全 文 ：U L L BE [ TNO F BO T人 N A I C LRES E A R CH
第 1卷 , 第 3 期
V o l
, 1 1 , N o
,
3
1 9 9 1年 7 月
J “ l了 , 一。。 1
软枣称猴桃悬浮细胞系的建立及其影响因素
张 喜 春 吴 绛 云
E S T AB LISHM E N T O F SU S P EN S IO N C EL L L IN E O F
G OO S EB E RR Y AN D IN F L U EN C E AB L E F AC T O R S
Z h a n g X i
一 e h u n W
u J i a n g
一
y u n
卜
〔提要〕 以软枣赫很桃 ( A c : i n i d i a a r g u r a p l a n c h ) 叶片为试 材 , 以 M S
为基本培养基 , 附加生长素 (2 . 4 一 D 、 N A A ) 和玉 米紊 ( Z T ) 成功地诱 导 出
愈伤组织 , 结果表明 : 软枣称猴桃叶片在 M S一 z T 1 m g l/ + 2 . 4 二 D盖3m g夕1的
情况下 能诱导 出适合于建立慈浮细胞系的愈伤纽织 。 并研究 了愈伤组织生长年
龄 、 激素浓度 、 机醉和蔗箱浓度四个方面对建立慈浮细胞 系的影响 。 表明愈伤
组织以生长 10 天时接种活细胞率最高 , 以 M S 培养基附加 Z T l m g l/ + 2 . 4 一 D 3
m g l/ 较好 ,肌醉以 2 0 0二 g l/ 伺形细胞须率泛 高 ; 蔗格 以 5 %最适 。
前 宫
软枣称猴桃 ( A c r i n i d i a a r g u r a p l a n c几) 为落叶藤本植 物 , 属 称 猴桃 科 、 称 猴
桃属。 果实可生食 , 也可加工成果酱等 。 而且其根 、 茎 、 叶均有一定的药理作用 。 也是
园林中垂直绿化的好材料 。 因此 , 称猴桃具有很高的综合利用价值 , 应积极开展称猴桃
的科研工作 。 1 9 7 5年 H ar a da 首先报导了中华称猴桃的器官培养 , 形成芽 、 根和球形胚
。 我国学者桂耀林 〔 6 〕〔 7 〕、 黄贞光〔 8 〕、 洪树荣〔 5 〕、 匡安秀〔 2 〕、 王际轩 、 余师珍 等 分
别对称猴桃的茎段 、 胚乳 、 带叶顶芽 、 子叶和叶片等进行了研究 。 均已获得再生植株 。
iG l be
r ot 等报导 : 意大利已运用组织培养方法进行了称猴桃苗木的工厂化繁殖 。 但是 ,
迄今为止 , 国内外还未见软枣称猴桃细胞悬浮培养方面的研究报导 。
材 料 和 方 法
本研究以软枣称猴桃 ( A ct i力i d ia aT g ut a lP an hc ) 叶片为试材 , 材料取自东北农学
院果园 。 在春季摘取 3一 sc m x l一 c3 m 的幼嫩吁片 , 用自来水冲洗数次 , 蒸馏水冲洗两
张喜春 : 哈尔滨 , 东 北林业 大学林学系 (D e p a r t m e n t o f f o r e s t r 了 , N o r t h e a s t F o r e s t r r U n i , e r s it y , Ha r b i 。
一5 0 0 4 0 )
。
只绛云 : 哈尔滨 . 东北农学院生物工程系 ( D e p a r t m e n t o f b i o e n g i a e e r in g , N o r t h e a s t A g r i e u lt u r e C o l le g e ,
H a r b i皿 15 0 0 3 0 )
.
一 7 7 一
遍 , 撼纸吸干水分 , 在无菌条件下用 0 . 1% 升汞消毒 5分钟 , 无菌水冲洗 5一 6 次 , 叶
片剪成 0 . 2 c5 m 2左右的小块 , 叶面向上接人培养基中 。
(一 ) 愈伤组纽的诱导
基本培养基 M S 附加 2 . 4一 D 、 N A A 和 Z T 共组成 5 个处理 。 2 。 4一 D 和 Z T 组 成
3 0个处理 , 其浓度各是 : 2 . 4一D : 0 . 2 , 0 . 5 , i , 2 , 3二 g / l 。
Z T : 0
。
1
,
0
.
2 , 0
。
5 , 1
, 2 , 3m g / l
。
N A A 和 Z T 组成 25 个处 理 , 其浓度各是 :
N A A : 0
.
1
,
0
.
5
, i , 2
, 4m g / 1
0
Z T : 0
。
1
,
0
。
5 , 1 , 2 , 3m g / l
。
培养基附加蔗糖 3 % , 琼脂。 . 7% , p H 6 。 O。 高压灭菌 。 每瓶五块外植体 , 每处 理
重复三次 。 置于散射光下 , 温 度 25 士 1℃ 。 所诱导出的愈伤组织每 15 天继代培养一次 。
(二 ) . 浮细胞系的建立
1
。 愈伤组织年龄试验 : 分别取 生 产 5 , 7 , 9 , 1 0 , 2 2 , 1 2 , 1 3 , 1 4 , 1 6 , 1 5 ,
2 0
,
2 2 , 2 4
,
2 6
,
2 5和 3 0天的愈伤组织接种 , 激素浓度为 M S + Z T zm g / l + 2 . 4 一 D 3m g / l 。
2
。 激素配比试验 : 基本培养基 M S , 附加 Z T 和 2 . 4一D 共组成 15 个处 理 , 其 浓 度
为 : Z T : 0 。 5 , 1 , Zm g / l , 2 。 4一D : 1 , 2 , 3 , 4 , 4 , s m g / I。 每处理重复三 次 。 将 2
克的愈伤组织弄碎接人 20 m l 的液体培养基中 , 然后放到摇床上进行悬浮振荡培 养 , 摇
床转速 1 2 orP 二 , 冲程一寸。 温度 27 士 1℃ , 散射光 。
3
。 肌醉试验 : 采用 1 0 0 , 2 0 0 , 4 0 0 , 6 0 0 , 1 0 0 0 , 2 0 0 0m g / l 六个处理 。
4
。 蔗糖试验 : 采用无蔗糖 , l % , 2% , 3% , 5% , 7% , 9 % , 1 % , 13 % 九 个处
理 。
用倒置生物显微镜观察悬浮细胞 , 活细胞率测定应 用 。 . 5 % E v a sn b lu u e (伊万斯
蓝 ) 染色十分钟。
代 ~ 。 * 活 细 胞 总 数抽琐 ”巴早 = - 丽育蘸骊丽魏离厂 入 工” ”
观察十个视野取其平均值 。
细胞密度测定采用上海医用光学仪器厂生产的血球计数板 。 细胞密度 (个 / m D = 25
个方格细胞总数 x lo ` , 重复五次取平均值 。
月
实 验 结 果
(一 ) 愈伤组组的诱导
软枣称猴桃叶片在 M S + Z T l m g l/ + 2 . 4 一 D o . l m g l/ 的培养基中 12 天即产生愈伤组
织 。 软枣称猴桃产生的愈伤组织 可 以分 为 四 种类 型 。 z T o . l m g l/ + 2 . 4 一 D Zm g l/ ,
Z T O
.
l m g l/ + 2
.
4 一 D 3m g l/ 两处理产生了极为疏松 、 水浸状 、 透明的愈伤组织 (图版 1 ) ,
z T l m g l/ + 2
。
4 一 D 。。 l m g l/ 、 z T Zm g l/ + 2 . 4 一 D o . l m g l/ 两处理产生的愈伤组织多呈浅
绿色 、 质地紧密 (图版 2 ) , Z T l m g l/ + 2 . 4 一 D 3m g l/ 处 理产生了浅黄色 、 疏松的愈伤
组织 (图版 8 ) , Z T O . s m g l/ + N A A Zm g l/ 的处理产生了雪花状的愈伤组织 (图版 4 ) 。
其余各处理产生的愈伤组织介于以上几者之间 。 以上四种类型的愈伤组织仅浅黄色 、 疏
一 7 8 一
松的愈伤组织适合于细胞悬浮培养 。
(二 )瓜浮细胞系碗立及其影晌因亲
选择适合于细胞悬浮培养的愈伤组织是建立悬浮细胞系的前题 。 以下对影响悬浮细
、胞系建立的几个主要因素进行了研究 。
1
。 愈伤组织年龄的影响
取生长5 , 7 , 9 , 1 0 , 1 1 , 1 2 , 1 3 , 1 4 , 1 6 , 1 8 , 2 0 , 2 2 , 2 4 , 2 6 , 2 8和 3 0 天的 愈
伤组织接种人液体培养基 。 培养基的激素组成为 Z T l m g l/ + 2 . 4 一 D 3m g l/ 。 从接 种 后
悬浮液的颜色来看 , 生长 5 , 7 , 9 , 10 , 1 , 12 , 13 天的愈伤组织未产生褐化 现 象 , 而
年龄 《天 》
10 1 5 2 0 2 5 30
图 1 . 愈伤组织 年龄与活细胞率关系
注 : 培养七夭统计 , 十个视野取平均值
生长14 天的愈伤组织接种后一天
左右即产生轻微褐化 。 随着愈伤
组织年龄的增加 , 悬浮液褐化越
严重 (图版 5 ) , 生长一个月的
愈伤组织接种后 1 一 2 小时即产
生明显褐化 。 其活细胞率测定结
果见图 1 。
由图 i 可以看出 : 生长 5一 10
天的愈伤组织接种后活细胞率较
高 , n 一 13 天的愈伤组织活细胞
(次)哥田层胆
率有所下降 ,而生长 14 天以上的愈伤组织活细胞率越来越低 , 当生长 28 天以上的愈伤组织
接种后活细胞率降为零 。 显微观察结果表明 : 生长 14 天的愈伤组织接种后有较多的杆状
细胞出现 。 而且随着愈伤组织年龄的增加 , 畸形细胞的比例也随之增加 。
.2 激素浓度的影响 !
2
.
4一D和 Z T 共组成 15 个处
理 。 以生长 10 天的愈伤组织为试
材 。 接种后七天活细胞率测定结
果见图 2 。
由图 2 可 以看出 : 玉米素以
10 9 / 1最 佳 , 当 Z T 增 至 Zm g / l
时 , 活细胞率有所下 降 。 当 Z T
分别为 0 . 5 , z , Z xn g / l , 时 , 随
, 、 、 、
叻40(%)盈裸寡华
一 ~ . - 尹
砚. . . . 占 _ .一决 .- 一日` . . . . . 旧日` 曰 . . . .一 `一图 2 .— 一一 Z T o . s m l/ 3 刁 5 2 . 刁一 D 浓度 ( m g z l 、不 同激素组合的活细胞率— Z T l m g / l 一 · 一 · 一 Z T Zm g l/着 2 . 4一 D 浓度的增加 , 三者的变化呈平行关系 , 而且均在 3 m g l/ 时 , 活细胞率最 高 。为了研究 2 . 4一 D浓度对圆形细胞频率和细胞密度的影响。 采用 2 . 4一 D 浓度为 1 ,
2 , 3
,
4
, 5 m g l/
,
Z T均为 l m g l/ 五个处理 。 接种后一周过滤获得单细胞悬浮 液 ,
结果如图 8 所示 。
由图 2 、 图 8 可以看出 : 不同的 2 。 4一 D浓度 , 其活细胞率、 细胞密度 (单细胞收率 )
一和圆形细胞频率不同 。 当 2 . 4一D 为 1 , 2 0 9 .1/ 时 , 虽然单细胞收率比较高 , 但是由 于
忍。 4一 D 浓度相对较低 (低于愈伤组织继代培养的 2 . 4一 D 浓度 ) , 因而活细胞率较低 。 随
着 2 . 4一D 浓度的增加 , 虽然单细胞收率呈下降趋势 , 但是活细胞率和圆形细胞频率明
一 7 9 一
显增加 , 以 2 . 4一 D 3m g l/ 时圆形细胞频率最高 。 当 2 。 4一 D 浓度增至 s m g l/ 时 , 单 细
胞收率明显下降 , 圆形细胞频率降至 l }
口伍咨价或渗(次)
605,03幼1
..I.rL卜`
.
1
.
32-
乞州俄二E、令)侧拍恩用2 1
。
7%
。 说明高的 2 . 4一 D 浓度会使
细胞的集聚程度增加 , 同时降低圆形
细胞频率 。
3
。 肌醉对提高圆形细胞频 . 率 的
作用
本试验采用不同浓度 的 肌 醉 处
理 , 观察其对圆形细胞频率的影响 。
以 M S为基本培 养 基 附加 Z T l m g 1/
+ 2
.
4一D 3m g l/ , 以生长 10 天的愈伤
组织接种 , 结果见表 1 :
i , 3 4 5 2
·
4一 D浓度 (二 ` / i )
图 3 . 2 . 4一 D浓度与细胞 密度 和画形细胞撅 率的关 系
一 x 一 x 细胞 密度 — 圆形细胞 扭率
裹 1。 肌醉对口形细胞级率的形晌
效 “ 卜面碳丽再锣糕下赢一一鹦迎弊理伙一 {.一缨-…黑 , …摆一…李阵二{井卜一牛一一于塑翌臀矍男一 {华 {寻井一卜学一 {共井{一兰二 {半井一福而施聂专粼竺一…众…巍…气卜溉…气…一巍一. . . . . . . . . . . . . . . .往 : ① 侧定结果为培养七天统计的 ; ②长 : 宽 , l一 1 . 5 : I时为 即为画形细胞 .
史图 4可明显看出 :适当增加肌醇浓度 , 可明显提高圆形细胞频率。当肌醇增至 2 0 m g
产浓)哥得晏寡瞥班
,l/时 , 圆形细胞频率由 1 0 m g l/ 的
2 9
。
6 3%增至 4 3 . 16 % 。 但当肌醇浓
度继续增加时 。 圆形细胞的频率开
始明显下降。
4
. 蔗糖浓度与单细胞收 率 和
活细胞率的关系
蔗搪是植物组织和细胞赖以生
长的重要碳源 , 因此对蔗糖浓度进
行了研究 。
2叻 4 0 0
图 4 .
8 0 0 0B 0 , 。0D 幼 0 0 肌醉 ( m ` / l )
肌薄对 四形细胞孩率的影响 以生长 10 天的愈伤组织 为 试材 , 以M S基本培养基附加 Z T l m g l/
+ 2
.
4 一 D 3m g l/
, 肌醇 2 0 m g l/ 。 结果表明不含蔗糖的处理 3 一 4 小时即产生明显褐化
现象 , 24 小时就变成黑色的细胞悬浮液 。 含蔗糖 1 %和 2 写的处理接种后 1 6小时即产生
不同程度的揭化现象 , 含蔗糖 8 %一 13 写的处理均未产生褐化现象 。 为确定最适蔗糖浓
度 , 接种后七天对单细胞游离情况和活细胞率进行观察和统计 , 其结果如表 2 所示 。
一 8 0 一
衰 2 .蔗箱浓度与单细胞收率和活细胞率的关系
蔗 搪 含 t单细胞收率 (细胞密度 )活细胞率 (纬 )
无 蔗 糖 有少量游离死细胞 无 活 细 胞
1 %获得少量游离细胞 , 而且绝大部分死亡 , 1 2 . 1
密度达 1 . o X 10 3
2 % 获得游离细胞较 1 %多 , 密度达 8 . l x 10 , 32 。 8
8 % 游离细胞较多, 密度达2 . 39 x 10 . 5 9 。 7
6 % 游离细抱多 , 密度达 3 . 2 x 10 “ 59 。 8
7 % 游离细胞较少 , 密度达 2 . 3 x 10s 25 。 7
9 % 游离细胞极少 , 密度达 7 . 5 x 10 1 。 7
1 1% 细胞全部破裂 , 见到许多残留的细胞壁 。 无 活 细 胞
极个别完整细胞已死亡 , 细胞原生质浓缩
1 3% 同 n 肠 无 活 细 胞
二注 : 过毖后均刹余 l m l 细启惫浮浪 ,
由表 2 和图 5 可以看出 : 在无蔗糖的情况下 , 细胞不能存活。 随着蔗糖 浓 度 的 增
加 , 活细胞率和细胞密度都呈上升趋势 。 从活细胞率来看 , 以蔗糖 3 一 5 %最好 , 而从
:细胞密度来看 , 蔗搪以 6 %最好 。 当蔗糖浓度再继续增加时 ( > 5% ) , 活细胞率和细抱
密度都呈下降趋势 。 当蔗糖浓度达 n % 以上时 , 其活细胞率和细胞密度均降为零 。
凿珊居畴(争ù日二x言`n”ù00J口3,1.二.,
.土`J直IJ..
八、406幼八次à铃盈界奥
`
, _ 1 2 3 5 了 9 1 1 1 3 被精浓度 (% )
图 5 . 蔗箱浓度与细胞密度和活细启率的关系
一一 -一 活细血率 一一一一细胞密度
通过对愈伤组织年龄 、 激素浓度 、 肌醇和蔗糖浓度四方面因素的系统研究 , 建立了
:软枣称猴桃悬浮细胞系 (图版 6 ) , 并探讨了四方面因素对建立悬浮细胞系的影响。
讨 论 与 结 论
在愈伤组织年龄试验中 , 郑光植等〔 4 〕在研究三分三时认为 : 以生长 10 天的愈伤组
织接种最好 。 年龄太小的愈伤组织生长量少 , 因而不经济 。 这与我们研究称猴桃的结果
一 8 1 一
是一致的 。 年龄较大的愈伤组织接种后产生褐化 , 可能与材料本身的遗传特性 、 生理伏
态等因素有关 。 如油菜在悬浮培养过程中揭化较少 , 而香蕉较严重 。 本实验中软枣称援
桃也较易褐化 , 这说明遗传特性对褐化与否有着较直接的影响 。
· 激素浓度对活细胞率 、 单细胞收率和圆形细胞频率都有显著影响 。 O ih r a 等人 〔 , 〕
报导 1-0 ` 克分子的 2 . 4一 D 浓度将抑制细胞的生长 , 细胞的收获 t 比使用 10 ~ “克分子的 `
2
.
4 一 D的情况下低 10 % 。 叶和春 〔 6 〕也报道了类似的结果 , 对水稻细胞悬浮培养来说 ,
2
.
4 一 D 浓度同样是影响细胞生长分裂的重要因素 , 他认为 : 当 2 。 4 一 D浓度高达 1 0 “ 3 克
分子时 , 细胞的生长受到明显抑制 。 在我们的实验中 , 当 2 . 4 一 D 浓度达 s m g 1/ 时 , 纽
胞的收获 t 仅为 3m g 1/ 时的十二分之一 。 说明高的 2 . 4 一 D 浓度同样会降低称猴桃单 细
胞的收获率 。 从活细胞率来看 , 以 M S基本培养基附加 Z T l m g l/ + 2 。 4 一 D 3m g l/ 的处理 .
活细胞率最高 , 该激紊配比与愈伤组织继代培养的培养基相同 。 从圆形细胞频率来看 ,
以M S基本培养基附加 Z T l m g 1/ + 2 . 4 一 D 3m盯 l 最高 。 由此来看 , 建立软枣称猴桃悬浮
细胞系最适宜的激素配比为 Z T l m g l/ + 2 . 4 一 D 3m g l/ 。
M a e da 等认为采用高浓度的肌醇 ( Z OOm g l/ ) 能促进水稻悬浮培养细胞的增殖 , 邹 ·
高治等 〔 3 〕在水稻细胞悬浮培养时采用肌醉的浓度分别 为 2 0 , 4 0 0 , 6 0 0 , 80 0 , 1 0 0 0 ,
ZOO0m g l/
。 结果表明 : 当肌醇的用量提高到 l 0 0 0m g l/ 时 , 对促进水稻悬浮培养细胞 的
生长和提高圆形细胞的频率均有很好的效果 。 本实验的结果与上述学者的结 论 是 一 致
的 。
在蔗搪浓度实验中 , 综合活细胞率和细胞密度两个因素 : 蔗糖以 6 %最好 。
A B S T RAC T
T五e l e a v e s o f A c t i n id i a a塔 u t a P l a n e h w e r e e u l t u r e d o n M S b a s i e m e d -
i u m s u P P l e m e
n t e d 可i th 份。 4 一 D o r N A A a n d z e a t i n i n v i t r o 。 T h e e a l l u s w e r e
i n d u e e d s u e e e
s s fu l lg
。
T h e r e s u l t s h a v e b e e n o b t a i n e d a s f o l l o w s * t h e e a l l住`
f i t t i n g f
o r t h
e e s t a b l i s il m e n t o f e e l l l i n e e o u l b b e o b t a i n e d f r o m l e a v e s o f A e t 一
i n i d i a a r g u t a P l
a n e h o n M S + Z T l o g / l + 2
。
4 一 D 3m g / l
。
T h e h i g h e s t
e e l l
s u r y -
i v a l r
a t e h a s b e e
n o b t a i n
e d f r o m e a l l u s t h a t h a d b e e n e o l t u r e d f o r t e n d a y s ,
T h e s a t i s f i e d r e s
u l t h
a v e b e e n o b t a i n e d
o n M S + Z T l m g + 2
。
4 一 D 3m g / l
。
T il e h i g h一
e s t f r e q u e n e y o f
r o u n d e e l l 15 m e d i u m , i t h 2 0 0m g / 1 m y
o一 i n o s i t o l 。 S u i t a bl合 -
e o n e e n t r a t i o n o f s u e r o s e 15 5%
一 8 2 一
图版说 明 :
( )l 极为硫松的 、 水及状透明的愈伤组织 ; ( 2 ) 浅绿色 、 质地紧密的愈伤组织 ,
( 3 ) 浅黄色 、 琉松的愈伤组织 , ( 4 ) 雪花 状的愈 伤组织 : ( 5 ) 随着愈伤组织年铸
增加 , 细胞惫浮液褐化越严重 ; ( 6 ) 悬浮培养的软枣琳猴挑 细胞 . Z 13 x 。
今 考 文 献
叶和 春 , 1 9 84 , 水 稻细胞 悬浮培养及再生 植株的研究 , 植物学报 . , 2以 l ) : 5 2一 5 9 .
匡安秀 , 19 8 4 . 称毅挑幼叶堵养再生植株的组织化学研究 . 武汉大学学报 , ` 2 : 85 一 90 .
邹 窗治等 , 19 86 , 水稠细胞 系的建立和单细胞 培养再生植株 , 上海农业 学报 , 2( 3 ) : 1一吕 .
郑光 植 . 19 82 . 三分三愈伤组织细胞 的悬浮堵养 , 云 南植物研究 , ,( 2 ) : 2 03一 2 0 6。
洪树荣 . 9[ 81 , 称狠桃离体茎段和叶愈伤组织的诱导和植株再生 , 湖北农业科学二 : 28 一 30 .桂姐林 . 1 9 79 . 称狠桃离体茎段愈伤组织的诱导和植株再生 . 植物学报 . 21 ( 4 ) : 3 9一 34 4 。
桂报林等 . 1 98 2 . 琳级桃胚乳植株形态 分化的研 究 , 植物学报 , 24( 3 ) : 2 16 一 2 2 1 ,
黄贞光等 , 19 8 2 . 称狠 桃胚乳培 养获得三倍体植株 , 4 : 2 47 一 2 50 。
o h i r a
,
K
.
K
。
o j im a a n d A
.
F o j i w a r a
. r o 7 s
,
S t u a i e s o n t h e n u t r i t i o 皿 o f r ie e c e l l
A
.
5
.
S i m P l e
,
d e f in e 通 m e d气u m o f r a P i d gt o , t h i n s u s p e n s i o n e u l t u r e P e a n t a n d
14 : 川 3一 1 2? 1 .
C u l t u r e
e e l l p b y
s i o l
,
. 口 .
一 8 3 一