全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2012，24:16-19
文章编号:1001-6880(2012)01-0016-04
收稿日期:2011-03-28 接受日期:2011-06-30
* 通讯作者 Tel:86-531-86080261;E-mail:zhongliny@ 163． com
龙柏乙酸乙酯萃取物抑菌活性成分的分离与鉴定
王海红，袁忠林* ，罗 兰，郝明亮
青岛农业大学，青岛 266109
摘 要:采用活性追踪法和柱层析法，以苹果腐烂病菌、葡萄白腐病菌等作为供试菌种，从龙柏乙醇提取物的乙
酸乙酯萃取物中分离得到抑菌活性成分。结果表明，在供试浓度为 2 mg /mL时，龙柏乙酸乙酯萃取物对 6 种植
物病菌均有一定的抑制作用，其中对苹果腐烂病菌和葡萄白腐病菌抑菌活性最好，抑菌率分别为 83． 06%和
78. 87%。其活性成份桧脂素对苹果腐烂病菌、葡萄白腐病菌、小麦赤霉病菌、葡萄黑痘病菌、苹果轮纹病菌和黄
瓜枯萎病菌的 EC50分别为 0． 38、0． 18、0． 47、0． 59、0． 70 mg /mL和 1． 94 mg /mL。
关键词:龙柏;抑菌活性;柱层析;桧脂素
中图分类号:R284. 2 文献标识码:A
Isolation and Identification of Antifungal Components from Juniperus
chinensis cv． Kaizuca with Ethyl Acetate
WANG Hai-hong，YUAN Zhong-lin* ，LUO Lan，HAO Ming-liang
Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China
Abstract:Antifungal components，which isolated from ethanol extract of Juniperus chinensis cv． Kaizuca with ethyl ace-
tate，were tested against Valsa mali，Coniothyrium diplodiella，and so on，based on bioassay-guided method． The results
showed that ethyl acetate extracts of J． chinensis had certain inhibition effects to all tested fungi，and the best inhibition
rates against V． mali and C． diplodiella were 83． 06% and 78． 87% at 2 mg /mL，respectively． The EC50 of the active
component Savinin against V． mali，C． diplodiella，Gibberella zeae，Elsinoe ampelina，Physalospora piricola and Fusarium
oxysporum were 0． 38，0． 18，0． 47，0． 59，0． 70 mg /mL，and 1． 94 mg /mL，respectively．
Key words:Juniperus chinensis cv． Kaizuca;antifungal activity;column chromatography;savinin
龙柏(Juniperus chinensis cv． Kaizuca)属于裸子
植物，柏科(Cupressaceae)圆柏属(Juniperus) ，为圆
柏(桧)的变种，其萌芽力强、耐腐朽、耐修剪，是长
江流域重要的园林绿化树种。研究结果表明，龙柏
精油对土耳其扁谷盗和小菜蛾具有明显的熏蒸效
果［1，2］，在一定范围内对双条杉天牛触角电位
(EAG)反应的强度与剂量呈正相关，且雌虫的 EAG
反应强于雄虫［3］。龙柏叶提取物对多种食品微生
物及植物病原真菌表现出显著的抑菌作用［4-6］。龙
柏水提取物具有一定的杀草活性［7］。牛新威等［8］
采用活性追踪法，从龙柏茎叶乙醇提取物的石油醚
萃取物中分离得到了 4-松香酸，其对苹果腐烂病菌
的 EC50为 0． 8624 mg /mL。从上述文献中可看出，龙
柏茎叶中具有生物活性物质，乙醇提取物的乙酸乙
酯萃取物也具有较强的抑菌活性，但尚未对其进行
进一步研究。本研究在此基础之上，对龙柏乙醇提
取物的乙酸乙酯萃取物进行了进一步的分离和抑菌
活性测定，为充分挖掘龙柏中的农用抑菌活性成分
奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料与仪器
龙柏乙醇提取物采用文献［8］方法制备，冰箱低
温保存，备用。苹果腐烂病菌(Valsa mali)、苹果轮
纹病菌(Physalospora piricola)、葡萄黑痘病菌(Elsi-
noe ampelina)、葡萄白腐病菌(Coniothyrium dipl-
odiella)、小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)、黄瓜枯萎
病菌(Fusarium oxysporum)由青岛农业大学农学与
植物保护学院农药学教研室提供。
乙醇、石油醚(沸程 60 ～ 90 ℃)、乙酸乙酯、氯
仿、甲醇均为市售分析纯。薄层层析硅胶(GF254)、
柱层析硅胶(200 ～ 300 目)购自青岛海洋化工厂。
WRS-1B数字熔点仪、Finnigan MAT90 质谱仪、
Bruker AV-500 核磁仪(以 CDCl3 为溶剂)。
1． 2 萃取物的制备
将龙柏乙醇提取物加入适量蒸馏水，制成悬浮
液，放入分液漏斗内依次加乙酸乙酯进行液-液萃
取，重复多次，合并萃取液，对乙酸乙酯萃取液进行
减压蒸馏，冷冻干燥，获得乙酸乙酯萃取物。
1． 3 抑菌活性测定
1． 3． 1 生长速率法
用生长速率法测定乙酸乙酯的抑菌活性［8-10］。
将乙酸乙酯萃取物用乙酸乙酯配成 0． 2 g /mL 的药
液，取 1 mL药液加到 100 mL 经灭菌的 60 ℃ PDA
培养基中，充分摇匀，以含相等体积乙酸乙酯的
PDA培养基为对照，然后倒入直径为 60 mm培养皿
内制成平板。待培养基凝固后，在平板中央接种已
制备好的供试病原菌菌饼(直径为 4 mm) ，处理和
对照各重复 3 次。置于 26 ℃恒温培养箱中培养，待
对照菌落直径为培养皿直径的 3 /4 左右时，采用十
字交叉法测定菌落直径，用下式求出抑制率:
纯生长量(mm)=菌落直径–菌饼直径(4 mm)
抑菌率(%)=
对照组纯生长量 －处理组纯生长量
对照组纯生长量
× 100%
1． 3． 2 滤纸片法［11］
用滤纸片法测定乙酸乙酯柱层析各流分的抑菌
活性。准备直径为 4 mm的圆形滤纸片若干，灭菌。
用灭菌镊子夹取灭菌滤纸片分别放入柱层析的各流
份液中浸泡 1 min，取出后在无菌条件下自然风干，
备用。制备直径为 60 mm的 PDA平板培养基，每皿
培养基约 20 mL待其凝固后，用镊子夹取已风干的
滤纸片放在 PDA平板上，每皿放 4 片，呈正四边形，
滤纸片中心距菌落中心 2 cm。在平板中央接种已
制备好的供试病原菌菌饼(直径为 4 mm) ，放入培
养箱中，26 ℃恒温培养箱中倒置培养 2 ～ 7 d后观察
抑菌带的有无及大小。抑菌带距离大于 3 mm 为强
抑菌作用(+ + +) ，1 ～ 3 mm 为中强抑菌作用(+
+) ，小于 1 mm为弱抑菌作用(+) ，不产生抑菌带
为无抑菌作用(－)。
1． 4 抑菌活性物质的分离与鉴定
用 200 ～ 300 目的硅胶 1600 g 为吸附剂柱层
析，74． 7 g萃取物用氯仿溶解后上样;用氯仿∶ 甲醇
混合液(100∶ 1、50∶ 1、25∶ 1、10∶ 1、5∶ 1、2∶ 1、1∶ 1)及甲
醇梯度洗脱。采用等份法接样，经薄层层析(TLC)
检测后，合并相同的组份，得到不同的流分，对各流
分采用滤纸片法进行抑菌活性测定和减压浓缩。对
抑菌效果好、样品量较多的流份经 ODS 柱进行进一
步的纯化分离，得到纯净化合物，并对其抑菌活性采
用生长速率法进行测定并结构鉴定。
2 结果分析
2． 1 龙柏乙酸乙酯萃取物对 6 种植物病原菌的抑
制作用
龙柏乙酸乙酯萃取物对苹果腐烂病菌、葡萄白
腐病菌、小麦赤霉病菌、葡萄黑痘病菌、苹果轮纹病
菌、黄瓜枯萎病菌的抑制作用见表 1。
表 1 龙柏乙酸乙酯萃取物对 6 种植物病原菌的抑制作用
(2 mg /mL)
Table 1 The inhibition effects of J． chinensis ethyl acetate ex-
tract against 6 kinds of plant pathogenic fungi (2 mg /
mL)
植物病原菌
Plant
pathogenic
fungi
对照平均
直径(mm)
Average
diameter
of control
处理平均
直径(mm)
Average
diameter
of treatments
抑菌率(%)
Inhibition
rate
苹果腐烂病菌(V． mali) 41． 5 11． 8 83． 06 ± 0． 97
葡萄白腐病菌(C． diplodiella) 60． 0 15． 8 78． 87 ± 1． 76
小麦赤霉病菌(G． zeae) 60． 0 22． 2 67． 56 ± 1． 76
葡萄黒痘病菌(E． ampelina) 52． 0 17． 5 71． 88 ± 0． 97
苹果轮纹病菌(P． piricola) 48． 0 17． 0 70． 51 ± 2． 92
黄瓜枯萎病菌(F． oxysporum) 48． 8 27． 7 47． 21 ± 0． 92
由表 1 可知，当乙酸乙酯萃取物浓度为 2 mg /
mL时，对苹果腐烂病菌、葡萄白腐病菌、小麦赤霉病
菌、葡萄黒痘病菌、苹果轮纹病菌和黄瓜枯萎病菌的
抑制率分别为 83． 06%、78． 87%、67． 56、71． 88%、
70． 51%和 47． 21%。其中对苹果腐烂病菌和葡萄
白腐病菌的抑制效果最好，对黄瓜枯萎病菌的抑制
效果较差。
2． 2 龙柏乙酸乙酯萃取物对 6 种植物病原菌的毒
力作用
龙柏乙酸乙酯萃取物对苹果腐烂病菌、葡萄白
腐病菌、小麦赤霉病菌、葡萄黑痘病菌、苹果轮纹病
菌和黄瓜枯萎病菌的毒力作用如表 2。
由表 2 可知，乙酸乙酯萃取物对苹果腐烂病菌、
葡萄白腐病菌、小麦赤霉病菌、葡萄黑痘病菌、苹果
轮纹病菌和黄瓜枯萎病菌的 EC50分别为 0． 67、1．
96、1． 39、1． 14、1． 24 mg /mL和 3． 16 mg /mL。对苹
71Vol. 24 王海红等:龙柏乙酸乙酯萃取物抑菌活性成分的分离与鉴定
表 2 龙柏乙酸乙酯萃取物对 6 种植物病原菌的毒力作用
Table 2 The toxicity of J． chinensis ethyl acetate extraction a-
gainst 6 kinds of plant pathogenic fungi
植物病原菌
Plant pathogens
毒力回归方程
Toxicity regression
equation
相关系数(r)
Correlation
coefficient (r)
有效中
浓度(mg /mL)
EC50
苹果腐烂病菌
(V． mali) y = 1． 3437x + 5． 2309 0． 9870 0． 67
葡萄白腐病菌
(C． diplodiella) y = 1． 0769x + 4． 6843 0． 9947 1． 96
小麦赤霉病菌
(G． zeae) y = 1． 0950x + 4． 8450 0． 9752 1． 39
葡萄黒痘病菌
(E． ampelina) y = 1． 1000x + 4． 9360 0． 9950 1． 14
苹果轮纹病菌
(P． piricola) y = 0． 9370x + 4． 9120 0． 9940 1． 24
黄瓜枯萎病菌
(F． oxysporum) y = 0． 9540x + 4． 5230 0． 9884 3． 16
果腐烂病菌的抑制作用最强，对葡萄黑痘病菌的抑
制作用次之，对黄瓜枯萎病菌的抑制作用较差。虽
然由表 1 看出在浓度为 2 mg /mL 时，龙柏乙酸乙酯
萃取物对葡萄白腐病菌的抑制作用好于对小麦赤霉
病菌、葡萄黑痘病菌和苹果轮纹病菌的抑制作用，但
毒力测定结果却相反，毒力测定的 EC50更能体现萃
取物的抑菌效果。
2． 3 龙柏乙酸乙酯萃取物不同流分的抑菌活性
龙柏乙酸乙酯萃取物经柱层析共得到 18 个流
分，滤纸片法抑菌活性测定结果表明，流分 7(洗脱
剂比例:氯仿∶甲醇为 10∶ 1，85． 6 mg)和流分 8(氯仿
∶甲醇为 10∶ 1，34． 6 mg)对 6 种病原菌均有强抑制
作用;流分 9(氯仿∶甲醇为 10∶ 1，31． 9 mg)对苹果腐
烂病菌为中强抑制作用，对葡萄白腐病菌有弱抑制
作用;流分 11(氯仿∶甲醇为 10∶ 1，35． 7 mg)对苹果
腐烂病菌、葡萄白腐病菌、葡萄黑豆病菌有中强抑制
作用。因流分 8 样品量比较少，本试验对抑菌作用
较强的流分 7 进行纯化分离。用石油醚∶ 乙酸乙酯
(10∶ 1、7∶ 1、5∶ 1、2∶ 1、1∶ 1)和乙酸乙酯梯度脱洗，在
石油醚∶乙酸乙酯(5∶ 1)得到化合物 A(12． 9 mg)。
2． 4 化合物 A的活性测定
化合物 A 对 6 种植物病原菌的毒力测定结果
见表 3。由表 3 可知，化合物 A对苹果腐烂病菌、葡
萄白腐病菌、小麦赤霉病菌、葡萄黑痘病菌、苹果轮
纹病菌和黄瓜枯萎病菌的 EC50分别是 0． 38、0． 18、
0． 47、0． 59、0． 70 mg /mL 和 1． 94 mg /mL，其中对葡
萄白腐病菌的抑制作用最好，对黄瓜枯萎病菌的抑
制作用最差。
表 3 化合物 A对 6 种植物病原菌的抑制作用
Table 3 The inhibition effects of compound A against 6 phyto-
pathogens
植物病原菌
Plant pathogens
毒力回归方程
Toxicity regression
equation
相关系数(r)
Correlation
coefficient (r)
有效中浓度
(mg /mL)
EC50
苹果腐烂病菌
(V． mali) y = 1． 5689x + 5． 6577 0． 9909 0． 38
葡萄白腐病菌
(C． diplodiella) y = 1． 1595x + 5． 8749 0． 9764 0． 18
小麦赤霉病菌
(G． zeae) y = 0． 6368x + 5． 2069 0． 9986 0． 47
葡萄黒痘病菌
(E． ampelina) y = 0． 6580x + 5． 2290 0． 9985 0． 59
苹果轮纹病菌
(P． piricola) y = 0． 6070x + 5． 1580 0． 9874 0． 70
黄瓜枯萎病菌
(F． oxysporum) y = 1． 0490x + 4． 6970 0． 9654 1． 94
2． 5 化合物 A的结构鉴定
化合物 A 为白色晶体(丙酮) ，m． p． 146 ～ 147
℃，分子式 C20H16O6;ESI-MS (m/z) :353［M + H］
+，
375［M + Na］+，727［2M + Na］+，表明其相对分子质
量为 352。IR (KBr)νmax:3070(= C-H) ，2913(-C-
H) ，1735(六元环内酯 C = O) ，1640(C = C) ，1599、
1580、1503、1437(苯环) ，1030、918(五元环 C-O) ，
827(= C-H)。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:7． 50
(1H，s，H-7) ，7． 08(1H，d，J = 8． 0 Hz，H-6) ，7． 05
(1H，s，H-2) ，6． 88(1H，d，J = 8． 0 Hz，H-5) ，6． 74
(1H，d，J = 8． 0 Hz，H-6) ，6． 67(1H，s，H-2) ，6． 64
(1H，d，J = 8． 0 Hz，H-5) ，6． 05(2H，s，H-10) ，5． 94
(2H，s，H-10) ，4． 25(2H，dd，J = 9． 0 Hz，H-9) ，
3. 74(1H，m，J = 2． 0 Hz，H-8) ，2． 59(2H，dd，J =
10． 0 Hz，H-7)。13 C NMR(CDCl3，125 MHz) δ:
172. 5(s，C-9) ，149． 2(s，C-3) ，148． 4(s，C-4) ，148． 0
(s，C-3) ，146． 6(s，C-4) ，137． 3(d，C-7) ，131． 5(s，
C-1) ，128． 3(s，C-1)、126． 1(s，C-8) ，122． 1(d，C-
6) ，125． 9(d，C-6) ，109． 2(d，C-5) ，108． 8(d，C-
2) ，108． 7(d，C-2) ，108． 5(d，C-5) ，101． 8(t，C-
10) ，101． 1(t，C-10) ，，69． 5(t，C-9) ，40． 0(d，C-8) ，
图 1 化合物 A的结构
Fig. 1 Structures of compound A
81 天然产物研究与开发 Vol. 24
37. 6(t，C-7) ，化合物 A的各种理化、波谱数据与文
献［12］报道的一致，由此推断化合物 A 为桧脂素
(Savinin)。
3 讨论
本研究通过活性追踪法从龙柏茎叶中分离出一
种抑菌活性成分桧脂素，它是木脂素类化合物，属于
二芳基丁内脂类。该化合物能溶于苯、氯仿、乙酸乙
酯、乙醚、乙醇等溶剂，在石油醚中溶解度极小，难溶于
水，少数与糖结合成苷，水溶性增大，易被酶或酸水解。
桧脂素存在于柏科、杉科、五加科、爵床科、芸香
科、伞形科、玄参科、蝶形科等植物体中，具有肠道驱
虫、治疗风湿、通经活络和杀虫剂增效剂等功效［13］。
此外，桧脂素还具有抑菌作用、具有强的杀死精子和
杀虫活性［14，15］，对细胞色素 3A4 具有钝化作用［16］。
Lee 等［17，18］研究表明桧脂素对前列腺素、雌激素活
性具有抑制作用。Wen 等［19］研究结果表明桦木酸
(Betulinic acid)和桧脂素对 SARS-CoV 具有竞争抑
制作用。
目前，国内在桧脂素的研究报导方面还比较少。
虽然国外在桧脂素的分离鉴定、作用对象、作用方式
等方面有一定的研究，但目前尚未用于农作物植物
病原菌的研究。本研究为进一步开发利用桧脂素奠
定了基础。
致谢:感谢青岛科技大学张玉冰、于永良、钟惠
民副教授，青岛农业大学化学学院吕海涛教授、孙家隆
副教授在化合物结构鉴定方面给予的指导和帮助。
参考文献
1 Zeng JD(曾建德)． Fumigationaction of essential oil from Ju-
niperus chinensis cv． Kaizuca against Cryptolestes turcicus
(Grouville)． J Xiangtan Norm Coll，Nat Sci(湘潭师范学院
学报，自科版) ，2007，29:124-126．
2 Zhao XY(赵晓燕) ，Hou YM(侯有明)． Bioactivity of the
essential oil from Juniperus chinensis cv． Kaizuca against dia-
mondback moth(Plutella xylostella (L．)． Chin Bull Entomol
(昆虫知识) ，2006，43:57-60．
3 Hao DJ(郝德君) ，Wang Y(王焱) ，Ma FL(马凤林)． Com-
pounds in the essential oil from branches of Sabina chinensis
and their effects on Semanotus bifasciatus． Nat Prod Res Dev
(天然产物研究与开发) ，2008，20:600-603．
4 Li CR(李传仁) ，Yan ZK(严赞开)． Bactriostasis on food
bacteria of the extracts from Juniperus chinensis cv． Kaizuca．
J Anhui Agric Sci(安徽农业科学) ，2005，33:294-299．
5 Jiang JH(蒋继宏) ，Li XC(李晓储) ，Chen FM(陈凤美) ，et
al． Inhibition of plant extracts against Glomerella cingulata
conidia． J Jiangsu Forest Sci Technol(江苏林业科技) ，
2004，31:23-25．
6 Niu XW(牛新威) ，Luo L(罗兰) ，Yuan ZL(袁忠林) ，et
al． Inhibition of crude extracts of Juniperus chinensis cv． Kai-
zuca stems and leaves on plant pathogenic fungi． Inner Mon-
golia Agric Sci Technol(内蒙古农业科技) ，2008，4:57-58．
7 Luo L(罗兰) ，Yuan ZL(袁忠林) ，Hao ML(郝明亮) ，et
al． Bioassay of herbicidal activity of water extract from
branch and leaf of Sabina chinensis Kaizuca and its parti-
tioned extracts． J Plant Resour Environ(植物资源与环境学
报) ，2010，19:50-55．
8 Niu XW(牛新威) ，Luo L(罗兰) ，Yuan ZL(袁忠林) ，et
al． Isolation and identification of antifungal components from
Jumiperus chinensis cv． Kaizuca． Acta Bot Bor-Occid Sin(西
北植物学报) ，2009，29:2326-2330．
9 Mu LY(慕立义)． Research Method of Plant Chemical Pro-
tection(植物化学保护研究方法)． Beijing:China Agricul-
ture Press，1994．
10 Chen NC(陈年春)． Technique of Pesticide Bioassay(农药
生物测定方法)． Beijing:Beijing Agricultural University
Press，1991． 176-781．
11 Zhang J(张佳) ，Wang Y(王莹) ，Zhang F(张峰) ，et al．
Mensurating the antiseptic activity of extracts from Artemisia
annua L． to mold with the filter paper method． Hubei Agric
Sci(湖北农业科学) ，2009，48:1153-1154．
12 Rossi R，Bellina F，Bechini C，et al． A new Stereocontrolled
synthesis of the racemic forms of savinin and gadain． Synthe-
sis，1997，9:1061-1066．
13 Baxter H，Harborne JB，Moss GP． Phytochemical Dictionary:
A Handbook of Bioactive Compounds from Plants，2nd Ed．
CRC Press，1999．
14 Chang ST，Wang SY，Wu CL，et al． Antifungal ccompounds in
the ethyl acetate soluble fraction of the extractives of Taiwan-
ia(Taiwania cryptomerioides Hayata) heartwood． Holzfors-
chung，1999，53:487-490．
15 Nissanka AP，Karunaratne V，Bandara BM，et al． Antimicro-
bial alkaloids from Zanthoxylum tetraspermum and cauda-
tum． Pytochemistry，2001，56:857-861．
16 Yoo HH，Lee SH，Jin C，et al． Mechanism-based inactivation of
cytochrome P450 3A4 by methylenedioxyphenyl lignans from
Acanthopanax chiisanensis． Planta Med，2008，74:822-827．
17 Lee S，Ban HS，Kim YP，et al． Lignans from Acanthopanax
chiisanensis having an inhibitory activity on prostaglandin E2
production． Phytother Res，2005，19:103-106．
18 Lee S，Yoo HH，Piao XL，et al． Anti-estrogenic activity of lig-
nans from Acanthopanax chiisanensis root． Arch Pharm Res，
2005，28:186-189．
19 Wen CC，Kuo YH，Jan JT，et al． Specific plant terpenoids and
lignoids possess potent antiviral activities against severe a-
cute respiratory syndrome coronavirus． J Med Chem，2007，
50:4087-4095．
91Vol. 24 王海红等:龙柏乙酸乙酯萃取物抑菌活性成分的分离与鉴定