全 文 ：B U L LE T I NOFB OIA NC IA LR E E S人 RCH
第0 1卷 ,
V o l
.
10
第 4 期
N O
.
4
19 9 0年 10月
O c t
. , 10 0。
小黑杨花粉植株过氧化物酶同工酶分析
刘玉喜 陆志华 詹亚光 李 莉 齐立志 张培果
P E R OX ID E ISOZ YME AN A L Y S IS IN P O LL EN
P L AN T S O F P O P U LU S X IAOHE I
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一
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一 z h i C h a n g P e i
一
g a o
〔提要〕 1 9 8 9 年冬 笔者对 已 自行加 倍的 80 株小 黑杨花粉植株 的 休 眠 芽
进行了过氧化物畴同工畴分析 , 发现株问有差异 , 晦语可截然分成两类。 第一
类晦讲与小 .黑杨原株 (花 药培养供体 ) 不 同 , 在 B带区 多了一条带纹即 B: 带 , 此
类约占 7 8% 。 第二类畴语与小只杨原株 完全相同 , 此类约占 2 % 。 无论株 间形
态分离还是过氧化物酶 同工酶酶讲差异都充分说明这些小黑杨单倍休植株来源
于花粉 , 它们是重 组花粉在植株水平上的 表现 。 实脸还证明 ,小 黑杨花粉植株休
眠芽的过氧化物晦 同工畴晦错是稳定的 , 可 用来鉴定小黑杨花粉桂株的无性 系 ,
相信用 同 一上酶鉴定杨树无性 系会对林业 生产起重要作用 。
. 国内外已有多家通过花药离体培养诱导出多种杨树花粉植株 , 并对其进行了细胞学
研究 , 同时分析了它们的形态差异 , 籍以说明花粉植株间的分离及其来源 〔1一 ` 2〕 。 但尚
未见到有关同工酶分析的报导 。 据以往对林木同工酶分析 , 普遍认为在鉴定无性系上有
特殊意义〔 , 3〕。 笔者对小黑杨花粉植株的过氧化物酶同工酶的表型进行了研究 , 以 便 探
朋出自同一小黑杨原株的花药离体培养诱导出的小黑杨花粉植株过氧化物酶同工酶表型
在各单株间的异同 , 以及同一无性系同工酶表型的稳定性 。
材 料 和 方 法
1
。 实验材料
1
.
1 小黑杨原株 (p o P u l u : x i a o h o i T . 5 . H w a n g e x C . W a n g e t T u n g 〔` 7 〕
提供花药进行离体培养的小黑杨 , 笔者称之为小黑杨原株 。 小黑杨原株原为一株 , 全部
小黑杨花粉植株都出自此树 , 于 19 幼 年和 1 9 8 2 年采穗扦擂形成小黑杨无性系 。
本文作者工作单位 . 黑龙江 . 哈尔滨 , 东北林业大学( N o r t he a s * F o r e : t r y U n i v e r . i t了 H a r b i n H e i l o n g j i a n g ) .
一 1 13 一
1
.
2小黑杨花粉植株 19 75年一 9 1 78年间从小黑杨原株通过离体培养诱导至今得以
保留下来的约 8 0株花粉植株 , 1 9 8 2年选出 23 株扦插繁殖各自形成无性系 。
1
。
3 z J、叶杨 ( P . s i爪 。 : 11)
1
.
4 黑杨 ( P . , `19 : a )
上述材料均定植在东北林业大学院内 。 供试材料于 19 8 8年 n 月 中 旬 采 枝 , 室内-
(室温 10 ℃一 15 ℃ ) 水培 4一 30 天取叶芽和花芽供试 。
2
. 过氧化物酶同工酶分析
2
.
1 材料处理 从大树上剪枝 , 室内水培 8 天后摘取叶 芽 (约 0 。 0 4 3 9 ) 加 o . s m r
提取液 ( 0 . 3 M 蔗糖 , 0 。 0 1M K C I , 0 。 0 5M 磷酸缓冲液 p H 6 。 7) 匀 浆 后 加 2 0% 蔗糖
。 . s m l 摇匀沉淀取其上清液电泳 。
2
.
2 电泳条件 采用聚丙烯酞胺凝胶垂直板电泳 , 电泳液为高离子强度的 T r i s 一甘
氨酸系统 p H S . 3 , 分离凝胶浓度为 7纬 p H 8 . 9 , 浓缩胶浓度为 3 。 1% p H 6 . 7 。 电泳时
的电压 为 2 40 V , 室温下电泳时间为 Z 10 m in 。
2
.
3 过氧化物酶同工酶染色
贮液 A 2 9 联苯胺 , 加 18 m l 冰醋酸微热溶解后加蒸馏水 72 m玩
贮液 B 维生素 C 0 . 17 69 , 加 3 0 % H : 0 : l m l , 加蒸馏水 2 0 0 m l 。
染色时取贮液 A 20 m l , 贮液 B 80 m l 混合 , 在室温 ( 10 ℃一 15 ℃ ) 下染色 , 过氧化
物酶谱带显带后用蒸馏水漂洗 , 固定液 ( 甲醇 : 冰醋酸 : 水 = 5 : 1 : 5) 固定后用 蒸 馏
水漂洗 , 在 10 %甘油浸泡的玻璃纸中长期保存。
结 果 与 分 析
1
. 酶带的描述
供试的杨树经聚丙烯酞胺凝胶电泳过氧化物酶染色观察 , 均能分离出较 清 晰 的酶
带 , 经计算各酶带的 R ,值见图表 1 。
小黑杨花粉植株 从正极到负极都自然的呈现出 A 、 B 、 C 、 D 四个区段 , 其中酶活
性最强染色最深最先显带的是 A 带区的 A : 和 A 。 带 , B带区的 B : 带 , 这三条带在小黑杨
花粉株中极其稳定。 其次是 B 带区的 B : 和 B 。 带以及 D 带区的 D : 和 D : 带 。 C 带 区 的
C : 和 C : 带活性最弱染色最浅最后显带 。 两种类型小黑杨花粉植株的差异 就 是 B 带区
的 B : 带的有无 , 笔者把有 B : 带的叫做第一类 , 无 B : 带的是第二类 , 两类株 数 比约为
3 9 : 1 1
0
小黑杨酶带从正极到负极呈现出 A 、 B 、 C 、 D 四个区段 , 其中酶活性 最强最先显
带的是 A 带 区的 A : 和 A : 带以及 B 带区的 B : 带 。 其次是 B 带区的 B 。 带和 D 带 区的
D : 和 D : 带 。 活性最弱的仍是 C 带区的 C : 和 C : 带 。
黑杨 本应取其小黑杨的直接亲本欧洲黑杨雄株做试材 , 由于无法得到只好用现有
的欧洲黑杨雌株做试材 。 其酶谱从正极到负极同样分成四个带区 , 其活性最强的是 A带
区的 A ; 和 A : 带以及 B带 区的 B、 带 。 其次是 D 带区的 D : 和 D : 带 以 及 C 带 区 的 C `
带 。 活性最弱的是 B 带区的 B : 带 。
小叶杨 小黑杨原株的亲本是小叶杨雌株 , 但试材小叶杨雌株并不是小黑杨原株为
一 1 1 4一
图表 1小燕杨花粉植株过妞化物映同工醉 R ,醉带分布值
树 种 花 粉 株(叶芽 ) 专叶芽梦 小 黑 杨(叶芽 ) (叶芽 ) 小 叶 杨(叶芽 ) 花 粉 株(花穿 )
1 2 1
酶带分布
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8 3 8
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直接亲木 。 其同工酶酶谱从正极到负极分四个区段活性最强的是 A 带区的 A : 和 A : 带
以及 B 带区的 B 3 带 。 其次是 D 带区的刀 : 和 D : 带 , C 带区的 C : 带仍表现较 弱 , B 带
区的 B , 带活性最弱 。 (照片 1 )
小黑杨花粉植株的叶芽与花芽酶谱相同 , 但水培时间过长时花芽的酶谱发生变化 ,
增加了一个带区 , 即 E 带区的 E : 和 E : 带 。 _
2
. 过氧化物酶同工酶酶带的稳定性
任何比较性的研究必须建立在稳定可重复的基础上 , 为此对一株树冠不同位置的叶
芽进行了多次重复检验 , 同时对同一无性系的不同植株也进行了对比研究 。
2
.
1 同一植株不同位置的叶芽的酶谱是稳定的 。 为检验其稳定性 , 在一 株 树树冠
的不同方位和不同高度剪枝 、 水培和电泳发现酶谱极其稳定 , R ,值完全相同 。 这一结果
可以理解为一株树上任何一个叶芽 的酶谱均有代表性 。
2
.
2 同一无性系不同植株间的酶谱也是稳定的 。 对小黑杨 原 株 1 9 8。年和 19吕2年
扦插 的成年树 , 以及小黑杨花粉植株的原株及其 1 9 8 2年扦插植株共 24 个无性系 “ 株 ,
分别进行了同一无性系内各株间的酶谱比较 。 发现同一无性系的过氧化物酶同工酶酶谱
及 R , 值都极其稳定 , 就是活性最弱的酶带和区分两类小黑杨花粉植株的 B : 带也同样稳
定可靠。
一个无性系具备特有的基因型 , 相应地具有其特定地同工酶谱 。 一通过同工酶鉴别不
一 1 15 一
同的无性系在林木上已有多起 〔` 3, `“ 〕。 笔者对小黑杨花粉植株进行的过氧化物酶问 ! ;酶
的研究也证实了他们的结论 , 说明用同 卜酶进行无性系鉴定是可靠的 。 当然同一王性 系
的各单株必须在相同的条件下才能相互比较鉴定 。
黑龙江省冬季漫 民, 枝条处于休眠状态 i讨间长 , 因此用叶芽做 1, J工喃生 ;泣屯性 系取
材方便 , 条 f卜易于控制 , 呈理想的无性系瘾定方法 。 另外 , 于绝省杨树无性系造袜阅积较
大 , 尤 J红是西部地区造林多以杨树为主 . 有些无性系识别有 ! 1丁难 、 易造成 混 乱 彩 向生
产 , }阅此用同工酶检验无性系对生产是有益的 。
2
.
3
` 叶芽过氧化物酶酶 i鸿的稳定性受水培时间 长短的影响 。 1 9 8 8 平 1川 J 12I ! 帅枝
水培 , n 月 16 日取芽做过氧化物酶同工酶 , 其酶潜表型 `亏n 月26 } {和 12 月2引 l 的石须许完
全相同 。 而于 19 8 9年 1 月 6 日再贡复时发现有的植株仍稳定末变 , 了r的住化很 人 . 袱要
是 B 带区的 B 。 带活性变弱 (照片 2 ) 。
枝条水培 3 天后迸行同 工酶测定 . 叶芽和花茅酶 i阵相同 , 随水培日妇飞U的加 长犷f 的位
株花芽和叶芽的酶谱变化慢 , 有的变化快 。 同一植株的叶芽和花芽酶语的变化速度 也不
问 , 一般是花芽酶谱变化快 。 12 月16 口日寸叶芽酶 i普未变而花芽酶 i黔已发尘了变化 . 了李 1
月 6 日时叶芽酶谱才发生变化 。 而且两者的变化 也不相同 , 口卜芽是 B 。 带活性 变 弱 , 花
芽酶谱的变化主要是 A 带区的前面又增加了一个带区 , 现定为 E 带区 , 这一 带 {丈仃ij[J
条带即 E : 和 E : 带 (照片 3 ) 。
讨 论
小黑杨花粉植株是通过花药离体培养诱导产生的 。 而离体培养的花 药都来 f _! · 抹小
黑杨原株 , 当然这些花药的体细胞都具有完全相同的遗传基础 , 如果试材都来自花药沐
细胞就应有一种酶谱 。 而花粉植株是重组花粉在植株水平上的表现 , 在其酶潜上 也应该
有所差异 。 实脸结果表明全部花粉植株除外部形态有一定变化外 , 其过氧化物酶同一 E酶
表型也表现出一定的差异 , 同时实验还表明植株外部形态 与过氧化物酶同工酶表型 兀规
律性的联系 。
当然现有小叶杨和黑杨试材并非小黑杨原株的直接亲本 , 但它们的酶潜在分析时 也
有一定的参考价值 。 对小叶杨 、 黑杨 、 小黑杨原株以及小黑杨花粉植株的酶谱进行横向
比较 , 是为说明相互关系 。
从王明麻 ( 1 9 8 3 ) 的研究中知道 , 小叶杨雄株是杂合体 , A 带区的两条带纹是 A , ,
A
。 , 同时认为 A 带区有四个不同的同工酶变异体 ( A 。 、 A : 、 A Z 、 A 3 ) 〔 , 4 〕 , 经比较 研
究黑杨 、 小叶杨 、 小黑杨和小黑杨花粉植株的 A 带区也应有四个不同的同工酶变异体 。
照此推理 , 小黑杨和黑杨带区的两条带应是 A : 和 A 。带 , 而 小黑杨原株和小黑杨花粉
植株 A 带区的两条带应是 A : 和 A : 带 。 如此看来应把小黑杨原株和小黑杨花粉植株出
现的 A : 带看成是 “ 杂种带 ” 。
黑杨 B 带区有 B : 和 B : 带 , 小 叶 杨 B 带 区 有 B : 和 B 。 带 , 小黑杨原株 B 带区只
有 B : 和 B : 带 , 而黑杨的 B : 带不表现 。 如此看来上述三种树在 B 带区应有三个不同的
同工酶变异休 ( B : , B : ; aB ) 。 小黑花粉植株的 78 % 在 B 带区重又表现出 B : 带 . 只仃
2 2 %的植株不出现 B : 带 。
一 1 1 6 一
黑杨 C带区只有 C, 带 , 小叶杨 C 带区只有 C : 带 , 而小黑杨原株 C 带应区 表 现 出
“ 显性互补带 ” 即 C : 和 C : 带都出现 。 小黑杨花粉植株在 C 带区有 C : 和 C Z 带 。
_匕而对三个带区的带纹进行了比较分析 , 至于花粉植株同工酶酶谱与小黑杨原株酶
i阵的实质关系以及遗传基础有待进一步研究 。
结 论
1
. 小黑杨花粉植株的过氧化物酶同工酶酶谱在无性系各植株间极其稳定 , 因 此 可
用过氧化物酌同工酶鉴定其无性系 。
2
. 小黑杨花粉植株休眠芽的过氧化物酶同工酶酶谱可截然地分成两类 , 一 类 在 B
带区比小黑杨原株 多一条 B Z 带 , 此类约占 7 8% , 另一类与小黑杨原株的酶谱完全相同 ,
这一类约占 2 % 。
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、 n t r o l e i n f o r e s t r y P r o d u e t i o n
。
考 文 献
七
〔 1 〕 工 敬 驹 , 朱 至 清 , 孙敬三 。 杨树花粉植株的诱导 , 植物学报 , 1 9 了5 , 17 ( 1 ) : 56 一59
( 2 〕 黑龙 日 省林业科学院林业研究所 , 花药离体培养诱 导杨树单倍体植株 , 遗传学报 , 1 9 了6 , 3( 2 ) ; 145 一 149
〔 3 〕 为￡4匕林学院树木育种组 . 杨树单倍体花粉植株 的诱 导 , 遗传学报 , 1 9 7 7 , 4 ( l ) ; 4 9一 5 4
〔 4 〕 张立功 , 杨树 花粉植株的诱导和培植 , 花药培养学术讨 论会文 集 . 北京 : 科学出版社 , 1 9了7 , 193 一 19 4
( 5 〕 张教方 、 刘玉喜 、 陆志华 , 杨树 花药培养中小袍予发育的细胞学观察 . 东北林学院学报 , 19 79 , ( 2 ) : 5一 14
〔 6 〕 陆志华 , 张教方 , 刘玉 喜 , 张培果 . 杨树 花粉植株体细胞染色体观察 . 东北林学院学报 , 19 79 , ( 2 ) ; 14 一 2 之
〔 7 〕 朱湘渝 , 王 瑞玲 , 梁彦 , 杨树 花粉植株的 诱导 . 林业科学 , 19 8。 , 1 6 ( 3 ) ; 19 。一 197
〔 8 〕 吴克贤 , 徐妙珍 , 马和 平 , 李伟 , 朱文华 , 小黑杨花粉植株遗传 表现的初步分析 , 林业科 技 . 19 81 , ( 2 ) :
5一 6〔 9 〕 陈鸿 雕 , 茧雁 , 郊 “ 芳 , 董洪卉 , 杨树花粉植株 H : 性状遗传及其选择利用的研究 . 杨材科技通讯 , 19 81 ,
( 5 )
: 7一 15
〔10 ) 吴克贤 , 徐妙珍 , 解奇明 . 杨树 花粉植株染色体 白、然加倍规律及人工加倍技术的研究 , 林 业科技 , 198 。 ,
( 3 )
: 6一 工。
一 1 1了一
〔 6 2〕
〔 1 7〕
陆志华 , 刘玉 喜 , 杨树花药堵养及花粉材倍性研究 . 木本植钧组织培养及其应用 . 高等教 育 出 版 丰匕 生98 8 ,
15 8一 17 6
刘玉喜 . 陆志华 , 张堵呆 . 杨树花粉植株的育性研究 . 东北林业大学学报 , 19 86 , ( l ) : 20 一 25
黄敏仁 , 同工 . 在林木遗传育种中的应用 . 南京林学院学报 . 10 5 , ( 3 ) : 孟2 1一 127
王明赚 , 黄软仁等 . 杨材过暇化物醉同工功的遗传分析 . 南京林产 工业学 院学报 , ( 3 ) : 13 7 一 1’ 。
郭丽娟 , 内自荣 . 离体堵养助玉米花药及花粉往株后代过载化钧醉同工 . 的分析 . 遗传 19 81 , 3( 5 ) : 18 一
2 l
王明寐 , 黄敏仁等 . 用同工阵分析法鉴定热杨派无性系 . 南京林产工业学 院学报 , 1 982 , ( 1 ) : 1 0 5 一 1 1
周以良等 , 照龙江材木 志 , 耳龙江科 , 技术出版社 , 比B6 , 1 18
、 .碑、产J工J丹`内JJ吸七」.山二几卫.t舀r、产`r.`、
一 1 18 一