全 文 ：园艺学报，2015，42 (5)：997–1002.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-1022；http：//www. ahs. ac. cn 997
收稿日期：2015–01–04；修回日期：2015–03–24
基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（201203076-01）；中央高校基本科研业务费项目（XDJK2012C078）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：lizhongan@cric.cn）
柑橘黄化脉明病毒 RT-LAMP 检测方法的建立
刘科宏，陈洪明，周 彦，李中安*
（西南大学柑桔研究所，重庆 400712）
摘 要：柑橘黄脉病由柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus，CYVCV）引起，是中国
近年来新发生的一种柑橘病害。根据 CYVCV 的外壳蛋白基因序列设计了一组特异性引物，经过一系列
条件优化，建立了该病毒的 RT-LAMP 检测方法。结果显示该方法能特异扩增 CYVCV，与其他 6 种柑橘
病原物（柑橘衰退病毒、温州蜜柑萎缩病毒、鳞皮病毒、柑橘裂皮病类病毒、柑橘碎叶病毒和柑橘黄龙
病菌）不发生反应；灵敏度为 RT-PCR 的 10 倍；田间样品的检出率为 63.33%，与 RT-PCR 的结果一致，
适用于田间样品的检测。在产物中加入荧光染料 SYBR GreenⅠ直接用肉眼观察就可判断样品是否感染
CYVCV，可省去电泳分析的时间。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点。
关键词：柑橘黄化脉明病毒；RT-LAMP；检测
中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）05-0997-06

Establishment of RT-LAMP Assay for Detection of Citrus yellow vein
clearing virus
LIU Ke-hong，CHEN Hong-ming，ZHOU Yan，and LI Zhong-an*
（Citrus Research Institute，Southwest University，Chongqing 400712，China）
Abstract：Yellow vein clearing disease caused by Citrus yellow vein clearing virus（CYVCV）was
first found in Eureka lemon in Ruili，Yunnan in 2009，and it was observed in several citrus-growing areas
of China in recent years. In order to establish the reverse transcription loop-mediated isothermal
amplification（RT-LAMP）assay，primers were designed from the conserved region in the coat protein（CP）
gene identified by multiple sequence alignment of CP gene sequences of CYVCV available in GenBank，
and its reaction conditions was optimized. CYVCV was identified by RT-LAMP while Citrus tristeza virus
（CTV），Citrus psorosis virus（CPV），Citrus exocortis viroid（CEVd），Satsuma dwarf virus（SDV），
Citrus tatter leaf virus（CTLV）and Huanglongbing（HLB）were not amplified by the RT-LAMP assay.
Sensitivity of the RT-LAMP assay was 10-fold higher than RT-PCR. The positive rate of 30 samples from
Yunnan by using the RT-LAMP was 63.33%，the same as RT-PCR，suggesting the RT-LAMP assay worked
as well as RT-PCR. In addition，amplification products were able to detect by visual inspection using
SYBR GreenⅠand there is no need for gel electrophoresis. Hence，this RT-LAMP assay is a specific，
sensitive and rapid method for detecting CYVCV.
Key words：Citrus yellow vein clearing virus；RT-LAMP；detection

Liu Ke-hong，Chen Hong-ming，Zhou Yan，Li Zhong-an.
Establishment of RT-LAMP assay for detection of Citrus yellow vein clearing virus.
998 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (5)：997–1002.
柑橘黄脉病由柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus，CYVCV）引起，该病最早
于 1988 年在巴基斯坦被发现（Catara et al.，1993），随后在印度（Alshami et al.，2003）、土耳其（Grimaldi
& Catara，1996）也有发生。2009 年中国云南首次发现了柑橘黄脉病（Chen et al.，2014），随后在
重庆、四川、江西等地也相继发现了该病。
CYVCV 属于柑橘病毒属（Mandarivirus）成员（Loconsole et al.，2012），病毒粒子直径为 13 ~
14 nm，长约 685 nm（Grimaldi & Catara，1996；Alshami et al.，2003；Önelge et al.，2011）。CYVCV
基因组全长为 7 529 个核苷酸，含有 6 个开放读码框（ORF），其中 ORF5 编码外壳蛋白（Loconsole
et al.，2012）。该病造成柠檬、酸橙等柑橘属植物叶片的叶脉黄化及明脉，并伴有叶片反卷和皱缩等
症状，严重时可至叶脉坏死、嫩叶脱落，造成树势衰弱、产量下降（Grimaldi & Catara，1996）。
栽种无病毒苗木是防治果树病毒病的主要措施，因此建立快速、灵敏的检测技术是防治该病的
关键环节。环介导等温核酸扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术采用 4 条特
异引物和 DNA 链置换聚合酶（Bst DNA polymerase），在恒温条件下快速对靶基因进行扩增（Notomi
et al.，2000），具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点，已广泛应用于各种病原微生物的
检测（Harper et al.，2010；Singh et al.，2013；Ranjan et al.，2014）。本研究中以 CYVCV 的外壳蛋
白（CP）基因序列为靶标基因，设计了 4 条特异性引物，建立了可快速、灵敏、特异地检测该病毒
的 RT-LAMP 检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料
试验于 2014 年在西南大学柑桔研究所国家柑橘苗木脱毒中心实验室进行。
感染了 CYVCV、柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）、温州蜜柑萎缩病毒（Satsuma dwarf
virus，SDV）、鳞皮病毒（Citrus psorosis virus，CPV）、柑橘裂皮病类病毒（Citrus exocortis viroid，
CEVd）、柑橘碎叶病毒（Citrus tatter leaf virus，CTLV，Kusanoa et al.，2014）和柑橘黄龙病菌（Citrus
Huanglongbing，HLB）的阳性样品及健康对照样品的叶片均由西南大学柑桔研究所国家柑橘苗木脱
毒中心提供。
柠檬（Citrus limon）和甜橙（C. sinensis）叶片于 2014 年 7 月采自云南。
荧光染料 SYBR GreenⅠ、RNA 酶抑制剂购自北京鼎国公司；Bst 聚合酶、AMV 逆转录酶、
BfaⅠ内切酶购自 New England Biolabs；RNAiso Plus、Sau3AⅠ内切酶购自 TaKaRa 公司。
Bio-metra Tgradient PCR 仪。
1.2 RT-LAMP 体系的建立
取 50 ~ 100 mg 待测样品的叶片，按照 RNAiso Plus 试剂说明书提取样品的总核酸，保存于–20
℃备用。
根据 GenBank 公布的 CYVCV 基因序列（KJ859679.1、KJ859680.1、KJ859681.1 和 JX040635.1），
选取其较保守的 CP 基因序列为靶标基因，使用 LAMP 引物设计软件 primer explorer 4.0（http：//
primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）设计引物。得到针对 6 个区域的 4 条特异性引物，其中 F3
和 B3 为外引物，FIP 和 BIP 为内引物（表 1）。引物由 Invitrogen 公司合成。
根据已报道的 RT-LAMP 反应条件（Notomi et al.，2000）进行了一系列的优化试验，最终确定
刘科宏，陈洪明，周 彦，李中安.
柑橘黄化脉明病毒 RT-LAMP 检测方法的建立.
园艺学报，2015，42 (5)：997–1002. 999

反应体系（25 μL）：2.5 μL 10× Bst buffer、3 μL MgCl2（25 mmol · L-1）、2 μL Betaine（4 mmol · L-1）、
2 μL dNTPs（10 mmol · L-1）、0.5 μL RNA 酶抑制剂（40 U · μL-1）、1 μL Bst 聚合酶（8 U · μL-1）、1 μL
AMV 逆转录酶（10 U · μL-1）、2 μL FIP（20 μmol · L-1）、2 μL BIP（20 μmol · L-1）、0.5 μL F3（10 μmol
· L-1）、0.5 μL B3（10 μmol · L-1）、6 μL 超纯水、2 μL 核酸样品。反应条件为：61 ℃ 70 min，80 ℃
5 min。取 3 μL 产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳分析；同时在产物中加入 1 μL 100 倍稀释的 SYBR Green
Ⅰ，振荡混匀，目视观察结果。

表 1 RT-LAMP 检测 CYVCV 的引物
Table 1 The primers for RT-LAMP detection of CYVCV
引物名称
Primer
引物序列（5′－3′）
Sequence
退火温度/ ℃
Annealing temperature
F3 TCCGGGGTAGACGAGAAC 47.5
B3 AGGTCCGTGCCATTTCCT 45.2
FIP CACATACAGGGAAGCGGGCGCGAAATTCGCGGCATTCG 66.9
BIP AGAGACACCCTACTTCAGCGGAAGCGTTGGCAATTTTCACAG 64.3

1.3 RT-LAMP 产物酶切鉴定
利用 BioEdit 软件分析 RT-LAMP 产物序列，限制性内切酶 BfaⅠ（C︱TAG）和 Sau3AⅠ（∣GATC）
进行酶切鉴定，BfaⅠ酶切理论值为 91 和 183 bp，Sau3AⅠ酶切理论值为 62、147、183 和 219 bp。
按 BfaⅠ、Sau3AⅠ酶试剂盒说明书进行酶切反应，取 15 μL 酶切产物用 3%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
1.4 特异性验证和灵敏度比较
提取感染 CYVCV、CTV、CPV、CEVd、SDV、CTLV、HLB 的阳性样品的总核酸，利用 RT-LAMP
反应体系对其进行检测，取 3 μL 产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳进行分析；同时在产物中加入 1 μL 100
倍稀释的 SYBR GreenⅠ，振荡混匀，目视观察结果。
以感染 CYVCV 阳性样品的总核酸为模板，用超纯水进行 10 倍梯度稀释至 105 倍，分别用
RT-LAMP 和 RT-PCR（Chen et al.，2014）方法进行检测。
应用建立的 RT-LAMP 和 RT-PCR（Chen et al.，2014）方法，分别对采自云南田间的 20 份柠檬
和 10 份甜橙样品进行检测。
2 结果与分析
2.1 RT-LAMP
应用建立的 RT-LAMP 反应体系扩增 CYVCV，能产生 LAMP 产物特殊的阶梯状条带，而健康
对照不产生条带；产物中加入 SYBR GreenⅠ后，阳性产物颜色变为黄绿色，阴性产物颜色为红棕
色（图 1）。
2.2 RT-LAMP 产物酶切鉴定
RT-LAMP 产物酶切结果显示，BfaⅠ酶切产生的条带为 91 和 183 bp，与理论值相符，Sau3AⅠ
酶切产生的条带为 62、147、183 和 219 bp，也与理论值相符（图 2）。证明该体系扩增产物确为设
计的 CYVCV 靶基因序列。
Liu Ke-hong，Chen Hong-ming，Zhou Yan，Li Zhong-an.
Establishment of RT-LAMP assay for detection of Citrus yellow vein clearing virus.
1000 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (5)：997–1002.
图 1 RT-LAMP 检测 CYVCV
Fig. 1 Detection of CYVCV by RT-LAMP
图 2 RT-LAMP 产物酶切分析
Fig. 2 Enzyme digestion of RT-LAMP products

2.3 特异性验证
以感染 CYVCV、CTV、CPV、CEVd、SDV、CTLV 和 HLB 的柑橘样品总核酸为模板，进行
RT-LAMP 反应。琼脂糖电泳结果和目视检测结果都显示只有 CYVCV 检测结果为阳性，其他样品均
为阴性（图 3），证明该 RT-LAMP 反应体系对 CYVCV 的检测具有较好的特异性，且琼脂糖电泳和
目视检测的结果具有一致性。


图 3 RT-LAMP 特异性分析
A：琼脂糖电泳；B：目视检测。1 ~ 7 分别为 CYVCV、CTV、CPV、CEVd、SDV、CTLV 和 HLB。
Fig. 3 Specificity assay of RT-LAMP
A：Agarose gel electrophoresis；B：Visual inspection.
1–7：CYVCV，CTV，CPV，CEVd，SDV，CTLV and HLB，respectively.

2.4 RT-LAMP 和 RT-PCR 灵敏度比较
将 CYVCV 阳性样品总核酸进行 10 倍梯度稀释至 105 倍，分别进行 RT-LAMP 和 RT-PCR 反应，
结果显示总核酸稀释至 103 倍时，RT-LAMP 仍能检测出 CYVCV，RT-PCR 检测 CYVCV 的总核酸
最大稀释倍数为 102（图 4），表明 RT-LAMP 检测 CYVCV 的灵敏度是 RT-PCR 的 10 倍。

刘科宏，陈洪明，周 彦，李中安.
柑橘黄化脉明病毒 RT-LAMP 检测方法的建立.
园艺学报，2015，42 (5)：997–1002. 1001


图 4 RT-LAMP（A）与 RT-PCR（B）检测 CYVCV 灵敏度比较
Fig. 4 Comparison of sensitivity of RT-LAMP（A）and RT-PCR（B）for detection of CYVCV

2.5 田间样品检测
RT-LAMP 和 RT-PCR 的检测结果一致，柠檬和甜橙共 30 份样品的检测结果显示有 19 份样品呈
阳性，11 份样品呈阴性，阳性样品的检出率均为 63.33%（表 2），表明 RT-LAMP 可应用于田间样
品的检测。

表 2 云南田间样品的检测
Table 2 Detection of field samples from Yunnan
柠檬 Citrus limon 甜橙 C. sinensis 方法
Method 检测样品数
Sample
阳性样品数
Positive sample
检测样品数
Sample
阳性样品数
Positive sample
检出率/%
Positive rate
RT-LAMP 20 15 10 4 63.33
RT-PCR 20 15 10 4 63.33
注：检出率为阳性植株数/检测植株数。
Note：The positive rate was the ratio of number of plants infected to number of test plants used.
3 讨论
本研究建立的 CYVCV 的 RT-LAMP 检测方法检测速度快，RT-LAMP 只需 70 min 便可完成对
CYVCV 的检测，而 RT-PCR 或 RT-qPCR 检测通常需 2 ~ 3 h；RT-LAMP 是恒温扩增，在水浴锅或烘
箱中即可进行反应，产物可加入荧光染料进行可视化判定，因此不需特殊仪器。RT-LAMP 检测方法
不仅节省了检测的时间，还节约了仪器（PCR 仪、电泳仪等）采购的成本，所以特别适合在基层及
果园中使用。
LAMP 产物鉴定的常用方法有产物酶切（Notomi et al.，2000）、基因克隆测序（Peng et al.，2012）
等方法，本研究选择了 BfaⅠ和 Sau3AⅠ这两种限制性内切酶对产物进行了酶切分析，都得到了与
理论值大小相符的预期条带，证明 RT-LAMP 体系扩增的确为设计的 CYVCV 靶序列。其中 Sau3A
Ⅰ酶切产生的 62 bp 条带较弱，是由于 RT-LAMP 产物为一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和
多环花椰菜结构 DNA 片段的混合物，而 62 bp 的条带只有产物末端的酶切才会产生，因此产量少，
条带较弱。
RT-LAMP 体系检测 CYVCV 的特异性强，应用 4 条引物对靶标的 6 个区域进行扩增，其中 1
Liu Ke-hong，Chen Hong-ming，Zhou Yan，Li Zhong-an.
Establishment of RT-LAMP assay for detection of Citrus yellow vein clearing virus.
1002 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (5)：997–1002.
条引物不匹配则无法反应，本研究对 CTV、CPV、CEVd、SDV、CTLV 和 HLB 进行了检测，结果
显示均为阴性。RT-LAMP 与 RT-PCR 的对比试验显示，RT-LAMP 较 RT-PCR 的灵敏度高 10 倍；而
对于田间样品的检测，RT-LAMP 与 RT-PCR 的检测结果一致，这主要是由于此次检测的田间样品数
量有限，只有 30 个样品，因此这两种方法在检测结果上没有表现出差异。但随着检测样品数量的增
加，RT-LAMP 与 RT-PCR 的检测结果很可能会出现差异，因此对脱毒苗木和良繁体系的母树等重要
材料进行检测时，建议使用灵敏度较高的 RT-LAMP 方法。

References
Alshami A A A，Ahlawat Y S，Pant R P. 2003. A hitherto unreported yellow vein clearing disease of citrus in India and its viral aetiology. Indian
Phytopathology，56：422–427.
Catara A，Azzaro A，Davino M，Polizzzi G. 1993. Yellow vein clearing of lemon in Pakistan//Moreno P，Da Graca J V，Timmer L W. Proceeding
of the 12th Conference of the International Organization of Citrus Virus. Riverside：IOCV：364–367.
Chen Hong-ming，Li Zhong-an，Wang Xue-feng，Zhou Yan，Tang Ke-zhi，Zhou Chang-yong，Zhao Xue-yuan，Yue Jian-qiang. 2014. First report
of Citrus yellow vein clearing virus on lemon in Yunnan，China. Plant Disease，http：//dx.doi.org/10.1094/PDIS-04-14-0343-PDN.
Grimaldi V，Catara A. 1996. Association of a filamentous virus with yellow vein clearing of lemon//Da Graca J V，Moreno P，Yokomi R K.
Proceeding of the 13th Conference of the International Organization of Citrus Virus. Riverside：IOCV：343–345.
Harper S J，Ward L I，Clover G R. 2010. Development of LAMP and real-time PCR methods for the rapid detection of Xylella fastidiosa for
quarantine and field applications. Phytopathology，100 (12)：1282–1288.
Kusanoa N，Iwanamib T，Naraharac K，Tanaka M. 2014. Production of monoclonal antibodies specific for the recombinant viral coat protein of Apple
stem grooving virus–citrus isolate and their application for a simple，rapid diagnosis by an immunochromatographic assay. Journal of
Virological Methods，195：86–91.
Loconsole G，Önelge N，Potere O，Giampetruzzi A，Bozan O，Satar S，De Stradis A，Savino V，Yokomi R K，Saponari M. 2012. Identification
and characterization of Citrus yellow vein clearing virus，a putative new member of the genus Mandarivirus. Phytopathology，102 (12)：
1168–1175.
Notomi T，Okayma H，Masubuchi H，Yonekawa T，Watanabe K，Amino N，Hase T. 2000. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic
Acids Research，28 (12)：63.
Önelge N，Satar S，Elibüyük Ö，Bozan O，Kamberoğlu M. 2011.Transmission studies on Citrus yellow vein clearing virus//Proceeding of the 18th
Conference of the International Organization of Citrus Virus. Riverside：IOCV. http：//iocv.org/proceedings/eighteen/Onelge_et_al.pdf.
Peng J，Shi M，Xia Z，Huang J，Fan Z. 2012. Detection of Cucumber mosaic virus isolates from banana by one-step reverse transcription
loop-mediated isothermal amplification. Archives of Virology，157 (11)：2213–2217.
Ranjan R，Kangayan M，Subramaniam S，Mohapatra J K，Biswal J K，Sharma G K，Sanyal A，Pattnaik B. 2014. Development and evaluation of
a one-step reverse transcription-loop mediated isothermal amplification assay（RT-LAMP）for rapid detection of foot and mouth disease virus in
India. Virus Disease，25 (3)：358–364.
Singh P，Mirdha B R，Ahuja V，Singh S. 2013. Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）assay for rapid detection of Entamoeba histolytica
in amoebic liver abscess. World J Microbiol Biotechnol，29：27–32.