全 文 ：园艺学报，2015，42 (9)：1843–1850.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0263；http：//www. ahs. ac. cn 1843
收稿日期：2015–06–08；修回日期：2015–08–04
基金项目：农业部公益性行业（农业）科研专项（201203076）；重庆市两江学者计划项目；中央高校基本科研专项（SWU113097）；重
庆市基础及前沿研究项目（CSTC2014JCYJ A8033）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhoucy@swu.edu.cn；songzhen@cric.cn）
柑橘黄化脉明病毒 DTBIA 检测方法的建立
宾 羽，宋 震*，李中安，周常勇*
（西南大学柑桔研究所，中国农业科学院柑桔研究所，国家柑桔工程技术研究中心，重庆 400712）
摘 要：通过柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus，CYVCV）兔源多克隆抗体（一抗）
及 Ap 标记羊抗兔 IgG（二抗）最佳稀释度等条件优化建立了 CYVCV 直接组织点免疫（Direct tissue blot
immunoassay，DTBIA）检测方法，并对其特异性、稳定性和检测效果进行了评价。试验结果显示，一抗、
二抗稀释比例分别为 1︰8 000 和 1︰2 000 时，DTBIA 检测 CYVCV 效果最佳；应用所建立的 DTBIA 方法
对携带 9 种不同柑橘病害的柑橘样品进行检测时，仅携带 CYVCV 样品呈阳性反应；柑橘黄脉病样品植
物组织印迹后，印迹膜于 4 ℃保存，90 d 内可进行有效的 CYVCV 检测；对田间不同柑橘品种利用 DTBIA
法检测 CYVCV，其结果与一步法 RT-PCR 符合率为 97.92%。可见，该 CYVCV 检测方法快速、简便、稳
定、特异及可靠，可推广应用于田间快速检测 CYVCV，对于防范柑橘黄化脉明病毒大面积传播流行具有
重要的现实意义。
关键词：柑橘；柑橘黄化脉明病毒；直接组织点免疫法
中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）09-1843-08

Direct Tissue Blot Immunoassay for Detection of Citrus yellow vein clearing
virus
BIN Yu，SONG Zhen*，LI Zhong-an，and ZHOU Chang-yong*
（Citrus Research Institute，Southwest University，Chinese Academy of Agricultural Sciences，National Citrus Engineering
Research Center，Chongqing 400712，China）
Abstract：Direct tissue blot immunoassay（DTBIA）was developed to detect Citrus yellow vein
clearing virus（CYVCV）by exploring the optimal dilution of rabbit-anti-CYVCV polyclonal antibody
（first antibody）and Alkaline phosphatase（Ap）conjugated goat-anti-rabbit IgG（secondary antibody）.
The DTBIA was the most effective when the first antibody and secondary antibody diluted in 8 000 and
2 000 separately. Using the method，only CYVCV infected samples showed positive among detected
samples associated with different citrus diseases；CYVCV could be effectively detected in 90 days after the
tissue blotting membranes kept at 4 . The consistency between DTBIA and one℃ -step RT-PCR was
97.92% in CYVCV detection of citrus varieties. The results showed that the DTBIA method is rapid，
simple，stable，specific and reliable，and can be applied for rapid detection of CYVCV in the field，which
providing the important practical significance for control of the transmission of citrus yellow vein clearing
virus and spreading of the disease widely.

Bin Yu，Song Zhen，Li Zhong-an，Zhou Chang-yong.
Direct tissue blot immunoassay for detection of Citrus yellow vein clearing virus.
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Key words：Citrus；Citrus yellow vein clearing virus；direct tissue blot immunoassay

柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus，CYVCV）引起的柑橘黄脉病是新近发生
的一种病害。自 1988 年在巴基斯坦的柠檬和酸橙上首次发现后（Catara et al.，1988，1993），该病
在印度的香橼、酸橙和柠檬等不同品种上都有发现（Alshami et al.，2003），并在巴基斯坦（Iftikhar
et al.，2010）和土耳其（Önelge et al.，2010）快速蔓延。2009 年，中国云南瑞丽首次发现了柑橘黄
脉病（Chen et al.，2014），随后该病在四川安岳、重庆等地也有发现并对部分地区的柠檬产业产生
了比较严重的影响（陈洪明 等，2014；刘翠花 等，2015）。柠檬和酸橙感染 CYVCV 后，叶片黄化、
扭曲、明脉，偶尔伴有环斑和叶脉坏死等症状（Grimaldi & Catara，1996）。CYVCV 属于 α 线性病
毒科（Alphaflexiviridae）印度柑橘病毒属（Mandarivirus），不同地域的 CYVCV 株系可能具有一定
的基因稳定性（Song et al.，2015）。CYVCV 除可通过嫁接传播，还能通过绣线菊蚜（Aphis spiraecola
Patch）和豆蚜（A. Craccivora Koch）在菜豆（Phaseolus vulgaris）和豇豆（Vigna unguiculata）上进
行高效传播（Önelge et al.，2011），因而具有大面积传播流行风险，对柑橘产业尤其是柠檬产业构
成严重威胁。因此建立简易、快速、准确的检测方法，对于监控 CYVCV 的流行，防止其为害具有
重要的现实意义。
直接组织点免疫检测法（Direct tissue blot immunoassay，DTBIA）在酶联免疫吸附检测法（Enzyme
linked immunosorbent assay，ELISA）的基础上发展而来（Hawkes et al.，1982），是直接将感病组织
在硝酸纤维素膜（Nitrocellulose filter membrane，NCM）上印迹后进行免疫及显色反应，从而达到
病原特异性检测的一种方法（Lin et al.，1990；Savaş，2002）。该方法操作简单，灵敏度较高，特异
性较强，因而得到了广泛的应用，如柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）DTBIA 检测方法为
CTV 的防治提供了重要的技术支撑（宋震 等，2006）。目前国内外尚未有利用 DTBIA 法对 CYVCV
进行检测的报道。本试验中就应用 DTBIA 法检测 CYVCV 进行了试验条件的探索及优化，以期提
供一种简易、快速、灵敏的 CYVCV 检测新方法。
1 材料与方法
1.1 毒源与抗体
试验于 2014 年 11 月至 2015 年 3 月在西南大学柑桔研究所国家柑橘苗木脱毒中心实验室进行。
柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus，CYVCV）、柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，
CTV）、温州蜜柑萎缩病毒（Satsuma dwarf virus，SDV）、柑橘碎叶病毒（Citrus tatter leaf virus，CTLV）、
柑橘裂皮类病毒（Citrus exocortis viroid，CEVd）、柑橘花叶病毒（Citrus mosaic virus，CiMV）、柑
橘鳞皮病毒（Citrus psorosis virus，CPV）、柑橘环斑病毒（Citrus ringspot virus，CRSV）、柑橘黄龙
病菌（Citrus Huanglongbing，HLB）毒源均保存于西南大学柑桔研究所国家柑橘苗木脱毒中心。柑
橘黄脉病大田样品在西南大学柑桔研究所内采取。
兔抗 CYVCV 多克隆抗体由浙江大学生物技术研究所洪建研究员惠赠，ELISA 效价为 1︰3 000。
碱性磷酸酯酶（Alkaline phosphatase，Ap）标记羊抗兔 IgG 购自北京博奥森生物技术有限公司。
1.2 DTBIA 试剂
BCIP/NBT Color Development Substrate 购自美国 Promega 公司；牛血清白蛋白（Bovine serum
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albumin，BSA）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；0.01 mol · L-1 磷酸盐缓冲液（Phosphate
buffered saline，PBS，pH 7.4）；PBST 洗涤液（0.01 mol · L-1 PBS，含 0.05% Tween-20，pH 7.4）；碱
性磷酸酯酶（Ap）底物缓冲液（0.1 mol · L-1 Tris-HCl 缓冲液，含 0.15 mol · L-1 NaCl 和 5 mmol · L-1
MgCl2，pH 9.5）；PBS-BSA 封闭液（0.01 mol · L-1 PBS，含 10 g · L-1 BSA）。
1.3 DTBIA 检测 CYVCV 方法的建立
组织印迹及检测步骤参照鞠振林等（1993）的报道，所用一抗为兔抗 CYVCV 多克隆抗体，二
抗为 Ap 标记羊抗兔 IgG，一抗、二抗孵育时间各为 1 h，显色时间 15 min。阳性反应为被检样品组
织印迹中有褐紫色斑点，阴性反应为被检样品组织印迹中无颜色反应。
一抗最适稀释度：分别以携带 CYVCV 的‘尤力克’柠檬 3 株和未携带 CYVCV 的‘尤力克’
柠檬 1 株作为检测对象。每个样品 4 次重复印迹，重复印迹 8 张，一抗 CYVCV 多克隆抗体以 PBS
做系列倍比稀释（1︰500、1︰1 000、1︰2 000、1︰4 000、1︰8 000、1︰16 000、1︰32 000、1︰64 000），
二抗 Ap 标记样抗兔 IgG 以 PBS 按 1︰2 000 稀释，进行 DTBIA 检测，显色效果明显且抗体用量最
低的稀释度即为一抗最适稀释度。
二抗最适稀释度：检测方法及二抗 Ap 标记样抗兔 IgG 系列倍比稀释梯度同一抗最适稀释度摸
索条件，所用一抗稀释倍数 1︰8 000，显色效果明显且抗体用量最低的稀释度即为二抗最适稀释度。
1.4 DTBIA 特异性试验
分别以仅携带 CYVCV、CTV、SDV、CTLV、CEVd、CiMV、CPV、CRSV、HLB 的柑橘样品
各 2 株为检测对象。每株样品东南西北 4 个方向取叶，分别于同一张 NCM 上各做 6 次重复印迹。
按照建立的方法进行 CYVCV 检测，以确定该方法的特异性。
1.5 DTBIA 稳定性试验
以携带 CYVCV 的‘尤力克’柠檬 2 株和未携带 CYVCV 的‘尤力克’柠檬 1 株作为检测对象。
每株样品东西南北方向取叶，分别于同一张 NCM 上各做 8 次重复印迹，重复印迹若干张，并于 4 ℃
保存。然后按照建立的方法分别于印迹后 1、15、30、60 和 90 d 进行 CYVCV 检测，以确定该方法
的稳定性。
1.6 田间样品检测
以西南大学柑桔研究所内 24 个柑橘品种共 50 株样品为检测对象，应用所建立的方法进行
CYVCV 的检测，其中每株柑橘样品 9 次重复印迹。应用 RNAiso Plus 试剂盒（TaKaRa，日本）提
取样品总 RNA，并使用 One Step RT-PCR Kit Ver.2 试剂盒（TaKaRa，日本）参照 Chen 等（2014）
的方法及引物（Sense：5′-TACCGCAGCTATCCATTTCC-3′；Antisense：5′-GCAGAAATCCCGAACC
ACTA-3′）平行进行 CYVCV 一步法 RT-PCR（One-step Reverse Transcription-Polymerase Chain
Reaction）检测。通过比较两种方法的检测结果，评价 DTBIA 检测方法的检测效果。
2 结果与分析
2.1 DTBIA 检测 CYVCV 方法的建立
CYVCV 的 DTBIA 检测方法中，一抗稀释度的变化比二抗稀释度的变化对背景颜色深浅的影
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Direct tissue blot immunoassay for detection of Citrus yellow vein clearing virus.
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响更大（表 1）。二抗稀释度比例为 1︰2 000，一抗稀释比例为 1︰8 000 时，阳性样品显色最明显、
背景颜色较浅，阴性样品无颜色反应、组织印迹背景颜色浅（表 1）。一抗稀释比例为 1︰8 000，二
抗稀释比例在 1︰500、1︰1 000、1︰2 000 时，阳性样品显色最明显，阴性样品均无颜色反应；但稀
释比例在 1︰2 000 时组织印迹背景颜色较浅（表 1）。因此，本试验中一抗与二抗的最适稀释比例分
别为 1︰8 000 与 1︰2 000。

表 1 DTBIA 不同抗体稀释度检测 CYVCV 结果
Table 1 The detection results of CYVCV by DTBIA with different antibody dilutions
抗体稀释 Antibody dilution 抗体稀释 Antibody dilution
一抗
First
二抗
Second
样品
Sample
检测结果
Detection
result
背景色
Background
一抗
First
二抗
Second
样品
Sample
检测结果
Detection
result
背景色
Background
阳 Positive +++ **** 阳 Positive +++ ** 1︰500 1︰2 000
阴 Negative – ****
1︰8 000 1︰500
阴 Negative – **
阳 Positive +++ *** 阳 Positive +++ ** 1︰1 000 1︰2 000
阴 Negative – ***
1︰8 000 1︰1 000
阴 Negative – **
阳 Positive +++ *** 阳 Positive +++ * 1︰2 000 1︰2 000
阴 Negative – ***
1︰8 000 1︰2 000
阴 Negative – *
阳 Positive +++ ** 阳 Positive ++ * 1︰4 000 1︰2 000
阴 Negative – **
1︰8 000 1︰4 000
阴 Negative – *
阳 Positive +++ * 阳 Positive ++ * 1︰8 000 1︰2 000
阴 Negative – *
1︰8 000 1︰8 000
阴 Negative – *
阳 Positive ++ * 阳 Positive ++ * 1︰16 000 1︰2 000
阴 Negative – *
1︰8 000 1︰16 000
阴 Negative – *
阳 Positive ++ * 阳 Positive ++ * 1︰32 000 1︰2 000
阴 Negative – *
1︰8 000 1︰32 000
阴 Negative – *
1︰64 000 1︰2 000 阳 Positive + * 1︰8 000 1︰64 000 阳 Positive + *
阴 Negative – * 阴 Negative – *
注：“+++、++、+”表示阳性反应颜色由深至浅，“–”表示阴性反应，“****、***、**、*”表示印迹背景色由深至浅。
Note：“+++，++，+”indicates deep to shallow color of the positive reaction.“–”Indicates the negative reaction.“****，***，**，*”indicate
deep to shallow color of the detection background.

2.2 DTBIA 的特异性
仅携带 CYVCV、CTV、SDV、CTLV、CEVd、CiMV、CPV、CRSV、HLB 的各柑橘样品进行
CYVCV 的 DTBIA 检测，只有柑橘黄脉病样品呈现阳性反应，其他病害样品呈现阴性反应（图 1），
说明该 DTBIA 检测方法特异性强。
2.3 DTBIA 的稳定性
在组织印迹后 1、15、30、60、90 d 进行 CYVCV 的 DTBIA 检测的结果相同，携带 CYVCV 的
‘尤力克’柠檬 a、b 两株始终呈现阳性反应，不携带 CYVCV 的‘尤力克’柠檬始终呈现阴性反应
（图 2）。因此，样品印迹 NCM 于 4 ℃保存，90 d 内可使用本试验方法有效稳定地开展 CYVCV 检
测。
2.4 田间样品检测
应用建立的 DTBIA 法对田间样品进行检测（图 3），并以相应样品平行进行一步法 RT-PCR 检
测。一步法 RT-PCR 扩增产物经 1.3%的琼脂糖凝胶电泳，阳性样品显示 614 bp 的特异性条带，阴性
样品无特异性条带（图 4）；DTBIA 与一步法 RT-PCR 检测结果的符合率为 97.92%（表 2）。可见，
DTBIA 检测方法灵敏度接近一步法 RT-PCR，检测效果良好。
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图 2 不同保存时间下组织印迹膜的 DTBIA 检测结果
a，b：CYVCV 阳性样品 2 株；–CK：负对照。
Fig. 2 CYVCV detection using DTBIA for tissue blotting
membranes at different storage time
a，b：Two plants of positive samples；–CK：Negative control；
Every plant stamped eight times respectively.
图 1 对不同柑橘病害样品进行 CYVCV 的 DTBIA 检测结果
各样品均取 2 株，每株均进行 6 次重复印迹。
Fig. 1 CYVCV detection using DTBIA for samples infected
with different citrus pathogens
Two plants were used for every sample，every plant
stamped six times respectively.



图 3 部分柑橘品种 DTBIA 检测 CYVCV
Fig. 3 CYVCV detection using DTBIA for partial citrus varieties

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图 4 部分柑橘品种一步法 RT-PCR 检测 CYVCV
Fig. 4 CYVCV detection using one-step RT-PCR for partial citrus varieties


表 2 不同柑橘品种的 DTBIA 及一步法 RT-PCR 检测
Table 2 CYVCV detection using DTBIA and one-step RT-PCR for different citrus varieties
分类地位
Taxonomic status
品种
Variety
样品株数
Number of
samples
RT-PCR 阳性株数
Positive number of
RT-PCR
DTBIA 阳性株数
Positive number of
DTBIA
符合率/%
Coincidence
rate
代代 Daidai 6 4 4 100
摩洛哥酸橙 Mrocco Sour Oramge 1 1 1 100
酸橙
Citrus aurantium
枸头橙 Goutoucheng 3 3 3 100
尤力克柠檬 Eureka Lemon 3 3 3 100 柠檬 C. limon
费米耐劳柠檬 Femimellolemon 2 0 0 100
藜檬 C. limonia 红藜檬 Honglimeng 2 2 2 100
来檬 C. aurantifolia 墨西哥来檬 Mexican Lime 2 2 2 100
沙田柚 Shatianyou 2 0 0 100
脆香甜柚 Cuixiangtianyou 2 1 1 100
强德勒柚 Chandler Pummelo 2 0 0 100
柚 C. grandis

马序 Marsh 2 2 2 100
蓬安 100 号甜橙 Pengan 100 Tiancheng 2 2 2 100
香水橙 Xiangshuicheng 2 2 2 100
纽荷尔脐橙 Newhall Navel Orange 2 2 2 100
江安 35 号夏橙 Jiangan 35 Xiacheng 2 2 2 100
甜橙 C. sinensis

塔罗科血橙 Tarocco 2 2 2 100
香橙 C. junons 蜜橙 Micheng 2 2 1 50
椪柑 C. reticulata 东 13 椪柑 Dong 13 Penggan 2 1 1 100
沙柑 C. nobilis 宫本温州蜜柑 Miyamoto Wase 2 2 2 100
朱橘 C. erythrosa 冰糖橘 Bingtangju 2 2 2 100
卡里佐枳橙 Carrizo Citrange 2 1 1 100 枳橙 P. trifoliata ×
C. sinensis 施文格枳橙 Swingle Citrumelo 1 1 1 100
清见橘橙 Kiyomi Tangor 1 1 1 100 橘橙 C. nobilis ×
C. sinensis 默科特橘 Murcott Tangerine 1 1 1 100
合计 Total 50 39 38 97.92
注：符合率（%）= DTBIA 阳性样品数/PCR 阳性样品数 × 100。
Note：Coincidence rate was indicated by the ratio of the positive number of DTBIA to that of RT-PCR.
3 讨论
已报道的 CYVCV 检测方法包括指示植物鉴定法、电子显微镜（Electron Microscope）检测法、
酶联免疫吸附法（ELISA）、蛋白质印迹法（Western Blot）、RT-PCR 检测法和环介导等温核酸扩增
法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）（Alshami et al.，2003；Iftikhar et al.，2010；
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Önelge et al.，2011；Loconsole et al.，2012；刘科宏 等，2015）。指示植物鉴定耗时长且受环境等诸
多条件限制（Kinard et al.，1996；Spiegel et al.，1996）；电镜检测法设备昂贵，操作技术不易掌握；
ELISA 检测法特异性和准确性不及 RT-PCR 检测法（Elliott et al.，1996）；RT-PCR 与 Western blot
虽灵敏度高、特异性强，但存在制样复杂、费用高和仪器依赖性强等缺陷，不利于田间样品快速检
测；RT-LAMP 法相较于 RT-PCR 法灵敏度更高，但因其较高的灵敏度易出现假阳性（路超 等，2011）。
DTBIA 法建立于血清学基础上，其灵敏度虽不及 RT-LAMP 法，但相较于 RT-LAMP 法操作更简便，
成本更低，于同一张 NCM 上可检测大量样品。
本试验通过 CYVCV 的兔源多克隆抗体（一抗）及 Ap 标记羊抗兔 IgG（二抗）最佳稀释度等
条件优化建立了柑橘黄化脉明病毒的 DTBIA 检测方法。对携带不同柑橘病害的柑橘样品进行检测，
仅携带柑橘黄脉病的样品呈现阳性反应；植物组织印迹后，印迹膜于 4 ℃保存，90 d 内能进行有效
的CYVCV检测；对田间不同柑橘品种进行CYVCV检测，其结果与一步法RT-PCR符合率为 97.92%，
且检测结果不受柑橘品种的影响。由此可见，本试验所建立的 DTBIA 检测法具有稳定性好、特异
性强和灵敏度较高等优点；检测时直接印迹植株叶柄，不需特殊制备样品和特殊仪器，操作简便，
成本低廉，可为田间样品大规模检测与监控提供重要技术支撑。
DTBIA 法采用直接组织印迹，避免了提取病毒而导致的病毒稀释，提供病毒在植物寄主中的
直接信息，反映样品叶柄切面病毒的相对含量。由于无法进行病毒稀释处理，对 DTBIA 检测灵敏
度的评估难以直接进行，理论上讲此方法采用免疫反应及酶促显色反应进行病毒检测，灵敏度与
ELLISA 相近，其田间检测结果与一步法 RT-PCR 检测结果的高符合率（97.92%）也间接说明了其
灵敏度较高。50 个样品中唯一的 RT-PCR 阳性但 DTBIA 阴性的检测结果可能与该病毒在植株中分
布不均匀有关，也可能与该样品植株叶柄组织中 CYVCV 含量少，一抗捕捉后不足以显色有关。消
除本底色是 DTBIA 检测结果判断的关键，今后可通过在免疫前对组织印迹 NCM 膜加以处理，以提
高 DTBIA 显色效果和消除植物组织本底色干扰。

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