全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ ２０１５ꎬ ４２(５): ８０６ － ８１２ ＤＯＩ: １０􀆰 １３８０２ / ｊ. ｃｎｋｉ. ｚｗｂｈｘｂ. ２０１５􀆰 ０５􀆰 ０１６
基金项目:潍坊学院博士基金项目(２０１２ＢＳ１７)ꎬ国家自然科学基金(３１４００２２５)
∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ)ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｃｈａｎｇｙｊ２００４＠ １２６. ｃｏｍ
收稿日期: ２０１５ － ０５ － ０４
一株生防内生真菌的分离筛选、鉴定及抑菌特性
刘彩云∗　 许瑞瑞　 季洪亮　 常志隆
(潍坊学院生物与农业工程学院ꎬ 山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室ꎬ 潍坊 ２６１０６１)
摘要: 为获取优良植物病害生防菌ꎬ以交链孢菌 Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｔｅｎｕｉｓ Ｎｅｓｓ 和尖镰孢菌 Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ Ｓｃｈｌｅｃｈｔ为指示菌ꎬ采用平板对峙培养法、抑菌圈法和菌落直径法对健康龙柏鳞叶小枝中
分离的 ４ 株优势内生真菌进行了筛选评价ꎬ并结合形态学观察及 ＩＴＳ 序列分析对筛选出的生防内
生真菌进行了鉴定ꎮ 结果表明ꎬ对峙培养发现 １ 菌株对交链孢菌和尖镰孢菌均具有较好的抑制作
用ꎬ抑菌率分别为 ５２􀆰 ０５％和 ４８􀆰 ６５％ ꎬ标记其为 ＬＢ￣１ꎻＬＢ￣１ 菌株与指示菌对峙培养的菌落交界面
处ꎬ２ 种指示菌的菌丝均出现了消解、断裂ꎬ而 ＬＢ￣１ 的菌丝则生长正常ꎮ 未灭菌 ＬＢ￣１ 菌株发酵液
对交链孢菌和尖镰孢菌产生的抑菌圈直径分别为 １４􀆰 １ ｍｍ 和 １３􀆰 ７ ｍｍꎬ抑菌率分别为 ４７􀆰 ８９％和
４８􀆰 ７２％ ꎻ灭菌 ＬＢ￣１ 菌株发酵液对交链孢菌和尖镰孢菌的抑菌圈直径分别为 １５􀆰 ３ ｍｍ和 １５􀆰 ０ ｍｍꎬ
抑菌率分别为 ５􀆰 ９６％和 ３３􀆰 ９０％ ꎬ指示菌在生长过程中菌丝溶解现象明显ꎮ 经鉴定ꎬＬＢ￣１ 菌株为
毛壳菌属 Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ中的近缘毛壳菌 Ｃ. ｓｕｂａｆｆｉｎｅꎬ是一种极具生防潜力的内生真菌ꎬ其抑菌特性
可能通过溶菌作用实现ꎮ
关键词: 龙柏ꎻ 生防菌ꎻ 近缘毛壳菌ꎻ 溶菌作用
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎꎬ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｕｓ ａｎｄ ｔｈｅ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ
Ｌｉｕ Ｃａｉｙｕｎ∗ 　 Ｘｕ Ｒｕｉｒｕｉ　 Ｊｉ Ｈｏｎｇｌｉａｎｇ　 Ｃｈａｎｇ Ｚｈｉｌｏｎｇ
(Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅꎬ Ｗｅｉｆａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｗｅｉｆａｎｇ ２６１０６１ꎬ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｆｕｎｇｕｓ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓꎬ ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ
ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｓａｂｉｎａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｃｖ. Ｋａｉｚｕｋａ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ
ｕｓｉｎｇ ｄｕａｌ￣ｃｕｌｔｕｒｅꎬ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ ａｓｓａｙ ａｎｄ ｃｏｌｏｎｙ ｄｉａｍｅｔｅｒ ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｉｔｈ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｔｅｎｕｉｓ Ｎｅｓｓ
ａｎｄ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ Ｓｃｈｌｅｃｈｔ ａｓ ｔｈｅ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｆｕｎｇｉꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ
ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ ａｎｄ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ
ｄｕａｌ￣ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ ｍａｒｋｅｄ ａｓ ＬＢ￣１ ｈａｄ ｇｏｏｄ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒａｔｅｓ ｏｆ ＬＢ￣１ ｓｔｒａｉｎ ｔｏ Ａ. ｔｅｎｕｉｓ ａｎｄ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｗｅｒｅ ５２􀆰 ０５％ ａｎｄ ４８􀆰 ６５％ ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
Ｔｈｅ ｈｙｐｈａｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｆｕｎｇｉ ａｔ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｗｏｖｅｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ＬＢ￣１ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｗｏ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ
ｆｕｎｇｉ ｃｏｌｌａｐｓｅｄ ａｎｄ ｆｒａｃｔｕｒｅｄ ｏｎ ｄｕａｌ￣ｃｕｌｔｕｒｅｄ ＰＤＡ ｐｌａｔｅꎬ ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｈｙｐｈａｅ ｏｆ ＬＢ￣１ ｓｔｒａｉｎ ｒｅｍａｉｎｅｄ
ｎｏｒｍａｌ. Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅｓ ｏｆ Ａ. ｔｅｎｕｉｓ ａｎｄ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｏｎ ｎｏｎ￣ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ ＬＢ￣１ ｓｔｒａｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｂｒｏｔｈ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＰＤＡ ｐｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ １４􀆰 １ ｍｍ ａｎｄ １３􀆰 ７ ｍｍꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒａｔｅｓ ｗｅｒｅ
４７􀆰 ８９％ ａｎｄ ４８􀆰 ７２％ ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｏｎ ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ ＬＢ￣１ ｓｔｒａｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＰＤＡ ｐｌａｔｅｓꎬ
ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ ｗｅｒｅ １５􀆰 ３ ｍｍ ａｎｄ １５􀆰 ０ ｍｍꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒａｔｅｓ ｗｅｒｅ ５􀆰 ９６％ ａｎｄ ３３􀆰 ９０％ ꎬ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｏｂｖｉｏｕｓ ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｐｈａｅ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｏｎ ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ ＬＢ￣１ ｓｔｒａｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＰＤＡ ｐｌａｔｅｓ. Ｓｔｒａｉｎ ＬＢ￣１ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｕｂａｆｆｉｎｅꎬ ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ
ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｆｕｎｇｕｓ ａｇａｉｎｓｔ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ ｔｈｒｏｕｇｈ ｈｙｐｈａｌ ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｓａｂｉｎａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｃｖ. Ｋａｉｚｕｋａꎻ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｆｕｎｇｕｓꎻ Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｕｂａｆｆｉｎｅꎻ ｈｙｐｈａｌ ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ
　 　 以化学农药为主导的植物病害防治策略带来的
环境污染、抗药性增强等问题日趋凸显ꎬ而生防菌在
植物病害治理中所表现出的良好作用效果、生态安
全性以及不会诱导病原菌产生抗药性等优点ꎬ使得
生防菌已成为目前植物病害防治中最具研发潜力的
领域之一(韩长志ꎬ２０１５)ꎮ 目前用于植物病害防治
的生防菌种类较多ꎬ以真菌和细菌最为常见(黄丽
丹和陈玉惠ꎬ２００６)ꎮ 真菌中的哈茨木霉 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒ￣
ｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ、绿色木霉 Ｔ. ｖｉｒｉｄｅ、康氏木霉 Ｔ. ｋｏｎ￣
ｉｎｇｉｉ、丛枝菌根、淡紫拟青霉菌 Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｌｉｌａｃｉ￣
ｎｕｓ、粘帚霉 Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐｐ. ꎬ细菌中的枯草芽胞杆
菌 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、蜡状芽胞杆菌 Ｂ. ｃｅｒｅｕｓ、解淀粉
芽胞杆菌 Ｂ. ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、荧光假单胞杆菌
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ 等都已在生产中广泛应用
(殷晓敏等ꎬ２００８ꎻ郁雪平等ꎬ２００９ꎻ苏婷等ꎬ２０１０)ꎮ
另外ꎬ存在于土壤、有机肥和动植物体内的毛壳菌
Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ ｓｐｐ.也是近年来研究报道较多的具有
生防潜力的真菌类群(Ｓｏｙｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ. ꎬ２００１)ꎬ其中以
球毛壳菌 Ｃ. ｇｌｏｂｏｓｕｍ 报道较多(Ｄｉ Ｐｉｅｔｒｏ ｅｔ ａｌ. ꎬ
１９９２ꎻＡｇｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ. ꎬ２００４ꎻＰａｒｋ ｅｔ ａｌ. ꎬ２００５)ꎬ角毛
壳菌 Ｃ. ｃｕｐｒｅｕｍ(谭悠久等ꎬ２０１０)和螺旋毛壳菌 Ｃ.
ｓｐｉｒａｌｅ(郭晓等ꎬ２００５)等也有报道ꎮ
内生菌是指生活在植物组织内而不引起明显植
物病害表现的微生物类群ꎬ包括真菌、细菌和放线菌
等(Ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ. ꎬ２０００)ꎮ 内生菌与植物大多以共生
关系存在ꎬ它们对植物的致病能力已丧失或者只在
植物生长衰弱的时候表现致病性ꎬ但对植物的生长
发育却具有一定的促进和保护作用ꎬ因此内生菌在
植物病害生物防治方面具有重要价值(Ｃｌａｙꎬ１９８８ꎻ
Ｂｒｕｍ ｅｔ ａｌ. ꎬ２０１２)ꎮ 目前ꎬ已从马铃薯 (崔林等ꎬ
２００３)、银杏 (邓振山等ꎬ２００９)、云杉 (许秀兰等ꎬ
２０１４)、合欢(曲田丽等ꎬ２０１５)等多种植物中分离到
对植物病原菌具有抑制作用的内生菌ꎬ并根据形态
学观察和内转录间隔区(ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒｓꎬ
ＩＴＳ)序列分析对其进行了鉴定ꎬ发现上述分离到的
生防内生菌中既有细菌ꎬ也有真菌ꎮ
ＩＴＳ序列分析是根据真菌核糖体基因( ｒＤＮＡ)
的内转录间隔区在物种内高度保守ꎬ而种间则高度
可变的特征ꎬ通过 ＰＣＲ扩增与测序的方法获得未知
真菌的 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ序列ꎬＧｅｎＢａｎｋ数据库比对分析同
源性ꎬ对真菌从分子水平进行鉴定的方法ꎮ 相对于
传统的形态学观察ꎬＩＴＳ 序列分析具有客观、快速的
优点ꎬ同时也具有受数据库完善程度制约的缺点ꎮ
因此ꎬ在植物病原菌鉴定中ꎬ目前主要采用形态学观
察和 ＩＴＳ序列分析相结合的方法进行鉴定( Ｉｗｅｎ ｅｔ
ａｌ. ꎬ２００２)ꎮ 基于此ꎬ本试验采用形态学观察和 ＩＴＳ
序列分析相结合的方法对 ２０１３ 年本课题组从健康
龙柏鳞叶小枝中分离筛选到的生防菌株进行了研
究ꎬ包括其形态特征、分类归属及抑菌特性等ꎬ以期
为其在植物病害生物防治中的应用提供理论依据ꎮ
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试植物和菌种:健康的龙柏鳞叶小枝采自潍
坊学院校园ꎮ 用于生防内生菌筛选的指示菌为交链
孢菌 Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｔｅｎｕｉｓ Ｎｅｓｓ 和尖镰孢菌 Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘ￣
ｙｓｐｏｒｕｍ Ｓｃｈｌｅｃｈｔꎬ均为本实验室保存的菌种ꎮ
培养基:马铃薯葡萄糖琼脂 ( ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ
ａｇａｒꎬＰＤＡ)培养基:２０％的土豆煎汁、葡萄糖和琼脂
粉各 ２０ ｇꎬ定容至１ ０００ ｍＬꎻ马铃薯葡萄糖液态(ｐｏ￣
ｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈꎬＰＤＢ)培养基:２０％的土豆煎汁、
葡萄糖 ２０ ｇꎬ定容至１ ０００ ｍＬꎮ
试剂:ＰＣＲ 扩增试剂ꎬ青岛赛恩斯科技有限公
司ꎻ琼脂糖凝胶 ＤＮＡ 回收试剂盒ꎬ北京康为世纪生
物科技有限公司ꎻ十六烷基三甲基溴化铵(ｈｅｘａｄｅｃｙｌ
ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅꎬＣＴＡＢ)ꎬ上海紫一试剂
厂ꎻβ￣巯基乙醇、三羟甲基氨基甲烷等试剂均由天津
科密欧化学试剂有限公司生产ꎮ 真菌通用引物
ＩＴＳ１ 和 ＩＴＳ４ 由青岛赛恩斯科技有限公司合成ꎮ
仪器:ＤＹＹ￣６Ｃ 电泳仪ꎬ北京六一仪器厂ꎻＡｌｐｈａ
Ｉｍａｇｅｒ ＥＰ凝胶成像系统ꎬ美国自然基因科技有限公
司ꎻＮｉｋｏｎ ＴＥ２０００￣Ｕ倒置相差显微镜ꎬ日本尼康公司ꎮ
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ 生防内生菌的分离、筛选
内生菌的分离采用组织分离法 (方中达ꎬ
１９９８)ꎮ 先用自来水去除采集到的健康龙柏鳞叶小
枝上的尘污ꎬ再用 ７５％乙醇、０􀆰 １％升汞依次消毒处
理ꎬ无菌水冲洗 ５ 遍ꎮ 灭菌刀切取 ２ ~ ３ ｍｍ 长的消
７０８５ 期 刘彩云等: 一株生防内生真菌的分离筛选、鉴定及抑菌特性
毒龙柏鳞叶小枝组织ꎬ于 ２５℃、１２ ｈ 光照条件下在
ＰＤＡ平板上培养ꎬ获得的优势菌株再次在 ＰＤＡ平板
上纯化ꎬ观察并记录菌落形态特征ꎮ
采用平板对峙培养法筛选生防菌ꎮ 接种分离纯
化的直径 ６ ｍｍ的内生菌菌饼和指示菌菌饼于 ＰＤＡ
平板上同一直径的相对位置ꎬ置于 ２５℃、１２ ｈ 光照
条件下培养 ５ ｄꎬ观察对峙培养的菌落生长情况ꎬ筛
选生防菌ꎮ 筛选出的生防菌再次与指示菌对峙培养
(２５℃、１２ ｈ光照)ꎬ并设单独培养的指示菌为对照ꎮ
５ ｄ后采用十字交叉法测定指示菌单独培养的菌落
半径(Ｒｃ)和对峙培养的趋向半径(Ｒｐ)ꎬ并计算抑菌
率(邓振山等ꎬ２００９)ꎬ分析生防菌对指示菌的抑制
效果ꎮ 抑菌率 ＝ (Ｒｃ － Ｒｐ) / Ｒｃ × １００％ ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ２ 生防菌发酵液的抑菌特性检测
参照谭悠久等(２０１０)方法ꎬ将筛选到的生防菌
在 ＰＤＡ 平板上活化ꎬ刮取菌组织接入 ＰＤＢ 培养基
中ꎬ于 ２２℃、１２０ ｒ / ｍｉｎ转速下振荡培养 ３ ｄꎮ 培养的
菌液经双层纱布过滤除去菌丝ꎬ得到的发酵液分成
２ 份ꎬ１ 份用高压灭菌锅进行灭菌处理ꎬ１ 份未做任
何处理ꎮ 以交链孢菌和尖镰孢菌为指示菌ꎬ用下列
２ 种方法测定上述 ２ 种发酵液的抑菌特性ꎮ
抑菌圈法:在 ＰＤＡ 平板上涂布指示菌悬液ꎬ在
其中央放置牛津杯ꎬ分别加入筛选出的生防菌灭菌
和未灭菌发酵液各 ２６０ μＬꎬ置于光照培养箱中ꎬ于
２５℃、１２ ｈ光照下培养 ５ ｄꎬ测定抑菌圈直径大小ꎬ分
析发酵液的抑菌特性ꎮ 每处理 ３ 次重复ꎮ
菌落直径法:将筛选出的灭菌和未灭菌生防菌
发酵液分别与冷却至 ４５℃左右的 ＰＤＡ 培养基以
１ ∶ ２的体积比混合ꎬ制成含生防菌发酵液的 ＰＤＡ 平
板ꎬ接种直径 ６ ｍｍ的指示菌菌饼于平板中央ꎬ置于
光照培养箱中于 ２５℃、１２ ｈ 光照下培养 ５ ｄꎮ 对照
为不含发酵液的 ＰＤＡ 平板ꎮ 根据对照组和处理组
ＰＤＡ平板上指示菌的菌落直径大小ꎬ分别计算灭菌
和未灭菌发酵液的抑菌率ꎮ 每处理 ３ 次重复ꎮ 抑菌
率 ＝ (对照指示菌菌落直径 － 处理指示菌菌落直
径) /对照指示菌菌落直径 × １００％ ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ３ 生防菌的鉴定试验
形态特征观察:刮取 ＰＤＡ平板上活化的生防菌
菌落ꎬ用 １％葡萄糖溶液制成菌悬液ꎬ制作临时装
片ꎬ用数码显微镜观察病原菌形态特征并拍照ꎮ
ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ序列分析:ＰＤＡ平板活化筛选到的生
防菌ꎬ待菌落铺满整个培养皿后ꎬ用灭菌刀片刮取菌
组织ꎬ采用 ＣＴＡＢ法提取基因组 ＤＮＡꎬ用真菌通用引
物 ＩＴＳ１ (５′￣ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ￣３′) 和 ＩＴＳ４
(５′￣ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ￣３′)对提取的 ＤＮＡ
进行 ＰＣＲ 扩增ꎮ ＰＣＲ 反应体系:２ × Ｅｓ Ｔａｑ Ｍａｓｔｅｒ
Ｍｉｘ ２５ μＬ、ＤＮＡ 模板 ２ μＬ、１０ μｍｏｌ / Ｌ 上下游引物
各 ２ μＬ、加 ｄｄＨ２Ｏ 至 ５０ μＬꎬ对照加入 ｄｄＨ２Ｏ 代替
ＤＮＡ模板ꎮ ＰＣＲ扩增条件:９４℃预变性 ５ ｍｉｎꎬ９４℃
变性 ３０ ｓꎬ５６℃退火 ３０ ｓꎬ７２℃延伸 １ ｍｉｎꎬ３５ 个循
环ꎻ７２℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ
扩增产物经 １％琼脂糖凝胶电泳检测后ꎬ用回
收试剂盒回收ꎬ由南京金斯瑞生物科技公司测序ꎮ
测序结果用 ＢＬＡＳＴ 软件与 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库中已登
录真菌的 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 序列进行同源性比较ꎬ应用
ＭＥＧＡ ４􀆰 ０ 软件以邻接法构建菌株系统发育树ꎮ
１􀆰 ３ 数据分析
试验数据均采用 ＳＡＳ ８􀆰 ０ 软件进行统计分析ꎬ
应用最小显著差异法(ＬＳＤ)进行差异显著性检验ꎮ
２ 结果与分析
２􀆰 １ 生防菌的抑菌作用
对峙培养结果表明ꎬ从龙柏鳞叶小枝中分离到
的 ４ 个优势菌株中有 １ 个菌株具有明显的抑菌作
用ꎬ标记为 ＬＢ￣１ꎮ 在 ＬＢ￣１ 菌株与交链孢菌对峙培
养的 ＰＤＡ平板上ꎬＬＢ￣１ 菌丝生长旺盛ꎬ交链孢菌被
包裹在接菌点处的狭小区域(图 １￣Ａ)ꎻ在 ＬＢ￣１ 菌株
与尖镰孢菌对峙培养的 ＰＤＡ 平板上也得到了相似
的结果(图 １￣Ｂ)ꎮ 对峙培养的 ２ 菌株交织面的显微
观察发现ꎬ被抑制的交链孢菌和尖镰孢菌菌丝均表
现出了明显的消解、断裂(图 １￣Ｃ、Ｄ)ꎮ 抑菌率测定
表明ꎬＬＢ￣１ 菌株对交链孢菌和尖镰孢菌的抑菌率分
别为 ５２􀆰 ０５％和 ４８􀆰 ６５％ ꎮ
２􀆰 ２ 生防菌发酵液的抑菌特性
ＬＢ￣１ 菌株发酵液在未灭菌和灭菌情况下对 ２
种指示菌均可产生抑菌圈(图 ２)ꎮ 交链孢菌和尖镰
孢菌在含有未灭菌发酵液的 ＰＤＡ 平板上形成的抑
菌圈直径分别为 １４􀆰 １ ｍｍ 和 １３􀆰 ７ ｍｍꎬ而在含有灭
菌发酵液的 ＰＤＡ 平板上形成的抑菌圈直径稍大于
未灭菌发酵液ꎬ分别为 １５􀆰 ３ ｍｍ和 １５􀆰 ０ ｍｍꎬ但相同
菌种的不同发酵液处理及不同菌种的同一发酵液处
理之间均无显著差异ꎮ
菌落直径法测定的灭菌 ＬＢ￣１ 菌株发酵液对交
链孢菌和尖镰孢菌的抑菌率较低ꎬ分别为 ５􀆰 ９６％和
３３􀆰 ９０％ ꎬ但 ２ 种指示菌的菌落变薄ꎬ菌丝溶解明显
(图 ３￣Ａ、Ｂ)ꎻ未灭菌 ＬＢ￣１ 菌株发酵液对交链孢菌和
尖镰孢菌的抑菌率分别为 ４７􀆰 ８９％和 ４８􀆰 ７２％ ꎬ２ 种
指示菌的菌落也表现出了一定程度的溶解(图 ３￣Ｃ、
８０８ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
图 １ 菌株 ＬＢ￣１ 与指示菌对峙培养形成的菌落及
菌落交织面上菌丝的生长情况
Ｆｉｇ. １ Ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｏｎ ｄｕａｌ￣ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｐｌａｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ
ｏｆ ｈｙｐｈａｅ ａｔ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｗｏｖｅｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ＬＢ￣１
ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｆｕｎｇｉ
Ａ: ＬＢ￣１ 与交链孢菌ꎻ Ｂ: ＬＢ￣１ 与尖镰孢菌ꎻ Ｃ: ＬＢ￣
１ 与交链孢菌交织面的菌丝ꎻ Ｄ: ＬＢ￣１ 与尖镰孢菌交织
面的菌丝ꎮ Ａ: ＬＢ￣１ ａｎｄ Ａ. ｔｅｎｕｉｓꎻ Ｂ: ＬＢ￣１ ａｎｄ Ｆ. ｏｘｙｓ￣
ｐｏｒｕｍꎻ Ｃ: ｈｙｐｈａｅ ａｔ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｗｏｖｅｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ＬＢ￣１ ａｎｄ Ａ.
ｔｅｎｕｉｓꎻ Ｄ: ｈｙｐｈａｅ ａｔ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｗｏｖｅｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ＬＢ￣１ ａｎｄ Ｆ.
ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ.
　
Ｄ)ꎻ而对照组交链孢菌(图 ３￣Ｅ)和尖镰孢菌(图 ３￣
Ｆ)则生长正常ꎮ
２􀆰 ３ 生防菌的形态特征
菌株 ＬＢ￣１ 在 ＰＤＡ 平板上形成浅黄色菌落ꎬ气
生菌丝棉絮状ꎬ生长松散、茂盛(图 ４￣Ａ)ꎬ菌丝具有
明显隔膜ꎬ浅黄色(图 ４￣Ｂ)ꎮ 子囊果卵形ꎬ黑褐色ꎬ
附属丝较多ꎬ周生(图 ４￣Ｃ)ꎮ 与近缘毛壳菌 Ｃｈａｅｔｏ￣
ｍｉｕｍ ｓｕｂａｆｆｉｎｅ的形态特征相符ꎬ初步推断菌株 ＬＢ￣１
可能是近缘毛壳菌 Ｃ. ｓｕｂａｆｆｉｎｅꎮ
２􀆰 ４ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ序列特征及分类归属
真菌通用引物 ＩＴＳ１ / ＩＴＳ４ 对菌株 ＬＢ￣１ 基因组
ＤＮＡ扩增产物长度为 ５２７ ｂｐꎬＧｅｎＢａｎｋ 数据库同源
性比较发现ꎬ菌株 ＬＢ￣１ 与真菌中的毛壳菌属
Ｃｈｅａｔｏｍｉｕｍ的 ＩＴＳ 序列有 ９９％以上的同源性ꎮ 系
统发育树分析表明ꎬ菌株 ＬＢ￣１ 与近缘毛壳菌 Ｃ. ｓｕｂ￣
ａｆｆｉｎｅ(ＪＮ２０９９２９􀆰 １)亲缘关系最近(图 ５)ꎮ 结合菌
株 ＬＢ￣１ 在 ＰＤＡ 平板上的培养性状及形态学特征ꎬ
鉴定菌株 ＬＢ￣１ 为近缘毛壳菌Ｃ. ｓｕｂａｆｆｉｎｅꎮ
３ 讨论
毛壳菌属于子囊菌门核菌纲粪壳目毛壳菌科毛
图 ２ 抑菌圈法测定的 ＬＢ￣１ 菌株发酵液的抑菌作用
Ｆｉｇ. ２ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｌｉｑｕｉｄ ｏｆ ＬＢ￣１
ｓｔｒａｉｎ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄ
图中数据为平均数 ±标准差ꎮ 不同字母表示经 ＬＳＤ
法检验在 Ｐ < ０􀆰 ０５ 水平差异显著ꎮ Ｄａｔａ ａｒｅ ｍｅａｎ ± ＳＤ.
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ < ０􀆰 ０５
ｌｅｖｅｌ ｂｙ ＬＳＤ ｔｅｓｔ.
　
壳菌属的真菌(Ｋｉｒｋ ｅｔ ａｌ. ꎬ２００１)ꎮ 近年来的研究发
现一些毛壳菌具有很强的抑菌作用(Ｓｏｙｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ. ꎬ
２００１ꎻＩｓｔｉｆａｄａｈ ＆ ＭｃＧｅｅꎬ２００６ꎻ许秀兰等ꎬ２０１４)ꎮ 球
毛壳菌 Ｃ. ｇｌｏｂｏｓｕｍ是研究报道最多的生防毛壳菌ꎬ
对苹果黑星病菌 Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ(Ｃｕｌｌｅｎ ＆ Ａｎ￣
ｄｒｅｗｓꎬ１９８４)、尖镰孢菌(Ｗａｌｔｈｅｒ ＆ Ｇｉｎｄｒａｔꎬ１９８８)、
立枯丝核菌 Ｒｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ(陈刚等ꎬ２０１０)等有较
强的抑制作用ꎮ 此外ꎬ角毛壳菌 Ｃ. ｃｕｐｒｅｕｍ(谭悠久
等ꎬ２０１０)、螺旋毛壳菌 Ｃ. ｓｐｉｒａｌｅ(郭晓等ꎬ２００５)、近
缘毛壳菌 Ｃ. ｓｕｂａｆｆｉｎｅ(许秀兰等ꎬ２０１４)对植物病原
菌也有较强的抑制作用ꎮ 本研究从龙柏鳞叶小枝中
获得的生防菌株 ＬＢ￣１ 对植物病原真菌交链孢菌和
尖镰孢菌均具有较好的抑制作用ꎮ 结合形态学观察
及 ＩＴＳ序列分析ꎬ根据已报道的各种毛壳菌的形态
描述特征(Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ. ꎬ２００４ꎻ许秀兰等ꎬ２０１４)ꎬ鉴定
菌株 ＬＢ￣１ 为毛壳菌属 Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ中的近缘毛壳菌
Ｃ. ｓｕｂａｆｆｉｎｅꎮ
生防菌主要通过生存空间和营养竞争、分泌抗
性物质、溶菌作用、诱导植物产生抗病性、重寄生等
方式抑制植物病害 (牛赡光等ꎬ２００９ꎻ韦莹莹等ꎬ
２０１２ꎻ张瑾等ꎬ２０１４)ꎮ 目前已报道的生防毛壳菌抑
菌作用机制较多ꎬ但大多毛壳菌对植物病原菌的抑
制作用主要通过重寄生和产生毛壳素( ｃｈａｅｔｏｍｉｎ)
等抗生素起作用(刘晓光等ꎬ１９９９ꎻＡｇｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ. ꎬ
２００４ꎻ万慧等ꎬ２００７)ꎮ 本研究获得的 ＬＢ￣１ 菌株和交
链孢菌、尖镰孢菌的对峙培养过程中ꎬＬＢ￣１ 菌株的
９０８５ 期 刘彩云等: 一株生防内生真菌的分离筛选、鉴定及抑菌特性
图 ３ 两种指示菌在含有灭菌和未灭菌 ＬＢ￣１ 菌株发酵液的 ＰＤＡ平板上形成的菌落特征
Ｆｉｇ. ３ Ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｆｕｎｇｉ ｏｎ ＰＤＡ ｐｌａｔｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ
ａｎｄ ｎｏｎ￣ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ ｏｆ ＬＢ￣１ ｓｔｒａｉｎ
Ａ: 灭菌 ＬＢ￣１ 发酵液 ＋交链孢菌ꎻ Ｂ: 灭菌 ＬＢ￣１ 发酵液 ＋尖镰孢菌ꎻ Ｃ: 未灭菌 ＬＢ￣１ 发酵液 ＋交链孢菌ꎻ Ｄ: 未灭菌
ＬＢ￣１ 发酵液 ＋尖镰孢菌ꎻ Ｅ: 对照交链孢菌ꎻ Ｆ: 对照尖镰孢菌ꎮ Ａ: Ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ ＬＢ￣１ ＋ Ａ. ｔｅｎｕｉｓꎻ Ｂ: ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ ＬＢ￣１ ＋ Ｆ. ｏｘｙｓ￣
ｐｏｒｕｍꎻ Ｃ: ｎｏｎ￣ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ ＬＢ￣１ ＋ Ａ. ｔｅｎｕｉｓꎻ Ｄ: ｎｏｎ￣ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ ＬＢ￣１ ＋ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍꎻ Ｅ: Ａ. ｔｅｎｕｉｓꎻ Ｆ: Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ.
　
图 ４ 菌株 ＬＢ￣１ 在 ＰＤＡ平板上形成的菌落、菌丝及子囊果形态特征
Ｆｉｇ. ４ Ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｙꎬ ｈｙｐｈａｅ ａｎｄ ａｓｃｏｃａｒｐ ｏｆ ＬＢ￣１ ｓｔｒａｉｎ
Ａ: ＬＢ￣１ 菌落正面ꎻ Ｂ: ＬＢ￣１ 菌丝ꎻ Ｃ: ＬＢ￣１ 子囊果ꎮ Ａ: Ｃｏｌｏｎｙ ｏｆ ＬＢ￣１ꎻ Ｂ: ｈｙｐｈａｅ ｏｆ ＬＢ￣１ꎻ Ｃ: ａｓｃｏｃａｒｐ ｏｆ ＬＢ￣１.
　
图 ５ 基于 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ序列特征构建的菌株 ＬＢ￣１ 与其相关菌株的系统发育树
Ｆｉｇ. ５ Ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ＬＢ￣１ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｆｕｎｇｉ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
　
菌丝生长迅速ꎬ能够快速占据大部分培养空间ꎬ且
ＬＢ￣１ 菌株与指示菌的菌落交织处ꎬ指示菌的菌丝出
现了消解、断裂ꎬ而 ＬＢ￣１ 菌株的菌丝则生长正常ꎻ同
时ꎬ培养在含有 ＬＢ￣１ 发酵液的 ＰＤＡ 平板上的指示
０１８ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷
菌菌落变薄、菌丝溶解明显ꎮ 这表明菌株 ＬＢ￣１ 可能
通过竞争和溶菌作用对 ２ 种供试指示菌起作用ꎬ但
其产生溶菌作用的具体机制还有待深入探讨ꎮ
生防菌是植物病害生物防治的重要研发领域ꎮ
目前报道的生防菌较多ꎬ但能够在生产中推广应用
的却较少ꎮ 究其原因ꎬ除了生防菌活性成分在生产、
保存和施用过程中易受环境因子影响ꎬ优良生防菌
剂研制滞后外(韩长志ꎬ２０１５)ꎬ目前报道的生防菌
大多只作用于某种或者某一类植物病害(崔林等ꎬ
２００３ꎻ邓振山等ꎬ２００９ꎻ张斌等ꎬ２０１５)也是其重要原
因ꎮ 本研究对 ＬＢ￣１ 菌株进行筛选及抑菌特性检测
时ꎬ以本实验室保存的交链孢菌和尖镰孢菌为指示
菌ꎬ而这 ２ 种菌是常见的植物病原真菌ꎬ可引致多种
植物的叶枯、果腐及根部病害ꎮ 因此ꎬ本研究筛选的
ＬＢ￣１ 菌株是一种极具研发潜力的生防真菌ꎬ但其生
物学特性、发酵条件等还有待进一步研究ꎬ以促进其
生产研发应用ꎮ
参 考 文 献 (Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ)
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１１８５ 期 刘彩云等: 一株生防内生真菌的分离筛选、鉴定及抑菌特性
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ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌ: ａ
ｒｅｖｉｅｗ ａｒｔｉｃｌｅ. Ｆｕｎｇａｌ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ ７: １ － １５
Ｓｔｏｎｅ ＪＫꎬ Ｂａｃｏｎ ＣＷꎬ Ｗｈｉｔｅ ＪＦ. ２０００. Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ
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ｃｒｏｂｉａｌ ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ. Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ: Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｂｅｒꎬ ｐｐ. ３ － ２９
Ｓｕ Ｔꎬ Ｌｕ Ｍꎬ Ｚｈｏｕ Ｑꎬ Ｗａｎｇ Ｆꎬ Ｗａｎｇ ＧＦꎬ Ｘｉｅ ＧＬ. ２０１０. Ｅｖａｌｕａ￣
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ｂｉｏｖａｒｓ ｏｆ Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｃｔｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ.
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(３): ３３３ － ３３７
Ｔａｎ ＹＪꎬ Ｚｈｏｎｇ Ｊꎬ Ｚｈｏｕ ＪＹꎬ Ｔａｎ Ｈ. ２０１０. Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ￣
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(责任编辑:李美娟)
２１８ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４２ 卷