全 文 ：龙柏组织培养研究
张秀华 (山东城市建设职业学院，山东济南 250014)
摘要 ［目的］为龙柏的快速繁殖提供参考。［方法］用圆柏(对照材料)、龙柏的当年生幼嫩茎段为外植体，以 MS为基本培养基附加不
同浓度的激素对其进行诱导分化和增殖研究，筛选诱导芽分化、增殖的最佳激素组合。［结果］接种前，将圆柏和龙柏的外植体用浓度
75%乙醇浸泡 30 min，无菌水冲洗几次，用浓度0． 2%HgCl2 消毒5 min，无菌水洗5次，然后置于培养皿上沥干，消毒效果最好。在1 /2MS
+6-BA 0． 5 mg /L + NAA 0． 5 mg /L的培养基上，圆柏试管苗分化率最高，生长良好;在 1 /2MS + 6-BA 1． 5 mg /L + NAA 0． 5 mg /L的培养
基上，龙柏试管苗分化率最高，生长良好。在 MS +6-BA 1． 0 mg /L + NAA 0． 01 mg /L的培养基上，龙柏增殖效果最好。［结论］建立了龙
柏组织培养体系。
关键词 组织培养;龙柏;圆柏;繁殖
中图分类号 S188 + ． 1 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)24 －14548 －02
Study on the Tissue Culture of Sabina chinensis cv． Kaizuka
ZHANG Xiu-hua (Shandong Urban Construction Vocational College，Jinan，Shandong 250014)
Abstract ［Objective］ The reference for the rapid multiplication of Sabina chinensis cv． Kaizuka was provided through the experiment．
［Method］The tender stem sections of Sabina chinensis(CK)and Sabina chinensis cv． Kaizuka，as explants，were cultured in the medium MS
that was added with the different concentrations of hormone for the experiment in their induction and differentiation so that the best combination
of hormone for budding induction and its multiplication was selected． ［Result］The best sterilizing method of the tender stem sections of Sabina
chinensis(CK)and Sabina chinensis cv． Kaizuka was as follows:the explants were soaked in 75% alcohol for 30 minutes and washed with a-
septic water for many times，then，sterilized with 0． 2% HgCl2 for 5 minutes and washed with aseptic water for 5 times，and finally，naturally
dried in culture dish before their culturing． In the medium of 1 /2MS + 6-BA 0． 5 mg /L + NAA 0． 5 mg /L，Sabina chinensis grew well with the
highest differentiation rate． In the medium of 1 /2MS + 6-BA 1． 5 mg /L + NAA 0． 5 mg /L，Sabina chinensis cv． Kaizuka grew well with the bet-
ter differentiation rate． In the medium of MS + 6-BA1． 0 mg /L + NAA 0． 01 mg /L the multiplication of Sabina chinensis cv． Kaizuka plantlet
was best． ［Conclusion］The system of rapid multiplication of Sabina chinensis cv． Kaizuka was established．
Key words Tissue culture;Coniferous species;Sabina chinensis cv． Kaizuka;Propagation
作者简介 张秀华(1981 － ) ，女，山东聊城人，助教，硕士，从事园林植
物与观赏园艺研究，E-mail:xiuhua0604@ 163． com。
收稿日期 2011-04-11
龙柏为圆柏的枝变种，枝形洒脱自然，为园林常用的观
赏树种［1］。其种子繁殖形态不稳定，不能保持母本良好形
态，因此不常采用。园林中常采用扦插繁殖，但繁殖系数低。
笔者以圆柏为对照材料，对龙柏组织培养进行研究，旨在为
其快速繁殖提供参考。
1 材料与方法
1． 1 材料 供试植物材料为多年生圆柏、龙柏的当年萌发
枝(以圆柏为对照材料) ，于 2006年 3 月 16 日采自青岛农业
大学青岛校区体育场前绿地。
1． 2 方法
1． 2． 1 培养基设置。
1． 2． 1． 1 芽诱导培养基。试验所用基本培养基为 MS 培
养基。
圆柏和龙柏的芽诱导培养基均选用 1 /2MS培养基附加
蔗糖 3%，琼脂 0． 7%，水解乳蛋白 200 mg /L，NAA浓度恒定
为 0． 5 mg /L，6-BA 浓度设 6 个水平，分别为 0． 1、0． 3、0． 5、
1． 0、1． 5、2． 0 mg /L，pH调为 5． 8。
1． 2． 1． 2 芽增殖培养基。龙柏芽增殖以 MS为基本培养基，
附加蔗糖 3%，琼脂 0． 7%，水解乳蛋白 200 mg /L，NAA浓度
恒定为 0． 01 mg /L，6-BA浓度设 3 水平，分别为0． 5、1． 0、2． 0
mg /L，pH调为 5． 8。
1． 2． 1． 3 生根培养基。龙柏的生根培养以 1 /2MS为基本培
养基，附加蔗糖 20 g /L，IBA浓度为 1． 0 mg /L。
1． 2． 2 材料的预处理。去除所取的圆柏当年萌发枝针叶
(龙柏剪去大针叶) ，用自来水冲洗干净，圆柏切成 1． 0 ～
1． 5 cm长的小段，龙柏切成 1． 0 cm 左右的小段，再用洗衣
粉浸洗 5 min，用灭菌纱布罩住烧杯口并扎紧，在自来水下
冲洗 1 ～ 2 h。
1． 2． 3 消毒与接种。
1． 2． 3． 1 外植体最佳消毒时间的筛选。将圆柏和龙柏的外
植体在接种室内超净工作台上用浓度 75%乙醇浸泡 30 min，
无菌水洗 1 次(龙柏无菌水洗几次) ，再将外植体在浓度
0． 10%、0． 15%、0． 20%、0． 25%的 HgCl2 溶液中分别消毒 2、
4、6、8、10 min。再用无菌水冲洗 5 次，然后置于培养皿上沥
干备用。
1． 2． 3． 2 接种。将圆柏、龙柏的外植体分别接种于培养基
上。圆柏和龙柏每个水平分别接种 20瓶。
1． 2． 4 培养条件。将培养瓶放入培养室中培养，圆柏和龙柏
的培养条件相同。首先24 ℃暗培养7 d(试验中用黑塑料袋罩
住)，7 d后将塑料袋撤掉，光照长度及时间同日照长度及时间。
1． 2． 5 数据分析。该试验主要指标包括:
分化率 =(分化瓶数 /接种瓶数)×100% (1)
污染率 =(污染瓶数 /接种瓶数)×100% (2)
增殖率 =(出芽瓶数 /接种瓶数)×100% (3)
增殖系数 =(总芽个数 /接种瓶数)×100% (4)
2 结果与分析
2． 1 不同消毒时间对龙柏和圆柏外植体成活率的影响 试
验结果表明，龙柏和圆柏的外植体在消毒过程中当用浓度
0． 2%HgCl2 消毒 4 ～6 min时，效果最好。因此，试验中将其
外植体用浓度 0． 2%HgCl2 消毒 5 min，无菌水冲洗 5次，然后
置于培养皿上沥干备用。
2． 2 不同培养基对龙柏和圆柏芽诱导的影响
2． 2． 1 龙柏。芽的诱导与激素类型及浓度有关，不同的生
责任编辑 张杨林 责任校对 傅真治安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(24):14548 － 14549，14592
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.24.219
长调节物质及浓度对芽诱导效果有着极其显著的影响［2］。
龙柏在不同培养基上接种 18 d后，统计其生长状况，结果见
表 1。
由表 1 可知，培养基为 1 /2MS + 6-BA1． 5 mg /L + NAA
0． 5 mg /L时最有利于龙柏芽的生长。在该培养基上，接种
20 d左右，叶腋处萌出绿色小芽，部分茎段基部膨大。由结
果可看出，6-BA浓度不同对龙柏诱导效果有着极其显著的
影响。6-BA浓度在 0． 1 ～2． 0 mg /L范围内，分化率随着浓度
的增加而增高，当浓度为 1． 5 mg /L时分化率最大，达 70%;
而浓度高于 1． 5 mg /L，随着浓度的增加分化率下降，当浓度
为 2． 0 mg /L时分化率最低，仅为 30%。因此，6-BA浓度为
1． 5 mg /L时龙柏生长最好，分化率最高。
表 1 不同培养基对龙柏芽诱导的影响
Table 1 Effect of different media on shoot induction rate of Sabina chinensis cv． Kaizuka
编号
Serial number
培养基
Media
接种数
Inoculated
number∥瓶
分化数
Differentiation
count∥瓶
污染数
Pollution
number∥瓶
分化率
Differentiation
rate∥%
污染率
Pollution
rate∥%
1 1 /2MS +6-BA 0． 1 mg /L + NAA 0． 5 mg /L 20 8 1 40 5
2 1 /2MS +6-BA 0． 3 mg /L + NAA 0． 5 mg /L 20 6 2 30 10
3 1 /2MS +6-BA 0． 5 mg /L + NAA 0． 5 mg /L 20 8 0 40 0
4 1 /2MS +6-BA 1． 0 mg /L + NAA 0． 5 mg /L 20 9 0 45 0
5 1 /2MS +6-BA 1． 5 mg /L + NAA 0． 5 mg /L 20 14 4 70 20
6 1 /2MS +6-BA 2． 0 mg /L + NAA 0． 5 mg /L 20 6 2 30 10
2． 2． 2 圆柏。圆柏接种于不同培养基培养 18 d后，统计其
生长状况，结果见表 2。
由表 2 可知，当培养基为 1 /2MS + 6-BA 0． 5 mg /L +
NAA0． 5mg / L时最有利于圆柏生长。在该培养基上，接种
表 2 不同培养基对圆柏芽诱导的影响
Table 2 Effect of different media on shoot induction rate of Sabina chinensis
编号
Serial number
培养基
Media
接种数
Inoculated
number∥瓶
分化数
Differentiation
count∥瓶
污染数
Pollution
number∥瓶
分化率
Differentiation
rate∥%
污染率
Pollution
rate∥%
1 1 /2MS +6-BA 0． 1 mg /L + NAA 0． 5 mg /L 20 9 0 45 0
2 1 /2MS +6-BA 0． 3 mg /L + NAA 0． 5 mg /L 20 3 0 15 0
3 1 /2MS +6-BA 0． 5 mg /L + NAA 0． 5 mg /L 20 11 0 55 0
4 1 /2MS +6-BA 1． 0 mg /L + NAA 0． 5 mg /L 20 10 0 50 0
5 1 /2MS +6-BA 1． 5 mg /L + NAA 0． 5 mg /L 20 7 0 35 0
6 1 /2MS +6-BA 2． 0 mg /L + NAA 0． 5 mg /L 20 5 0 25 0
18 d左右，叶芽处即萌出约 2 mm长的绿色小芽，部分茎段基
部膨大，产生淡黄绿色的愈伤组织。30 d后转入同样的培养
基中继代培养，在愈伤组织上又有绿色小芽点出现。试验表
明，6-BA浓度不同对圆柏幼芽诱导效果有着极其显著的影
响。对圆柏来说，6-BA浓度在 0． 1 ～ 2． 0 mg /L范围内，分化
率随着浓度的增加而提高，当 6-BA 浓度为 0． 5 mg /L 时，分
化率最大，达 55%;而浓度高于 0． 5 mg /L 时，分化率下降。
这可能是因为 6-BA浓度大了反而抑制茎段分化的缘故。因
此，圆柏在 6-BA浓度为 0． 5 mg /L时生长最好，分化率最高。
该试验结果中圆柏芽诱导的 6-BA最适浓度与四川农业大学
林学园艺学院的辜夕容等研究结果［3］相同。
在圆柏和龙柏芽诱导试验中，所选外植体部位及采集时
间和生长调节物质相同的情况下，其诱导效果有着明显的不
同，这再次证明不同树种对培养基的适应性不尽相同，应用
时应针对不同树种具体调配［4］。
2． 3 不同培养基对龙柏无菌苗增殖的影响 在增殖过程
中，合适的生长调节物质及其组合，可以大大提高增殖数量，
扩大繁殖系数。当龙柏试管苗节间明显伸长，有部分针叶能
切割节段时进行继代增殖。试验结果表明，生长调节物质对
龙柏无菌试管苗的增殖起着重要作用，在含有生长调节物质
的培养基上，出现了不同程度的分化与生长。当 NAA 浓度
为 0． 01 mg /L时，不同的 6-BA 浓度对幼苗增殖率及增殖系
数都有明显的影响。6-BA 浓度为 1． 0 mg /L 时，增殖率为
77%，增殖系数达 3． 2，比浓度为 0． 5 mg /L时增加了 1． 6，比
浓度为 1． 5 时增加了 1． 2(表 3)。说明 6-BA 浓度由 0． 5
mg /L增至 1． 00 mg /L，随着浓度的增加龙柏无菌试管苗的增
殖系数增加，而当 6-BA浓度大于 1． 0 mg /L时对幼苗的增殖
有抑制作用。因此，龙柏增殖的最适培养基是 MS + 6-BA
1． 00 mg /L + NAA 0． 01 mg /L。
表 3 不同培养基对龙柏无菌苗增殖的影响
Table 3 Effect of different media on the proliferation of Sabina chinensis cv． Kaizuka
编号
Serial number
培养基
Media
接种数
Inoculated
number∥瓶
出芽数
Budding
number∥瓶
总芽数
Total budding
number∥个
增殖率
Rate of
reproduction∥%
增殖系数
Multiplication
coefficient
1 MS +6-BA 0． 5 mg /L + NAA 0． 01 mg /L 15 9 24 60 1． 6
2 MS +6-BA 1． 0 mg /L + NAA 0． 01 mg /L 13 10 42 77 3． 2
3 MS +6-BA 1． 5 mg /L + NAA 0． 01 mg /L 10 6 20 60 2． 0
2． 4 诱导生根和移栽 当试管苗节间明显伸长，有部分针 (下转第 14592页)
9454139 卷 24 期 张秀华 龙柏组织培养研究
2． 3 回收率 试验结果表明，大黄素的加样回收率为
99． 16%，RSD% =1． 49。说明该方法准确、可靠，可用于扛板
归中大黄素的提取与含量测定。
2． 4 大黄素含量的正交试验结果 正交试验表与数据见
表 3。
表 3 扛板归中大黄素的正交试验结果
Table 3 Orthogonal experimental results of emodin in Polygonum per-
foliatum L．
试验号
Exper-
iment No．
A B C
大黄素的含量
Content of emodin
μg /g
1 1 1 1 21． 772
2 1 2 2 22． 072
3 1 3 3 24． 228
4 2 1 2 26． 085
5 2 2 3 27． 390
6 2 3 1 25． 014
7 3 1 3 25． 449
8 3 2 1 24． 370
9 3 3 2 26． 014
k1 68． 072 73． 306 71． 156
k2 78． 489 73． 832 74． 171
k3 75． 833 75． 256 77． 067
max 78． 489 75． 256 77． 067
min 68． 072 73． 306 71． 156
R 10． 417 1． 950 5． 911
注:针对每个因素，k值最大的那个水平为该因素的最优水平。其中
针对每个因素:kij指 j个因素第 i个水平的所有试验结果指示值的
总和;R(极差)为:max-min。
表 3中 k1，k2，k3，表示每个因素所进行的 3次试验，所得
的扛板归中大黄素的总和，即代表因素 A(乙醇含量)的第一
列中，与水平 1对应的 1，2，3，中的大黄素含量的总和。其他
依上法类推，R为总含量的极差(即 k 中总和最大值减去总
和最小值) ，R值越大说明该因素对扛板归中大黄素提取的
影响越大。
由试验结果可知，扛板归中的大黄素提取最优工艺条件
为:A因素乙醇的浓度为 80%;B因素乙醇的用量为 35 ml;C
因素提取时间为 2 h。由 Rj 值可以看出，影响扛板归中大黄
素的提取因素主次顺序为:乙醇含量 ＞提取时间 ＞乙醇用
量，最优水平组合为 A2B3C3。既乙醇浓度为 80%，乙醇用量
为 35 ml，提取时间为 2 h。
3 小结
根据蒽醌类化合物易溶于乙醇的性质，用乙醇加热回流
提取出绝大部分蒽醌类化合物，再用氯仿萃取提取出蒽醌类
化合物，且除去无效成分和杂质。但提取工艺的不同，可能
会影响蒽醌类化合物的产出率，故用正交试验优化提取工
艺。试验结果表明，提取所用的乙醇含量是最主要的影响因
素，最优水平为 A2B3C3。综合因素考虑，建议在实际工作中
采用 A2B3C3。这样既能保证出产率，又提高了生产效率。
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檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
17 －19．
(上接第 14549页)
叶能切割节段时进行壮苗培养。壮苗培养基为不添加生长
调节剂的 MS培养基。经壮苗培养，无根健壮小苗在生根培
养基 1 /2MS + IBA1． 00 mg /L +蔗糖 20 g /L上生根。
3 结论与讨论
(1)外植体的预处理至关重要，对外植体的诱导有很大
的影响。该试验在对圆柏的预处理过程中，针叶完全处理
掉，然后用自来水冲洗干净，切成 1． 0 ～ 1． 5 cm长的小段，再
用洗衣粉浸洗 5 min，用灭菌纱布罩住烧杯口并扎紧，在自来
水下冲洗 1 ～2 h。这样处理后污染率为 0，分化率也低(外植
体部分被杀死)。处理龙柏时只把大针叶处理掉，切取的外
植体比圆柏稍短一些(约 1 cm) ，然后用与圆柏相同的处理
方法，结果表明，污染率高(最高可达 20%) ，而相对来说分
化率也高。用短的外植体进行接种比用长的外植体污染率
低，所以建议在以后进行外植体的预处理时不能损伤外植体
但可适当缩短外植体的长度。
(2)在圆柏的芽诱导过程中，以 MS为基本培养基，采用
NAA浓度 0． 5 mg /L和 6-BA浓度 0． 5 mg /L配合，分化率最
高，达 55%;在龙柏的芽诱导过程中以 MS为基本培养基，采
用 NAA浓度为 0． 5 mg /L和 6-BA浓度 1． 5 mg /L配合，分化
率最高，达 70%。
(3)在龙柏增殖培养中，以 MS为基本培养基，采用 NAA
浓度0． 01 mg /L和6-BA浓度1． 0 mg /L配合，增殖效果最好。
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29541 安徽农业科学 2011年