全 文 ：植 物 研 究
B L UE I L TNB F O OTAN IC A LE RE S A RCH
绍 7卷 .绍 4摘
Vol
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7
.
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4
一 7年皿。月
Oc t
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1 O s t
番茄属 ( Ly e o p e r s ie o n ) 四个种的
过氧化物酶同工酶分析
张相岐 王海廷 黄永芬 汪清凤
AN A LY S IS O F P E R OX ID AS E !S O Z YM E IN F O U R
S P E C !E S O F G E NU S L Y C O P E RS !C O N
Z h a n g X i a n g
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H u a n g Y o n g
一
f e n g W a n g Q i n g
一 y i n
〔提要〕 本文报告了应用连续浓度梯度聚丙烯酞胺凝胶电泳对番茄属 L y co -
户e r s f e o n 的四个种 : 秘鲁番茄 L . p e r “ ℃ i a n u 沉 M i l l . , 多 毛 番茄 L .
h官r ` 。 t u o H 。 二b . e t B o n p , 醋栗番茄 L . p i , p i月 e l li f o l i u m ( J u s l ) M i l l
和普通番茄 L . es cu l o nt “ 。 M il l . 的 86 份材料 , 15 个不同生育时期 , 不
同器官以及同一器官的不同部位的过氧化物酶同工酶的分析结果 。结果表明 :
L
.
eP ur 诉 “ 。 。 的各个生育期和不同器官的过氧化物酶同工酶讲带益加共有
2 5 条带 , L . h`r s o t 。 。 有 2。 条带 , L . p im p ”` e l l官f o l i u , 有 2 5 条带 , L ,
e “ ul e耐 u 协 有 27 条带 。 种间过氧化物酶同工酶谱型差异明显 , 种 内 不 同
生育期盈加总酶谱基本一致 。 在根 、 茎和叶中 , 这四个种的过氧化物酶同工
酶酶谱和活性具有相似的生育期变化规律和器官分布规律 。 在果实发育过程
中 , 种间过氧化物酶同工酶酶谱 、 活性及变化律规都不相同 。
本文还就同工酶谱型相似值的意义 , 野生资源及同工酶分析技术在番茄
育种中的应用等问题进行了讨论 。
张相 岐 : 辽宁 , 大连 · 辽宁师 范大学生 物系 ( D e p a r t . e n t o f B 二0 10 。了 . L i 一 o n i。 。 N o r一 l
U 山v 川 it y , D o l云a n , L ia o n i o g ) .
王海廷 、 黄永芬 、 汪清甩 : 黑龙江 . 哈 尔演 , 哈尔滨师 范 大 学 生 物 系 (氏 p at t m en t of
B i o lo o y
,
H “ b i n N o r m 。 1 U n i v e : s i t y , H . r b : n . H e i lo 。 。 ji 一 n g ) .
一 1 3 3 —
自 1 9 9 5年 Ma r k er t和 M价 l lr e提出同工酶 ( i s z oy m e )的概
念〔’ `〕 , 并于 1 9 6 0年 S C h w a r t : 首先把同工酶分析技术用于杂交玉米的研
究0 7〕 以来 , 同工酶分析技术在植物遗传 、 育种及系统发育研究领域已得
到了广泛的应用 。
过氧化物酶同工酶在植物中分布广泛 , 参与多种生理活动 .(9 , 2〕 , 在
不同生育期及不同器官中变化明显 , 是进行物种的亲缘关系 、 进化 途 径 、
遗传育种以及杂种优势利用等项研究的好材料 。
R i c k 等曾用淀粉凝胶电泳对番茄属 L y c o p e r s i c o n 各个种根或茎基
中的过氧化物酶等几个同工酶系统进行了比较研究 , 根据同工酶变异范围
和地理分布 , 推测有色果种可能是单元进化的结果 , 樱桃形番茄可能是栽
培番茄的直接祖先〔` 3一` “ 〕。 本实验室曾用聚丙烯酞胺凝胶电泳对番茄栽培
品种及其杂种的过氧化物酶同工酶在不同生育期和不同部位的酶谱及其变
化情况进行了比较分析 。 结果表明 , 酶带数目和主要酶带活性在生育进程
中呈波浪形发展 , 在生育转化时期 , 变化尤为突出〔2 〕。
本实验是在以前工作的基础上 , 改进了实验方法 , 利用连续浓度梯度
聚丙烯酷胺凝胶电泳对 L梦co p er : i co : 的四个种的过氧化物酶同工酶进行了
一些比较分析 , 为番茄育种 , 尤其是野生资源的利用提供一些基础资料。
材 料 和 方 法
一 、 材料
实验材料为 L夕co eP o i co , 的四个种 : 秘鲁番茄 L . 夕 1’u 讨。 u m M il l . ,
多毛番茄 L 。 hi r s u t u二 H u m b . e t B o n p , 醋栗番茄 L . p i帅 i n e l l f f of i u ,
( J u s l ) M i l l
。 和普通番茄 L . e s e u l e , t u m M i l l . 的 5 6 份材料 。 其中 L .
e s c u
l
o n t城 包括房果状番茄 v a r . : a c e沉 i g e r u沉 , 樱挑形番茄 v a r 。 c o ar -
s i f
o加 e , 梨形番茄 v a r . p犷 i f o ,二 e , 李形番茄 v a r . p , u , i f or , 尸 , 长 圆 形
番茄 v a r 。 。 Io’ ga t u价 和一些栽培品种及品系 。
1
. 不同生育期的取材 芽期取材 5 次 , 即胚根长约 cI m ( A )I , 胚轴
长约 1 c m ( A Z) 、 2一 3 c m ( A a) 、 4一 5 。 m ( A户 和子叶展开期 (A户 。 苗期在
两片真叶期取材 1 次 ( lB ) 。 花果期取材 仑次 , 即花芽分化期 ( lC ) 、 现蕾
期 (Q ) ,第一花序第一花开 ( C : ) 、 第一花序花全开 ( C’ ) 、 第一花序全结
果 ( C户 、 第一花序第一果长足 ( C s) 、 第一花序第一果转色 ( C了) 、 第一
花序第一果红熟 ( aC ) 、 第一花序果全熟 ( C户。
芽期分析了全部86 份材料。 苗期和花果期主要分析了 L . p er ut’ `“ 协 ,
L
. 丙i r s : t二碗 , 乙. P i o P i , e l l i f o l i u二 和 工 . e s c u l e ,: t u , 的房果 , 樱挑 黄 、
一 13 4 一
粉梨 、 小黄梨 、 红李 、 粉长 、 迈球等材料 。 芽期取材为全株 , 苗期以后取
材部位为根 。
2
。 不同器官和不同部位的取材 在四个种的 6 份材料的 C 。 和 C 7 期分
别取根 , 下部茎 、 中部茎 、 上部茎 , 下部叶 、 中部叶和上部叶等三种器官
七个部位。
3
。 果实不同发育时期的取材 实验材料为四个种的 18 份材料的果皮 。
分 5 个发育时期取材 , 即小绿果 、 中绿果 、 大绿果 、 转色果和红熟果 。
芽期材料在 25 士 1℃ 恒温箱中培养 , 苗期和花果期材料取自常规管理
的田间或温室 。
二 、 方法
同工酶样品的制备是以每克鲜材料加 2 m l p H 7 . 2 的 磷 酸 缓冲液 , 冰
浴匀浆 , 4。。。 r p m离心 15 分钟 , 取上清液置冰箱中备用 。 进行酶活性测定
的材料未经离心 , 匀浆置 2 ℃左右冰箱中沉淀一昼夜 , 取上清液稀释 50 倍
进行侧定 。
电泳是采用双层双垂直板型连续浓度梯度聚丙烯酞胺凝胶电泳〔“ 〕。 分
离胶浓度范围为 7。 5一 15 % , 规格为 1 30 x 1 80 x 。。 6 25 m m 3。 浓缩胶浓度
为 3。 l % 。 配方如表 1 。 电极缓冲液为 T r i s一甘氨 酸系统 , p H S . 3 。 电泳
在 : ℃左右的冰箱内进行 , 电压为 3 o 0V , 电流约 1 5 m A /板 , 电泳时间约
4 小时 。 电泳方向 : 正极带为上接负极 , 下接正极 , 负极带与此相反 。
衰 1 了. 5一 15 % 连续浓 度梯度凝胶叹方
分宫胶 } 每 1。。 m l 溶 } 配 比 {滚缩胶 } 每 10 0 m l 溶 { 配 比
贮存液 l 液中试制含量 } 7 . 5% } 15 % 贮存液 1 液中试剂含 t } 3 . 1%
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旅 . 人P . 过位胶位 。
一 1 3 5 一
过氧化物酶同工酶染色法见参考文献 〔 7〕 , 总活性测定方法据 参 考 文
献 〔 ,〕和 (3 〕修改 , 比色液如表 2 。
1 分钟时的光密度值 , 光径为 1
衰 2 比色液成份
比色杯 }
. 样品杯 ! 对照杯成 份 、 、 .
用 7 21 型分光光度计测定室温条件下反应
c m , 比色波长为 4 6 0 n m , 酶总 活 性 用
O
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D / m l
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。 表示 。
稀释 50 倍的酶液 …一竺上二竺一
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重燕馏水 l m l
结 .
1
。 基本谱型 通过跟踪生育 期 15
次取样进行电泳 , 所得各个时期过氧化
物酶同工酶酶谱叠加 ,即得到基本谱型 。
L
。
se
c lu 阴扭祝 共可观察到 2 7 条酶 带 ,
正极 2 3 条 , 负极 4 条 , L . P e : 。 “ ia 九 u ,
和 L 。 p i帅 i n e l l i f o l i u m 都可观察到 2 8条
酶带 , 正极 24 条 , 负级 4 条 , L 。 h l’r su ut , 共可观察到 29 条酶带 , 正极 25
条 , 负极 4 条 。 各酶带在 7 . 5一 15 肠 连续浓度梯度聚丙烯酞胺凝胶电泳中
豹相对迁移率 ( R f) 和基本谱型模式图如图 1 和表 3 。实验结果表明 ,种间过
氧化物酶同工酶基本谱型差异较大 ,种内谱型差异不明显 。 以迈球 (M a r g -
l
o b e ) 为标准〔` 3 〕, L 。 e s c u l e n t u m 种内仅 v a r 。 p夕: i f o , 二 e 的 B一 1 带迁
移率稍小 , 栽培品系 80 一 A 的 A一 I 区 和 A一 1 区带型和 L 。 lP’ m iP松 l -
iI fo “ : 。相似 , 其他变种 、 栽培品种和品系的基本谱型都与迈球基本一致 。
以 S 代表同工酶谱的相似值 , 用公式
S = 相同的酶带总数相比较的两个材料的酶带总数 x 1 0 0 %
计算相似值 , 结果如表 4 。
关于番茄过氧化物酶同工酶的标准谱型 , iR c k等在淀粉凝胶电泳分析
时 , 曾提到为 20 条带 , 正极 16 条 , 负极 4 条 〔`“ 〕。 我们实验室曾用聚丙烯
酞胺凝胶电泳 , 跟踪生育期分析番茄正极过氧化物酶同工酶酶谱 , 可显示
1 7 条谱带 〔2〕。 本实验观察到的酶带较多 , 看来连续浓度梯度聚丙烯 酞 胺
凝胶能够大大提高同工酶电泳图谱的分辨率。
2
。 不同生育期过氧化物酶同工酶的变化 从 15 个不同生育期的 电泳
谱看来 , 所分析的四个种的过氧化物酶同工酶酶谱在随生育期的进展而变
化的规律上是相似的 。 芽期变化较大 , 酶带数随发芽时间的延长而逐渐增
多 , 活性也逐渐增强 。 开花期前后显现的酶带较多 , 以后有些弱带 消 失 ,
而一些活性较强的带变化不大 。 四个种的酶谱变化情况如 图 版 I , 表 5 ,
一 1 3 6 一
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. . 强 ; 皿中 ; 圈肠 ; 口 很弱 .
田 1 番茄过氧化物醉同工醉基本 谱型 摸式图 . 从左至 r石
依次为胎栗侨茄 . 多毛番茄 . 秘 再番茄和栽培品种迈球 .
一 1 3 7 —
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\名 称 黄小梨
名 称 一入
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表 6 , 表 7 和表 s 。
3
。 不同器官和同一器官不同部位的过氧化物酶同工酶的 分 布 番茄 二
不同器官和同一器官不同部位的过氧化物酶同工酶酶谱和活性 都 是 不 同
的 , 但种间比较 , 过氧化物酶同工酶的器官及部位分布特点是相似的 。 根
中显现的酶带较多 , 活性也较强 , 茎和叶中的分布特点是越是靠近植株顶
部的幼嫩组织 , 酶带越少 , 活性越低 。 结果见图版 n 一 1 。
4
。 果实发育过程中过氧化物酶同工酶的变化 本实验对四个种 的 18
份材料的果实分 6 个发育阶段进行了过氧化物酶同工酶的 电泳分析 , 并对
其中的 7 份材料进行了过氧化物酶总活性测定 。
部分材料的电泳分析结果如图版 n 一 2 和表 9 。
图版 1 一 2 和表 。 表明 , L . P e : u , i a n u m , L 。 P im Pi , e l l i f o l i u二 和 L , .
ih sr o t u m 三个野生种果实中过氧化物酶同工酶谱型及变化特点与 L 。 es cu -
le nt u m有明显差别 , 野生种显现的酶带较多 , 在发育过程中酶谱变化较小 卜
并始终显现较强的 A一 I 区带 。 而 L . es cu l踢 t un : 果实 中不显现或只显现
少而弱的 A一 I 区带 , 在发育过程中酶谱变化较大 。
表 1 0是 7 份有代表性的材料的过氧化物酶总活性的侧定结果 。
表 10 数据表明 , L 。 。 s cu l o nt : 。 绿果中过氧化物酶活性变化较小 , 果
实转色时出现一活性高峰 , 红熟果中活性最低 。 而在 8 个野生种中 , 果实
过氧化物酶活性在整个发育过程中变化较小 , 果转色期 (或相应时期 ) 活
性增加较少或不增加 。
K u 等 1 9 7。年曾观察到 , 普通番茄果实在呼吸高峰前显现 6 条过氧化
物酶同工酶带 , 呼吸高峰和高峰过后可显现 8 条酶带 。 果实成熟过 程 中 ,
过氧化物酶活性升高 3 一 4 倍 〔’ 。〕。 刘存德等 1 9 7 9 年的实验表明 , 普通番
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衰 5迈球过级化物醉同工醉姗带在不同生育期的显现情况 *
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( l) 人 l e AV期材料为全株 . 其余为根 .
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3
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4 分别表示很弱 、 弱 、 中和强活性醉带 。
( 3 ) 房果 、 樱 挑黄 、 粉 梨 、 小黄架 、 红李 、 粉长醉 谱变化荃本 与迈球相 同 .
(` ) D 区 (负极 ) 只分析了 6 个时期 .
茄幼果中有 4 条过氧化物酶同工酶带 , 半红果中有 5 条 , 绿熟果和红果中
都有 8 条 。 半红果中活性最高〔 3〕。 本实验结果与他们的都有些不同 , 各品
一 1 4 1一
衰 6 秘二茄过级化物醉同工 . 份带在不同生育期的皿理情况 *
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4 2 2 2 2 1 4
. 注释间衰 5 注 ( l )、 ( 2 )、 (峨 ) 。
种间的酶谱和活性都有差异 , 种间差异更大 。
一 1 4 2 一
衰 了 多毛番茄过级化物碑同工醉汾带在不同生育翔的皿现愉况 *
A` A。 B :C, C : C : C ` C 。 C 。 C , C
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区
. 注释同表 5 ( 1 ) 、 ( 2 ) 、 ( 4 ) 。
一 1 13
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. : 注释同表 5 ( 一) 、 ( 2 ) 、 ( 4 ) .
一 1 4 4 一
表 9番茄果实中过级化物醉同工醉讼带皿现情况 .
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. (日 小 : 小绿果 ; 中. 中绿果 , 大: 大绿果 , 转 : 转色果 . 热 . tr 热果 .
( 2 ) 1
. 2 . 3 . 4 分别代 表很弱 , 弱 . 中和强活性醉带 .
一 1 4 5一
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讨 论
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。 同工酶谱型差异及其相似值 利用同工酶表型进行植物亲缘 关 系
的研究已有许多报告〔“ , ,卜 `“ 〕 , 一般认为同工酶表型差异能够反映基因型
差异 , 因此 , 可以用来探讨系统发育问题 。 朱英国曾用醋酶同工酶的相似
值估计了水稻品种类型间的亲缘关系〔` 〕。 本实验结果表明 , 番茄种间过氧
化物酶同工酶谱型差异较大 , 相似值一般为 60 %左右 , 种内各变种及栽培
品种间酶谱基本一致 , 除 va r . p犷if 盯。 。 与迈球有一条带之 差 , 相 似值
为 9 6 . 2 9写外 , 其余均为 10 0 % 。 由此看来 , 在番茄中 , 过氧化物 酶 同工
酶谱型相似值与亲缘关系表现 了一定的平行性 , 可以做为系统分类的一个
准标 。
醋栗番茄 , 在有的分类系统中列为一个种 , 而有的分类系统中则列为
L
。 。
sc 好 。 nt ` , 的一个亚种 。 本实验结果有利于把醋栗番茄单列一种的分
类系统 。
8 0一人是近年从国外引人的一个品系 , 其谱系不详 。 它的过氧化物酶
同 工 酶 A 区带与 L . Pi帅 i n e l l i f o l`u m 和 L . Pe r 。 , i a n u , 矛畏相似 , 连同
它的形态特征综合考察 , 80 一 A 可能具有野生种 , 尤其是 L . Pim P i“ “ i f o -
“ 腼 的血统 。 由于 80 一 A 具有抗病性较强 , 多花 , 多果等优良性状 及 特
殊可以识别的过氧化物酶同工酶谱型 , 它在番茄育种或创制高优 F :上可能
很有应用价值 。 有必要对它进行深人研究 , 以作出确切评价 。
2
。 过级化物酸同工酶的分布及变化 实验表明 , 番茄种间过氧 化 物
一 1 4 6 一
酶同工酶谱型有明显差异 , 但它们在发育过程中的变化和在各种器官中的
分布规律却是很相似的 。 这可能说明种间过氧化物酶的结构基因或修饰基
因在进化过程中已发生较大的分歧 ,但属内仍保持着相似的基本代谢规律 。
L
. 。“ 时。 。 t脚 种内过氧化物酶同工酶不同生育期的盈加 总 酶 谱 基 本一
致 , 但仔细比较各同工酶带的活性及变化时 , 就会发现各品种间也存在一
些差异 。 这些差异在芽期和果实发育过程中尤其明显 。 这可能说明 , 品种
间具有相同的过氧化物酶结构基因 , 但其表达调控系统存在一些差别 。 深
人研究这种差异性 , 对于了解基因表达的调控机理以及选择高优 F : 亲本
上可能有所帮助 。 这与以前的报道是一致的〔8〕。
另外 , 由于种间仍保持相似的过氧化物酶同工酶的生育期变化和器官
分布规律 , 所以研究番茄过氧化物酶时空变化规律时 , 选取一个种就有相
当高的代表性 。 从器官分布情况来看 , 各个种都以根中显现的酶带 最 多 ,
变化也明显 , 所以选取根进行过氧化物酶同工酶谱型及变化规律的研究是
比较合适的 。
3
。 关于野生资源和同工酶选择技术在番茄育种中的 应 用 据 R ic k
等〔 , 3一 , 6〕和 T a n k s l e y 〔`幻 的研究 , 除原产地— 南美洲外 , 其他地区的
L
. o
sc
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le nt ,
, 尤其是栽培品种的基因型是基本一致的 。 因 此 , 在 栽 培
品种间进行杂交育种 , 只能获得很有限的抗性和其他优良性状 。 而在一些
野生种中却具有对番茄育种很有价值的丰富的变异性 。 如果选取与栽培品
种亲缘关系较远的野生种乃至 5 01 二 : 二 P。洲 。 l l’i 为供体亲本 , 就会更有
希望获得理想的杂交后代 。 同时由于这些野生种在许多已知的同工酶基因
位点上都具有复等位基因 , 所以就有希望选择到一个即带有目的基因又在
多个同工酶基因位点上与受体亲本有不同的等位基因的供体亲本 , 从而使
同工酶选择技术在回交后代的选择中的应用成为可能 。 T a o ks le y 等〔 , , 〕曾
提出一个应用同工酶选择进行回交育种的方案 , 并证明比形态选择有许多
优越性 , 两者可 以互相补充 。
本实检所分析的每个野生种仅过氧 化 物 酶 就 至 少在 2 个基因 位 点
(P r x 一 1 , rP x 一 2。幻 ) 上与栽培品种有不同的等位基因 , 而且还存在着表
达活性上的差异 。 可以推测 , 深人的研究会在种间发现更多的 、 不同酶系
统的不同等位基因及其与某些优良性状基因的连锁关系 , 使同工酶选择技
术在杂交育种中的应用成为可能 , 从而降低育种成本并加速育种进程 。 这
些野生材料是一个宝贵的种质资源 , 充分利用这一资源可能会给番茄育种
工作带来新的突破 。
一 14 7 一
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v i t i e s o f P e r o x i d a s e w i t h d i f f e r e n t s t a g e s a n d w i t il d i f f e r e n t
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e i s o z y m e p a t t e r n s a n d a p p l i e a t i o n s o f t il e w i ld
s P e e i e s a 几 d i s o z y m e a n a l y s i s i n t o m a t o b r e e d i n g a r e a l s o d i s e u -
s s e d i n t h e l a s t p a r t o f t h e p a P e r
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7’ 五一 J o . , . 0 1 o f H 一 r e d ` t夕 . 66 : x s一 1 5 4 .
一 14 8一
( 一。 〕 Ku, H 、 5 . e t a l . 1 9 7 0 , E t h〕 le n . p or d u e t i o n a n d p e r o x 玉d a se a e t i v i t y d u r l n ,
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