ 购于美国
ＮＥＢ公司；Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ⁃５０⁃８０ 购于美国 ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ⁃
ｃａｒｅ公司；其余试剂均为国产分析纯。
仪器： Ｖａｒｉｏｓｋａｎ® Ｆｌａｓｈ 核酸读数系统，美国
Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 公司； ＴＧＲＡＤＩＥＮＴ 型 ＰＣＲ 仪，美国
ＷｈａｔＭａｎ公司。
６５２ 植 物 保 护 学 报 ４３ 卷
１ ２ 方法
１ ２ １ ＣＹＶＣＶ病毒总核酸的提取
选取 ５ ～ １０ ｍｇ ＣＹＶＣＶ 病株的叶片，液氮中研
磨后加入 ６０ μＬ ＴＥＳ 缓冲液和 ６０ μＬ 饱和酚 ∶ 氯
仿 ∶异戊醇（２５ ∶ ２４ ∶ １）。 混匀后 ７０℃水浴 ５ ～ １０
ｍｉｎ。 将上清液用由 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ⁃５０⁃８０ 构成的微柱
过滤后在 － ２０℃保存备用（周常勇等，２００１）。
１ ２ ２ 退火温度的优化
第 １ 轮 ＲＴ⁃ＰＣＲ 扩增：将 １ μＬ ＣＹＶＣＶ 病株的
总核酸与 １ μＬ无菌水混合，９５℃解链 ３ ｍｉｎ，冰浴后
依次加入 ５ μｍｏｌ ／ Ｌ外巢引物 ＣＹＶＣＶ⁃１ｆ ／ ＣＹＶＣＶ⁃１ｒ
各 ０ ５ μＬ、２ × １ Ｓｔｅｐ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ、ＰｒｉｍＳｃｒｉｐｔ １ Ｓｔｅｐ
Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ ０ ４ μＬ，无菌水补足至 １０ μＬ。 反应条
件为：５０℃ ３０ ｍｉｎ，９４℃ ２ ｍｉｎ；９４℃ ３０ ｓ，退火（温
度设置 ４９、５１、５３、５５、５７、５９℃）３０ ｓ，７２℃ ４５ ｓ，循环
１５ 次；７２℃延伸 ５ ｍｉｎ。
第 ２轮 ＰＣＲ扩增：取１ μＬ第１轮扩增产物，依次
加入 ５ μｍｏｌ ／ Ｌ 内巢引物 ＣＹＶＣＶ⁃２ｆ ／ ＣＹＶＣＶ⁃２ｒ 各 １
μＬ、１０ × ＰＣＲ缓冲液 ２ ５ μＬ、５ Ｕ ／ μＬ Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ聚
合酶 ０ ２ μＬ，无菌水补足至 ２５ μＬ。 反应条件为：
９４℃ ２ ｍｉｎ；９４℃ ３０ ｓ，退火（温度设置 ５６、５８、６０、６２、
６４、６６℃）３０ ｓ，７２℃ ４５ ｓ，循环 ３０次；７２℃ ５ ｍｉｎ。
１ ２ ３ 巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ扩增产物的检测及鉴定
将巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ扩增产物的目的片段切胶纯化
回收后与 ｐＭＤ１９⁃Ｔ 载体于 ４℃连接过夜，并转化感
受态菌株 ＪＭ⁃１０９。 挑取单个的转化菌落，加 ＬＢ 液
体培养基培养 ２４ ｈ 后用质粒纯化提取试剂盒提取
质粒 ＤＮＡ。 质粒 ＤＮＡ 经限制性内切酶 ＸｍａＩ 和
ＨｉｎｄＩＩＩ双酶切鉴定后，将阳性克隆送英潍捷基（上
海）贸易有限公司进行测序鉴定。 测序结果与
ＣＹＶＣＶ土耳其分离株 Ｙ１（ＪＸ０４０６３５ １）的相应序列
进行 ＢＬＡＳＴ比对分析。
１ ２ ４ 巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ特异性及灵敏度检测
按照 １ ２ １ 的方法分别提取感染了 ＣＴＶ、
ＣＴＬＶ、ＳＤＶ、ＣＥＶｄ、ＣＰＶ、ＣＹＶＣＶ 和 ＨＬＢ 的病株的
总核酸，并将其与本课题组保存的溃疡病总核酸用
已建立的巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ 方法进行检测。 按照 １ ２ １
方法提取黄脉病病株样品的总核酸，使用核酸读数
系统测定其 Ａ２６０ ／ Ａ２８０比值和总核酸浓度。 用无菌水
按 １０ 倍梯度将获得的总核酸稀释至 １０７ 倍，并以此
为模板，分别按照上述的巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ，以及 Ｃｈｅｎ ｅｔ
ａｌ． （２０１４）建立的 ＲＴ⁃ＰＣＲ方法进行检测。
１ ２ ５ 巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ和 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测效果比较
采用 ＲＴ⁃ＰＣＲ和巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ 法分别检测采自
甜橙、柚、宽皮柑橘、杂柑、柠檬、葡萄柚和枳类等柑
橘上的 ５４ 个 ＣＹＶＣＶ 疑似样品。 为保证检测的可
靠性，每种方法均以 ＣＹＶＣＶ 病株和健康植株作为
正负对照。 将检测结果不一致的样品嫁接接种于 ２
年生无病毒尤力克柠檬实生苗，置于 ２５ ～ ２８℃隔离
温室中保存。 接种 ２ ～ ３ 个月后观察新梢症状。
选取 ＣＹＶＣＶ分离株 ＡＹ１ 分别嫁接接种于 ２ 年
生无病毒的尤力克柠檬、锦橙北碚⁃４４７、天草和台湾
椪柑。 每个品种嫁接 １０ 株，每株嫁接 ２ 块皮和 １ 个
芽。 嫁接后置于 ２５ ～ ２８℃隔离温室保存。 嫁接后
每 １０ ｄ提取 １ 次总核酸，总共提取 ８ 次。 每次按照
周常勇等（２００１）的方法从 ４ 个方向提取叶片中的
总核酸，并将同一植株 ４ 个方向提取的总核酸混合
后分别进行巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ和 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测。
２ 结果与分析
２ １ 退火温度的优化及扩增产物的鉴定
第 １ 轮 ＲＴ⁃ＰＣＲ扩增中，退火温度为 ４９、５１、５３、
５５、５７℃时均能扩增出 ７０４ ｂｐ 的目标片段，但 ５７℃
时目标片段较弱，因此选用 ５５℃作为最佳退火温
度。 第 ２ 轮扩增中，退火温度为 ５６、５８、６０、６２、６４、
６６℃时均能扩增出 ４６９ ｂｐ 的目标片段，除 ６２、６４、
６６℃时扩增的条带亮度较弱外，其余条带亮度基本
一致，且在 ５８℃和 ６０℃时没有出现非特异性扩增，
因此选用 ６０℃作为第 ２ 轮最佳退火温度。
获得的质粒 ＤＮＡ经双酶切鉴定后，与预期大小
相符。 阳性菌液的测序结果经 ＢＬＡＳＴ 比对分析表
明，插入片段与 ＣＹＶＣＶ 毒株 Ｙ１（ＪＸ０４０６３５ １）序列
相似性为 １００％ 。 表明该扩增产物为 ＣＹＶＣＶ。
２ ２ 巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ特异性检测
建立的巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ 方法能从来自柑橘黄脉病
样品的总核酸中扩增出 ４６９ ｂｐ 的特征条带。 该方法
在检测来自柑橘衰退病、柑橘碎叶病、温州蜜柑萎缩
病、裂皮病、鳞皮病和黄龙病病株的总核酸，以及保存
的溃疡病菌总核酸时均不能产生特征条带（图 １）。
２ ３ 巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ灵敏度检测
提取样品总核酸的 Ａ２６０ ／ Ａ２８０平均值为 １ ９３，其
浓度为 ２３９ ７１ ｍｇ ／ μＬ。 检测结果显示，巢式 ＲＴ⁃
ＰＣＲ能够检测到 １０５ 倍稀释的模板，浓度约为 ２ ４０
μｇ ／ Ｌ。 ＲＴ⁃ＰＣＲ能够检测到 １０３ 倍稀释的模板，浓
度约为 ２４０ μｇ ／ μＬ，表明巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ 检测灵敏度
较 ＲＴ⁃ＰＣＲ提高了 １００ 倍（图 ２）。
２ ４ 巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ和 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测效果比较
ＲＴ⁃ＰＣＲ从 ５４ 个疑似样品中检测出了 ３１ 个阳
７５２２ 期 周 彦等： 柑橘黄化脉明病毒巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测方法的建立及应用
图 １ 巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ方法对柑橘黄脉病样品
的特异性检测
Ｆｉｇ． １ Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ⁃ＰＣＲ ｏｎ ＣＹＶＣＶ
１： 水对照； ２ ～ １０： 柑橘衰退病、柑橘碎叶病、温州
蜜柑萎缩病、裂皮病、鳞皮病、溃疡病、黄龙病、健康植株
和柑橘黄脉病样品； １１： ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＢＭ５０００ ＋ １ ５ ｋ。
１： Ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌ； ２ － １０： ＣＴＶ， ＣＴＬＶ， ＳＤＶ， ＣＥＶｄ，
ＣＰＶ， Ｃｉｔｒｕｓ ｃａｎｋｅｒ， ＨＬＢ， ｈｅａｌｔｈｙ ｐｌａｎｔ ａｎｄ ＣＹＶＣＶ ｓａｍ⁃
ｐｌｅｓ； １１： ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＢＭ５０００ ＋ １ ５ ｋ．
性样品，巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ不仅能检测出这 ３１ 个阳性样
品，还从 １ 个椪柑疑似样品中检测出了 ＣＹＶＣＶ，２
种方法的阳性检出率分别为 ５７ ４１％ 和 ５９ ２６％ 。
将 ＲＴ⁃ＰＣＲ未检测出的椪柑疑似样品嫁接接种于无
病毒尤力克柠檬 ３ 个月后，其新梢表现出典型的脉
明、黄化症状，证实该样品感染了 ＣＹＶＣＶ。
图 ２ 巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ与 ＲＴ⁃ＰＣＲ方法检测柑橘
黄化脉明病毒灵敏度的比较
Ｆｉｇ． ２ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ⁃ＰＣＲ
ａｎｄ ＲＴ⁃ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＹＶＣＶ
１、１０： ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＢＭ５０００ ＋１ ５ ｋ； ２ ～ ９ 和 １１ ～ １８：
分别为巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ和 ＲＴ⁃ＰＣＲ的检测结果，病毒总核酸
模板均分别被稀释 １００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７ 倍。
１ ａｎｄ １０： ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＢＭ５０００ ＋１ ５ ｋ； ２ －９ ａｎｄ １１ － １８：
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗｈｉｃｈ ｄｉｌｕｔｅｄ ｆｒｏｍ １００ ｔｏ １０７ ｔｉｍｅｓ
ｂｙ ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ⁃ＰＣＲ ａｎｄ ＲＴ⁃ＰＣＲ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
将 ＣＹＶＣＶ分离株 ＡＹ１ 嫁接接种于不同的柑橘
品种后 ２０ ｄ， 运用巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ 均可检测出
ＣＹＶＣＶ。 在接种 ３０ ｄ 后，ＲＴ⁃ＰＣＲ 方可在尤力克柠
檬和锦橙北碚⁃４４７ 上检测出 ＣＹＶＣＶ，直至接种 ５０ ｄ
后，ＲＴ⁃ＰＣＲ才能在台湾椪柑上检测出 ＣＹＶＣＶ。 相
比 ＲＴ⁃ＰＣＲ，巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ 在检测出 ＣＹＶＣＶ 的时间
上提前了 １０ ～ ３０ ｄ（表 １）。
表 １ 巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ和 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测不同寄主中的柑橘黄化脉明病毒
Ｔａｂｌｅ １ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｃｉｔｒｕｓ ｙｅｌｌｏｗ ｖｅｉｎ ｃｌｅａｒｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｏｓｔｓ ｂｙ ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ⁃ＰＣＲ ａｎｄ ＲＴ⁃ＰＣＲ
接种
后天数 （ｄ）
尤力克柠檬
Ｃ． ｌｉｍｏｎ
锦橙北碚⁃４４７
Ｃ． ｓｉｎｅｎｓｉｓ
天草
Ｃ． ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ × Ｃ． ｓｉｎｅｎｓｉｓ
台湾椪柑
Ｃ． ｐｏｏｎｅｎｓｉｓ
Ｄａｙｓ ｐｏｓｔ⁃
ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ
Ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ⁃ＰＣＲ ＲＴ⁃ＰＣＲ
巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ
Ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ⁃ＰＣＲ ＲＴ⁃ＰＣＲ
巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ
Ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ⁃ＰＣＲ ＲＴ⁃ＰＣＲ
巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ
Ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ⁃ＰＣＲ ＲＴ⁃ＰＣＲ
１０ ０ ／ １０ ０ ／ １０ ０ ／ １０ ０ ／ １０ ０ ／ １０ ０ ／ １０ ０ ／ １０ ０ ／ １０
２０ ６ ／ １０ ０ ／ １０ ５ ／ １０ ０ ／ １０ ３ ／ １０ ０ ／ １０ １ ／ １０ ０ ／ １０
３０ １０ ／ １０ ４ ／ １０ ７ ／ １０ ２ ／ １０ ６ ／ １０ ０ ／ １０ ２ ／ １０ ０ ／ １０
４０ １０ ／ １０ ７ ／ １０ １０ ／ １０ ５ ／ １０ １０ ／ １０ ３ ／ １０ ５ ／ １０ ０ ／ １０
５０ １０ ／ １０ １０ ／ １０ １０ ／ １０ ８ ／ １０ １０ ／ １０ ５ ／ １０ １０ ／ １０ １ ／ １０
６０ １０ ／ １０ １０ ／ １０ １０ ／ １０ １０ ／ １０ １０ ／ １０ １０ ／ １０ １０ ／ １０ ４ ／ １０
７０ １０ ／ １０ １０ ／ １０ １０ ／ １０ １０ ／ １０ １０ ／ １０ １０ ／ １０ １０ ／ １０ ７ ／ １０
８０ １０ ／ １０ １０ ／ １０ １０ ／ １０ １０ ／ １０ １０ ／ １０ １０ ／ １０ １０ ／ １０ １０ ／ １０
检出率以阳性植株数 ／检测植株数表示。 Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｗａｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｔｏ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｔｅｓｔ
ｐｌａｎｔｓ ｕｓｅｄ．
３ 讨论
柑橘黄脉病是近年来我国出现的一种柑橘新病
害，目前尚缺乏有效的防治方法，对柑橘黄脉病的早
期诊断以及对采穗母树的监测是保证柑橘安全生产
的重要措施，因此快速、准确、灵敏的检测方法显得
尤为重要。 而当前通过指示植物鉴定 （ Ｃａｔａｒａ ｅｔ
ａｌ． ，１９９３）、血清学分析（Ａｈｌａｗａｔ ＆ Ｐａｎｔ，２００３）、电
镜观察（Ｇｒｉｍａｌｄｉ ＆ Ｃａｔａｒａ，１９９６）等方法进行柑橘黄
脉病检测时，操作繁琐且检测周期长。 Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．
（２０１４）建立的 ＲＴ⁃ＰＣＲ方法虽然极大地缩短了检测
时间，但是本研究结果显示，在检测椪柑等耐病的柑
橘品种时，尤其是在植株感染 ＣＹＶＣＶ 的初期，ＲＴ⁃
ＰＣＲ在检测灵敏度等方面还存在不足。
８５２ 植 物 保 护 学 报 ４３ 卷
相较于常规 ＲＴ⁃ＰＣＲ，巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ因具有更高
的检测灵敏度和特异性，近年来被广泛运用于柑橘
病毒病的检测。 本研究建立的 ＣＹＶＣＶ 巢式 ＲＴ⁃
ＰＣＲ检测方法，可从浓度约为 ２ ４０ μｇ ／ Ｌ 的总核酸
模板中特异性检测出 ＣＹＶＣＶ，其灵敏度较 ＲＴ⁃ＰＣＲ
提高了 １００ 倍。 这与巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ在检测其它柑橘
病毒病时表现相似，如宋震等（２０１１）建立的巢式
ＲＴ⁃ＰＣＲ可检测出浓度为 １ ２７ μｇ ／ Ｌ 总核酸中的
ＣＴＬＶ，其灵敏度较一步法 ＲＴ⁃ＰＣＲ 提高了 １００ 倍；
刘永清等 （ ２０１０ ） 和 Ａｄｋａｒ⁃Ｐｕｒｕｓｈｏｔｈａｍａ ｅｔ ａｌ．
（２０１１）报道，ＣＴＶ 巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ 检测方法的灵敏度
与实时 ＲＴ⁃ＰＣＲ相当，达 １３ ～ １４ 拷贝 ／ μＬ。 虽然巢
式 ＲＴ⁃ＰＣＲ通过 ２ 次 ＰＣＲ 扩增提高了检测的灵敏
度，但是因为在第 ２ 轮 ＰＣＲ扩增时反应体系中同时
存在 ２ 对引物，增加了发生非特异性扩增的机率，从
而对检测结果造成严重干扰。 为此，本研究通过提
高第 ２ 轮 ＰＣＲ扩增时的退火温度，消除了非特异性
扩增的产生，从而保证了检测的准确性。
在对 ５４ 份田间疑似样品进行检测时发现，巢式
ＲＴ⁃ＰＣＲ不仅可识别所有 ＲＴ⁃ＰＣＲ 检测为阳性的样
品，还可以检测出 １ 份 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测为阴性、但经指
示植物鉴定确认感染了 ＣＹＶＣＶ 的椪柑样品，因此
巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ更适用于检测不同来源的 ＣＹＶＣＶ 株
系，且其准确性高于 ＲＴ⁃ＰＣＲ。 此外，在进一步检测
接种了 ＣＹＶＣＶ的尤力克柠檬、锦橙北碚⁃４４７、天草
和台湾椪柑中发现，巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ 比 ＲＴ⁃ＰＣＲ 可提
前 １０ ～ ３０ ｄ 检测出病毒，极大地缩短了田间样品检
测时的“窗口期”，从而为柑橘黄脉病的早期监测、
预警以及有效防控提供了重要的技术保障。
参 考 文 献 （Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
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２０１３． 我国柑桔病毒病发生和防控进展． 中国果业信息，
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（责任编辑：李美娟）
９５２２ 期 周 彦等： 柑橘黄化脉明病毒巢式 ＲＴ⁃ＰＣＲ检测方法的建立及应用