全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１５， ４２（３）： ４６７ － ４７２ ＤＯＩ： １０􀆰 １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１５􀆰 ０３􀆰 ０２７
基金项目： 国家公益性行业（林业）科研专项（２０１４０４４０５）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｓｅｎｄａｋｉｎｇｃａｔ＠ ｑｑ． ｃｏｍ
收稿日期： ２０１４ － ０６ － ２３
花鼠乳酸脱氢酶 Ｃ基因 ｃＤＮＡ的克隆、分析及原核表达
李　 昊　 韩崇选∗　 张冬辉　 周智敏
（西北农林科技大学林学院， 陕西 杨凌 ７１２１００）
摘要： 为研究花鼠乳酸脱氢酶 Ｃ（ ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ｃ，ＬＤＨ⁃Ｃ）对花鼠免疫不育控制的影响，以
花鼠睾丸 ｃＤＮＡ为模板，通过 ＲＴ⁃ＰＣＲ技术得到花鼠 ＬＤＨ⁃Ｃ 基因 ｃＤＮＡ 编码区，并进行序列分析，
构建花鼠 ＬＤＨ⁃Ｃ的原核表达载体，导入到大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）中诱导表达，并采用聚丙烯酰胺凝
胶电泳和免疫印迹法对表达产物进行鉴定。 结果显示：扩增出的 ｃＤＮＡ片段为 ９９９ ｂｐ，编码 ３３２ 个
氨基酸，含有完整的开放阅读框；负电荷残基与正电荷残基均为 ３６ 个；预测蛋白质分子量为 ３７
ｋＤ，理论等电点为 ７􀆰 ０４，无信号肽和跨膜区，推测其是一种非分泌、疏水性蛋白。 α 螺旋、无规则卷
曲以及延伸链是 ｓＬＤＨ⁃Ｃ蛋白二级结构的主要成分。 重组菌在 ＩＰＴＧ 诱导下获得了约 ３７ ｋＤ 带有
Ｈｉｓ⁃Ｔａｇ的目的蛋白。
关键词： 花鼠； ＬＤＨ⁃Ｃ基因； 克隆； 序列分析； 基因表达
Ｃｌｏｎｉｎｇ， ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌａｃｔａｔｅ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ｃ ｃＤＮＡ ｉｎ Ｔａｍｉａｓ ｓｉｂｉｒｉｃｕｓ
Ｌｉ Ｈａｏ　 Ｈａｎ Ｃｈｏｎｇｘｕａｎ∗ 　 Ｚｈａｎｇ Ｄｏｎｇｈｕｉ　 Ｚｈｏｕ Ｚｈｉｍｉｎ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａ ＆ Ｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙａｎｇｌｉｎｇ ７１２１００， Ｓｈａａｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ Ｃ （ＬＤＨ⁃Ｃ） ｏｎ ｃｈｉｐｍｕｎｋｓ， Ｔａｍｉａｓ
ｓｉｂｉｒｉｃｕｓ， ｉｍｍｕｎｅ ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ， ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｏｆ ｃｈｉｐｍｕｎｋｓ ＬＤＨ⁃Ｃ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｈｉｐｍｕｎｋｓ
ｔｅｓｔｉｓ ｂｙ ＲＴ⁃ＰＣＲ， ａｎｄ ｉｔｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ． Ｔｈｅ ＬＤＨ⁃Ｃ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ， ａｎｄ ｔｈｉｓ ｖｅｃｔｏｒ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ＤＥ３） ａｎｄ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＩＰＴＧ．
Ｔｈｅ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎｄ ｗｅｓｔｅｒｎ⁃ｂｌｏｔ ｗｅｒｅ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ
ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｗａｓ ９９９ ｂｐ ａｎｄ ｅｎｃｏｄｅｄ ｆｏｒ ａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ３３２ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ， ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ
ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ． Ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｎｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｗｅｒｅ ｂｏｔｈ
３６ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｗａｓ ａｒｏｕｎｄ ３７ ｋＤ． Ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ （ｐＩ） ｗａｓ ７􀆰 ０４，
ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｏｒ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｉｏｎ． Ｔｈｅ ＬＤＨ⁃Ｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ａｓ ｎｏｎ⁃
ｓｅｃｒｅｔｅｄ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ａｌｐｈａ ｈｅｌｉｘ， ｒａｎｄｏｍ ｃｏｉｌ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｔｒａｎｄ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｍａｉｎ
ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＬＤＨ⁃Ｃ． Ａ ３７ ｋＤ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ Ｈｉｓ⁃Ｔａｇ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ
ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＩＰＴＧ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｔａｍｉａｓ ｓｉｂｉｒｉｃｕｓ； ＬＤＨ⁃Ｃ ｇｅｎｅ； ｃｌｏｎｅ； ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ； ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
　 　 花鼠 Ｔａｍｉａｓ ｓｉｂｉｒｉｃｕｓ属啮齿目松鼠科小型半树
栖种，在我国东北、华北、陕西北部以及秦岭地区广
泛分布（邹波等，１９９７）。 花鼠通常取食树木和经济
作物的种子以及各种坚果和浆果，对经济作物和林
木造成严重破坏。 花鼠不仅吃掉作物，而且会贮存
大量作物种子，最多可达作物产量的 ７５％以上，造
成严重的经济损失（祁勐等，２００９）。 传统防治花鼠
的方法包括笼捕法和毒饵法（周淑荣，２００９），尽管
在一定程度上可以达到控制花鼠数量和保护林木植
物的目的，但普遍面临着工作量大、灭鼠效率低、效
果差、专一性差、花鼠种群恢复快等问题。 因此，寻
求一种安全、高效、持久且专一性强的防治措施便成
为了急需解决的问题（Ｃóｒｄｏｂａ ｅｔ ａｌ． ，２００６）。
不育控制的概念最早由 Ｋｎｉｐｌｉｎｇ（１９５９）提出，
并在 ２０ 世纪 ９０ 年代初，免疫不育技术已涉及到了
控制有害生物领域。 不育技术通过控制雄性或雌性
个体绝育或干扰胚胎着床发育，以降低生育率来控
制种群数量。 目前，有关免疫不育技术的研究已经
成为不育控制鼠害的重点，免疫不育是指利用基因
重组等分子生物学技术制造使有害生物产生不育的
疫苗。 ２１ 世纪以来，重组病毒性不育疫苗已经接近
实用化（张知彬，２０００），其研究探索的主要方向是
依靠携带不育疫苗的病毒在害鼠种群中传播，使不
育疫苗在害鼠体内产生免疫反应，破坏生殖系统，导
致害鼠不育（刘汉武等，２０１１）。 由于抗原通常是自
身蛋白类或核酸物质，具有特异性结合、对环境无污
染、对非靶标动物安全等特点（张浩等，２０１３）。 免
疫机制一旦形成，终身具有免疫作用，因此目前在免
疫不育研究方面的一个重要热点是，以精子表面抗
原制备疫苗，诱导产生精子抗体并产生不育效果
（孙美玉等，２００９）。
乳酸脱氢酶 Ｃ（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＬＤＨ⁃Ｃ）是
一类四聚体寡聚酶，位于糖酵解途径的末端，能特异
性地催化丙酮酸和乳酸之间的氧化还原反应。 在哺
乳动物中，ＬＤＨ存在 ３ 种类型的同工酶亚基：ＬＤＨ⁃
Ａ、ＬＤＨ⁃Ｂ 和 ＬＤＨ⁃Ｃ。 ＬＤＨ⁃Ｃ 是组织特异的同工
酶，哺乳动物中 ＬＤＨ⁃Ｃ基因只在成熟的睾丸组织中
表达，且在成熟精子细胞里只存在 ＬＤＨ⁃Ｃ４ 一种形
式（Ｂｕｒｇｏｓ ｅｔ ａｌ． ，１９９５）。 已有研究表明，缺失 ＬＤＨ⁃
Ｃ 基因的雄性小鼠生育能力会严重降低（Ｏｄｅｔ ｅｔ
ａｌ． ，２００８），这也说明了 ＬＤＨ⁃Ｃ４ 是设计节育药物的
一个很好的靶蛋白。 事实上，已有试验以 ＬＤＨ⁃Ｃ 为
抗原制备抗体，并发现可以有效降低哺乳动物的生
育能力（Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ． ，２００１）。
我国的免疫不育疫苗研究还处于探索阶段，目
前大多以雌性动物卵透明带为研究对象设计不育药
物，其效果进展有限，对于雄性不育技术，尤其是花
鼠的研究更是空白。 因此，本试验针对雄性花鼠进
行免疫不育的防治研究，通过克隆花鼠 ＬＤＨ⁃Ｃ 基因
编码区序列，对其翻译的氨基酸序列进行初步分析
预测，并进行原核表达的初步探究，以期为蛋白研究
和针对花鼠的不育鼠药研究奠定基础。
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试动物：花鼠捕于陕西省西安市周至县，８ 周
龄左右。 将花鼠饲养在实验室普通大号鸟笼，置于
通风良好的安静房间，每只 ２０ ｃｍ 左右长度的花鼠
每 ２ 天喂 １ 块蛋糕，每 ３ 天换 １ 次清水，放 １ 个苹
果，每周清理 １ 次排泄物。
试剂：ＲＮＡ提取试剂盒、ＥＳ Ｔａｑ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ、ＤＮＡ
Ｍａｒｋｅｒ、核酸上样缓冲液、抗 Ｈｉｓ 单克隆抗体、羊抗鼠
ＩｇＧ⁃Ｂｉｏｔｉｎ均购自北京康为世纪生物科技有限公司；
琼脂糖购自美国 ＨｙｒａＧｅｎｅ 公司；反转录试剂盒购自
立陶宛 Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司；ＰＣＲ试剂盒购自东洋纺生物
科技有限公司；高效琼脂糖 ＤＮＡ 凝胶回收试剂盒购
自天根生化科技（北京）有限公司；ｐＭＤ１９⁃Ｔ 载体、
ＩＰＴＧ、Ｘ⁃ｇａｌ均购自日本 ＴａＫａＲａ 公司；氨苄青霉素购
自北京索莱宝科技有限公司；酵母提取物和蛋白胨购
自英国 ＯＸＯＩＤ 公司；感受态细胞 ＤＨ５α 和蛋白质
Ｍａｒｋｅｒ购自北京全式金生物科技有限公司；牛血清蛋
白购自瑞士 Ｒｏｃｈｅ 公司；Ｔｗｅｅｎ － ２０ 购自德国 Ｓｉｇｍａ⁃
Ａｌｄｒｉｃｈ 公司； ＨＲＰ⁃Ｓｔｅｒｐｔａｖｉｄｉｎ 结合物购自美国
ＺＹＭＥＤ公司；其它试剂均为国产分析纯。
仪器： ９７００ 型 ＰＣＲ 仪，美国应用生物系统公
司；５４２４Ｒ高速冷冻离心机，德国艾本德股份公司；
Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＸＲ ＋ 凝胶成像系统，美国 Ｂｉｏ ＲＡＤ 公司；
ＮＡＮＯＰＡＣ⁃３００ 型电泳仪，英国 Ｃｌｅａｖｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 有
限公司；ＤＹＣＺ⁃２４ＤＮ 型迷你蛋白双垂直电泳槽和
ＤＹＣＺ⁃４０Ｄ型转膜电泳仪，北京六一仪器厂。
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ 花鼠睾丸总 ＲＮＡ提取及第一链 ｃＤＮＡ合成
花鼠解剖后取睾丸组织迅速放入液氮中保存，
取约 ５０ ｍｇ睾丸组织置于研钵中，液氮研磨成粉末
状，按照康为世纪超纯 ＲＮＡ提取试剂盒步骤操作提
取总 ＲＮＡ。 第一条 ｃＤＮＡ 链合成按照 Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ 反
转录试剂盒步骤操作进行。
１􀆰 ２􀆰 ２ ＬＤＨ⁃Ｃ基因克隆
根据 ＧｅｎＢａｎｋ已经收录的多纹黄鼠 Ｓｐｅｒｍｏｐｈｉ⁃
ｌｕｓ ｔｒｉｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔｕｓ ＬＤＨ⁃Ｃ 基因的 ｍＲＮＡ 序列（ＸＭ＿
００５３２６８５１􀆰 １），针对整个 ＣＤＳ 区设计特异性引物，
并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
设计的引物序列如下：上游引物：５′⁃ＡＴＧＴＣＡＡＣＴ⁃
ＧＴＣＡＡＧＧＡＧ⁃３′， 下 游 引 物： ５′⁃ＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＡ⁃
８６４ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
ＧＡＴＣＣＴＴＴＴＧ⁃３′。 以合成的 ｃＤＮＡ 链为模板进行
ＰＣＲ扩增。 反应体系为 ２５ μＬ，其中模板 １ μＬ、上下
游引物各 １ μＬ、灭菌水 ９􀆰 ５ μＬ、ＥＳ Ｔａｑ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ
１２􀆰 ５ μＬ。 反应条件为：９４ ℃预变性 ５ ｍｉｎ，９４ ℃ ３０
ｓ，５８ ℃ ３０ ｓ，７２ ℃ ９０ ｓ，７２ ℃ ７ ｍｉｎ，循环 ３５ 次，４
℃结束反应。 产物以 １􀆰 ０％琼脂糖凝胶电泳检测结
果。 ＰＣＲ产物经胶回收纯化后，连接到 ｐＭＤ１９⁃Ｔ 载
体上，随后转化到 ＤＨ５α感受态细胞中，取 ３０ μＬ涂
布于含氨苄青霉素 （ ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ，Ａｍｐ）的 ＬＢ （ ｌｕｒｉａ⁃
ｂｅｒｔａｎｉ）固体培养基，３７ ℃培养 １２ ｈ后，挑取单克隆
菌落接种于含 Ａｍｐ 的 ＬＢ 液体培养基中，振荡过夜
培养。 菌液 ＰＣＲ验证后，筛选阳性转化子送生工生
物工程（上海）股份有限公司测序。
１􀆰 ２􀆰 ３ 花鼠 ＬＤＨ⁃Ｃ基因序列分析
用 ＤＮＡＭＡＮ软件进行氨基酸推测。 蛋白质分
子量、等电点和氨基酸组成的分析用 Ｅｘｐａｓｙ Ｐｒｏｔｐａｒ⁃
ｍａ（ｈｔｔｐ： ／ ／ ｗｗｗ． ｅｘｐａｓｙ． ｏｒｇ ／ ｐｒｏｔｐａｒａｍ ／ ）在线工具。
蛋白质跨膜区的预测、信号肽和二级结构的预测采
用 ＣＢＳ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｅｒｓ （ ｗｗｗ． ｃｂｓ． ｄｔｕ． ｄｋ ／ ｓｅｒｖ⁃
ｉｃｅｓ ／ ）进行分析。
１􀆰 ２􀆰 ４ 原核表达载体的构建与鉴定
根据测序得到的序列分析含有的酶切位点，设
计 １ 对不含其序列中酶切位点的引物，并加保护碱
基。 引物序列如下：上游引物：５′⁃ＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＴ⁃
ＣＡＡＣＴＧＴＣＡＡＧＧＡＧ⁃３′（下划线部分为 ＳａｃⅠ酶切
位点 ）， 下 游 引 物： ５′⁃ＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＡ⁃
ＧＡＴＣＣＴＴＴＴＧ⁃３′（下划线部分为 ＸｈｏⅠ酶切位点）。
以 ｃＤＮＡ为模板进行 ＰＣＲ扩增，反应条件和体系与
１􀆰 ２􀆰 ２ 相同。 产物经 １％琼脂糖凝胶电泳验证后，在
紫外灯下切胶进行回收。 回收产物经 ＳａｃⅠ和 Ｘｈｏ
Ⅰ双酶切后，与 ｐＥＴ⁃２８ａ（ ＋ ）连接，连接反应总体积
１０ μＬ，其中目的基因 ４􀆰 ５ μＬ、载体 ０􀆰 ５ μＬ、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ
Ｉ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ，１６ ℃连接过夜。
将连接产物转化到 ＢＬ２１（ＤＥ３）中，涂布于含卡
那霉素的 ＬＢ 固体培养基上，３７ ℃孵育过夜。 以挑
取的单克隆菌落摇菌液为模板进行 ＰＣＲ扩增，参数
同 １􀆰 ２􀆰 ２。 经琼脂糖凝胶电泳验证判断菌体是否含
有重组质粒。 提取质粒后进行 Ｓａｃ Ⅰ和 Ｘｈｏ Ⅰ单双
酶切验证，以观察是否含有目的 ＤＮＡ。 重组质粒委
托生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。
１􀆰 ２􀆰 ５ 重组蛋白诱导表达及检测
取 ４００ μＬ过夜培养菌，接种于 ２０ ｍＬ含卡那霉
素的 ＬＢ培养基，３７ ℃培养至 ＯＤ６００约为 ０􀆰 ４ ～ ０􀆰 ６，
加入异丙基硫代半乳糖苷（ ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ，
ＩＰＴＧ）至终浓度为 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，２８ ℃条件下诱导 ５ ｈ。
取 １ ｍＬ菌液 １２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ去上清，经磷
酸盐缓冲液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）洗涤后
加入 １５０ μＬ蛋白缓冲液，煮沸 １０ ｍｉｎ，１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ
离心取上清，１０％聚丙烯酰胺凝胶电泳（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏ⁃
ｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ⁃ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ＳＤＳ⁃
ＰＡＧＥ）电泳鉴定。
用上述方法先进行 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ，再用半干电转
移系统将重组蛋白由凝胶转印至硝酸纤维素膜上
（转移参数为 １５ Ｖ × ３０ ｍｉｎ）。 将硝酸纤维素膜置
于含 １％牛血清蛋白的 ＰＢＳ 中，４ ℃封闭过夜。 用
含 ０􀆰 ０５％ Ｔｗｅｅｎ － ２０ 的 ＰＢＳ 洗涤 ３ 次，每次 １０
ｍｉｎ，加入 １∶ １ ０００稀释的抗 Ｈｉｓ⁃Ｔａｇ 单克隆抗体，室
温下孵育 １ ｈ，洗涤 ３ 次，加入 １∶ ２０ ０００ 稀释的羊抗
鼠 ＩｇＧ⁃Ｂｉｏｔｉｎ（二抗），室温下孵育 ｌ ｈ。 洗涤 ３ 次，再
加入１∶ １ ０００稀释的 ＨＲＰ⁃Ｓｔｅｒｐｔａｖｉｄｉｎ，室温下孵育 １
ｈ。 用不含 Ｔｗｅｅｎ － ２０ 的 ＰＢＳ洗涤 ５ 次，每次 ５ ｍｉｎ，
加入底物液（含 ４⁃氯⁃１⁃萘酚）显色 ５ ～ １０ ｍｉｎ，蒸馏
水冲洗以终止显色。
２ 结果与分析
２􀆰 １ 花鼠 ＬＤＨ⁃Ｃ基因 ｃＤＮＡ克隆及重组载体的鉴定
图 １ 　 ｐＭＤ１９⁃Ｔ⁃ＬＤＨ⁃Ｃ的 ＰＣＲ扩增
Ｆｉｇ． １ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｐＭＤ１９⁃Ｔ⁃ＬＤＨ⁃Ｃ
Ｍ： ＤＭ２０００ ｍａｒｋｅｒ； １ ～ ３： ＰＣＲ 产物。 Ｍ： ＤＭ２０００
ｍａｒｋｅｒ； １ － ３： ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＰＣＲ． 　
以花鼠睾丸总 ＲＮＡ为模板，根据设计的特异性
引物，利用 ＲＴ⁃ＰＣＲ 扩增后经电泳检测得到了一条
约 １ ０００ ｂｐ大小的 ＤＮＡ 片段，经连接、转化的重组
载体进行蓝白斑筛选后，挑取白色转化菌落，以菌液
为模板进行 ＰＣＲ 验证，琼脂糖凝胶电泳验证表明，
得到与预期大小一致的片段长度（图 １）。 初步判断
已成功构建了测序载体。
９６４３ 期 李　 昊等： 花鼠乳酸脱氢酶 Ｃ基因 ｃＤＮＡ的克隆、分析及原核表达
２􀆰 ２ ＬＤＨ⁃Ｃ的序列分析及蛋白质结构分析
测序结果显示，克隆的片段全长为 ９９９ ｂｐ，编码
一个完整的开放阅读框（１ ～ ９９９），碱基组成为 Ａ
（２８􀆰 ２％ ）、Ｔ（３０􀆰 ０％ ）、Ｃ（１７􀆰 ２％ ）、Ｇ（２４􀆰 ５％ ）。 共
　 　 　
编码 ３３２ 个氨基酸，其中，亮氨酸 （ Ｌｅｕ）、丝氨酸
（Ｓｅｒ）、缬氨酸（Ｖａｌ）比例最高，均超过 １０％ ，负电荷
残基（Ａｓｐ ＋ Ｇｌｕ）与正电荷残基（Ａｒｇ ＋ Ｌｙｓ）均为 ３６
个（图 ２）。
图 ２ 花鼠 ＬＤＨ⁃Ｃ核酸序列及推测的氨基酸序列
Ｆｉｇ． ２ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＬＤＨ⁃Ｃ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
∗表示 ＴＡＡ为终止密码子，不编码氨基酸。 ∗ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈｅ ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ．
　
　 　 ＰｒｏｔＰａｒａｍ 软件分析结果显示，花鼠 ＬＤＨ⁃Ｃ 的
理论分子量为 ３７ ｋＤ，理论等电点 ＰＩ 为 ７􀆰 ０４，ＧＲＡ⁃
ＶＹ（ｇｒａｎｄ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ）值为 ０􀆰 ０８７。 用
ＳｉｇｎａｌＰ ４􀆰 １ 预测信号肽结果表明 ＬＤＨ⁃Ｃ 不存在信
号肽，经 ＴＭＨＭＭ软件分析推测 ＬＤＨ⁃Ｃ也不具有跨
膜区，推测是一种非分泌、疏水性蛋白。
ＳＯＰＭＡ分析表明 α 螺旋、无规则卷曲以及延
伸链是 ＬＤＨ⁃Ｃ 蛋白二级结构的主要成分。 ＬＤＨ⁃Ｃ
蛋白二级结构中含有 ４２􀆰 ４７％ α 螺旋、２９􀆰 ８２％无
规则卷曲、２０􀆰 ７８％延伸链和 ６􀆰 ９３％ β 转角。 通过
Ｐｈｙｒｅ２ 同源建模得到花鼠 ＬＤＨ⁃Ｃ 三维结构模型
（图 ３），其中有 ３３０ 个氨基酸残基与数据库中一个
ＬＤＨ⁃Ｃ 蛋白结构模板相似度达 ９９％ ，置信度
为 １００％ 。
２􀆰 ３ 原核表达载体鉴定
重组载体经转化后，进行单双酶切，经 １％琼脂
糖凝胶电泳验证后得到如下结果（图 ４）。 经 Ｓａｃ Ⅰ
和 Ｘｈｏ Ⅰ单酶切的载体均出现一条约 ７ ０００ ｂｐ 条
带，双酶切后的载体含有 ２ 条亮带，其中一条与已知
的 ＬＤＨ⁃Ｃ基因 ＤＮＡ相同，约 １ ０００ ｂｐ，另外一条带
略小于单酶切的条带。 初步判定重组表达载体构建
成功。 经生工生物工程（上海）股份有限公司测序
后，确定插入的 ＤＮＡ 片段与已知 ＬＤＨ⁃Ｃ 片段完全
一致。
图 ３ 花鼠 ＬＤＨ⁃Ｃ蛋白三维结构预测
Ｆｉｇ． ３ ３Ｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ＬＤＨ⁃Ｃ ｐｒｏｔｅｉｎ
　
２􀆰 ４ 重组蛋白诱导表达及鉴定
经鉴定的转化菌，经 ＩＰＴＧ 诱导后，表达产物经
１０％ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ电泳，在 ４０ ｋＤ 附近出现了 １ 条较
浓的蛋白质区带（图 ５⁃ａ），与预期的目的蛋白 ３７ ｋＤ
分子量大小相符，携带空载体的菌体 ＩＰＴＧ 诱导前
后未见菌体全蛋白变化。
ＩＰＴＧ诱导后的重组菌表达的一个蛋白质可以
被抗 Ｈｉｓ⁃Ｔａｇ单克隆抗体识别（图 ５⁃ｂ），从而显示特
０７４ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
图 ４ 重组质粒限制性酶切鉴定
Ｆｉｇ． ４ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄｓ
ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
Ｍ： ＤＭ１００００ ｍａｒｋｅｒ： １ ～ ２：单酶切产物； ３：双酶切
产物； ４： ＬＤＨ⁃Ｃ 基因表达片段。 Ｍ： ＤＭ１００００ ｍａｒｋｅｒ；
１ － ２： ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ； ３： ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ
ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ； ４： ＬＤＨ⁃Ｃ ｐｒｏｄｕｃｔ．
　
异性蛋白区带，其位置与诱导产物一致，表明 ＬＤＨ⁃
Ｃ蛋白诱导表达成功。
图 ５ 重组菌全蛋白 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ
Ｆｉｇ． ５ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ
ａ： 聚丙烯酰胺凝胶电泳； ｂ： 免疫杂交试验； Ｍ： 蛋
白质 Ｍａｒｋｅｒ； １： 诱导前的 ＢＬ２１ 菌； ２： 诱导后的 ＢＬ２１
菌； ３： 诱导前的空质粒； ４： 诱导后的空质粒； ５： 诱导
前的重组质粒； ６： 诱导后的重组质粒。 ａ： Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ
ｓｔａｉｎｅｄ ｇｅｌ； ｂ： ａｎ ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ １􀆰 ０
ｍＭ ＩＰＴＧ ａｔ ２８ ℃ ｆｏｒ ２ ｈ； Ｍ： ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｒｋｅｒ； １：
ＢＬ２１ ｃｅｌｌｓ ｂｅｆｏｒｅ ＩＰＴＧ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ； ２： ＢＬ２１ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ＩＰＴＧ
ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ； ３： ｐＥＴ⁃２８ａ ｖｅｃｔｏｒ ｂｅｆｏｒｅ ＩＰＴＧ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ； ４：
ｐＥＴ⁃２８ａ ｖｅｃｔｏｒ ａｆｔｅｒ ＩＰＴＧ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ； ５： ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ
ｂｅｆｏｒｅ ＩＰＴＧ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ； ６： ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ ａｆｔｅｒ ＩＰＴＧ ｉｎ⁃
ｄｕｃｔｉｏｎ．
　
３ 讨论
研究基于精子抗原的免疫不育疫苗是一种具有
前景并能有效控制种群的方法 （ Ｎａｚ ＆ Ｒａｊｅｓｈ，
２００４）。 免疫不育法是通过降低生育率控制种群数
量，并且不育个体干扰种群繁殖，消耗资源，能够有
效控制种群恢复的速度（刘汉武等，２００８）。 ＬＤＨ⁃Ｃ
是精子能量代谢过程中的一个重要酶，其主要分布
在精子胞质和线粒体基质内。 Ｏｄｅｔ ｅｔ ａｌ． （２００８）通
过基因剔除的方法对缺失 ＬＤＨ⁃Ｃ 的小鼠进行生育
试验发现，精子功能的缺失造成了极端的不育效果，
推测是因为 ＬＤＨ⁃Ｃ 缺失的精子在移动方式和移动
时间上均受到极大限制。 而体外受精试验也表明，
缺失 ＬＤＨ⁃Ｃ基因的精子不能使卵子受精。 这也表
明 ＬＤＨ⁃Ｃ基因是研究花鼠免疫不育疫苗极好的研
究对象。 本研究在进行预试验时，根据 ６ 种不同动
物（小家鼠 Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、褐家鼠 Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、
高原鼢鼠 Ｍｙｏｓｐａｌａｘ ｂａｉｌｅｙｉ、人 Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、赤狐
Ｖｕｌｐｅｓ ｖｕｌｐｅｓ、家兔 Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）的 ＬＤＨ⁃Ｃ序
列保守片段设计了简并引物并获得了 ６０９ ｂｐ 花鼠
ＬＤＨ⁃Ｃ片段，经 ＢＬＡＳＴ比对显示与多纹黄鼠相似度
为 ９７％ ，因而尝试以多纹黄鼠 ＬＤＨ⁃Ｃ序列编码区为
模板设计特异性引物，最终得到了花鼠 ＬＤＨ⁃Ｃ 序列
完整编码区，经比对、验证分析，表明其编码的氨基
酸序列含有 ＬＤＨ⁃Ｃ 特有的保守序列元件。 在将
ＬＤＨ⁃Ｃ与 ＮＣＢＩ 数据库中已经登录的 １４ 种动物
ＬＤＨ⁃Ｃ编码的氨基酸序列进行多重比对，构建基于
邻接法的系统进化树时，也发现花鼠 ＬＤＨ⁃Ｃ 与已知
的啮齿鼠类动物具有较高的同源性。
本研究将 ＬＤＨ⁃Ｃ 编码序列插入原核表达载体
ｐＥＴ２８ａ（＋）多克隆位点的 ＳａｃⅠ与 ＸｈｏⅠ之间，构建
了重组质粒 ｐＥＴ２８ａ⁃ｓＬＤＨ⁃Ｃ。 根据该载体阅读框架
特点，在插入序列的 ５′端上游存在 １２６ ｂｐ 的可读序
列，编码 ４２ 个氨基酸残基，其中包括 ６ 个组氨酸残
基组成的 Ｈｉｓ⁃Ｔａｇ。 因此表达的 ＬＤＨ⁃Ｃ 链实际上是
一条融合的多肽链：除 ＬＤＨ⁃Ｃ固有氨基酸序列外，Ｎ
端有一小段附加序列。 唐威华等（２０００）发现，由于
组氨酸标签携带较强的正电荷，降低了蛋白在 ＳＤＳ⁃
ＰＡＧＥ中的电泳速率，从而导致表观的分子量偏大，
这也解释了在 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ 电泳结果中，第 ６ 泳道的
条带比预计位置更加靠近 ４０ ｋＤ。 因此，在研究含
有组氨酸标签的融合蛋白时，ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ 电泳只能
作为表达的初步检测而不能作为蛋白分子量确定的
依据，本研究后续试验也将对此进行探索。
１７４３ 期 李　 昊等： 花鼠乳酸脱氢酶 Ｃ基因 ｃＤＮＡ的克隆、分析及原核表达
参 考 文 献 （Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
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ｏｆ Ｓｉｂｅｒｉａｎ ｃｈｉｐｍｕｎｋ （Ｅｕｔａｍｉａｓ ｓｉｂｉｒｉｃｕｓ） （Ⅰ） — ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
ａｇｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｅａｓｏｎａｌ ｖａｒｉｅｔｙ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｈａａｎｘｉ Ｎｏｒｍａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ （ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）， ２５ （ Ｓ１）： １０５ － １０７，
１３０ （ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ） ［邹波， 宁振东， 王庭林， 常文英． １９９７．
花鼠种群生态学研究（Ⅰ）—种群年龄结构及季节变化． 陕
西师范大学学报（自然科学版）， ２５（Ｓ１）： １０５ － １０７， １３０］
（责任编辑：高　 峰）
２７４ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷