全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
!"#&)#")#%
&修改稿收到日期$
!"#$)"#)!(
基金项目$国家自然科学基金"
%#%+!"%0
#
作者简介$杜杨建"
#010
#!硕士!主要从事果树育种及生物技术研究
2)34-5
$
#"#+"$$"#+
!66
*783
"
通信作者$王跃进!教授!博士生导师!主要从事葡萄种质资源与生物技术育种研究工作
2)34-5
$
94/
:;,!
/9.<4=*>?<*7/
中国野生毛葡萄(丹凤
$%
)
&
个
芪合酶基因表达与功能分析
杜杨建!李瑞民!程思妍!张剑侠!王跃进"
"西北农林科技大学 园艺学院!旱区作物逆境生物学国家重点实验室!农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室!
陕西杨陵
+#!#""
#
摘
!
要$为了研究中国野生毛葡萄"
!"#"$
%
&"
%
&(
)
&*(+"$@>A?*
#(丹凤
)!
)
%
个芪合酶基因的表达与功能!该研究
采用同源克隆技术分离了毛葡萄(丹凤
)!
)
%
个芪合酶基因
!
%
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*
!
%
,-,%"
和
!
%
,-,%!
"
B>/C4/D
登录号分别
为
EF1$1$++
*
EF1$1$$1
和
EF1$1$$$
#!
%
个基因的
7GHI
全长均为
##+0J
K
!编码
%0!
个氨基酸以抗葡萄白粉病
"
./"&*(0/(#1+
#的毛葡萄(丹凤
)!
)和不抗病的欧洲葡萄(赤霞珠)为材料分别进行接种白粉菌和
ICI
*
LI
*
M>EI
*高温*低温和高盐胁迫处理!利用实时定量
NO@
检测这
%
个基因在胁迫处理下的表达情况&同时利用农杆菌
介导法将这
%
个基因分别转入模式植物烟草中!检测这
%
个基因在烟草中的表达产物!分析比较这
%
个基因的表
达功能结果显示$在
!
个供试材料中!葡萄白粉菌胁迫下芪合成酶
!
%
,-,%!
诱导表达量高于
!
%
,-,!#
和
!
%
,-,%"
&在非生物胁迫处理下!芪合酶基因
!
%
,-,%!
对高温处理反应最敏感采用高效液相色谱分析检测转
%
个基因烟草的结果显示!转
!
%
,-,%!
基因烟草比转
!
%
,-,%"
基因烟草植株中白藜芦醇的累积量高研究表明!
%
个基因中
!
%
,-,%!
具有较高的抗葡萄白粉菌特性并能在转基因烟草中表达出较高的反式云杉新苷产物!这为进
一步利用
!
%
,-,%!
转目的植物葡萄基因研究提供了依据
关键词$葡萄&中国野生葡萄&芪合酶基因&白藜芦醇&表达分析
中图分类号$
F+10
文献标志码$
I
(
)
*+,,#"-.-!/0-12#"-3-.4
5
,#,"678*++92#4:+-+9
5
-28.,+
;+-+,6*"<1-#-2
3
4-/
3
4$/
5
4*$(-2=+8!>311+,,#"-
(
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K
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K
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K
X>..>?-/YX4/.
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K
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K
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K
>
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K
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K
X>..-8/
K
4YY>X/
!!
欧洲葡萄"
!"#"$2""
3
0+(R*
#栽培品种由于其
优质*高产与用途多样!在全球被广泛栽培但其突
出缺点是抗病*抗逆性差!特别是易感白粉病+#)%,!葡
萄白粉病+
./"&*(0/(#1+
"
L7A9*
#
C,是严
重危害葡萄的一种真菌病害!它不仅造成产量的降
低!而且影响果实品质
芪合成酶的表达产物白藜芦醇不仅在植物体内
是一种植保素!参与植物对外界病原入侵的防御反
应而且迄今研究报道葡萄中白藜芦醇的含量较
高!白藜芦醇不仅在植物体内表现抗病!而且葡萄果
实及其制品还有抗氧化*抗衰老*抗癌作用+(,
!""$
年美国科学家又发现葡萄果实的白藜芦醇具有防治
心血管疾病*防癌的保健作用+&,当植物在受到真
菌侵染*紫外线照射或处于病理状态时!白藜芦醇被
诱导积累+$,白藜芦醇在葡萄的体细胞中诱导病程
相关蛋白大量累积!提高葡萄的抗病性+,&对心血管
代谢及糖尿病人的血管炎症具有很大改善作用+1)0,!
此外它还具有控制血小板的聚集+#",!有效地抑制低
密度脂蛋白的氧化+##,*抑制癌细胞+#!,*抗炎活
性+#%,*抗肿瘤+#(,和植物雌性激素作用+#&,等功能
芪合酶是白藜芦醇代谢中的关键酶+#$,!能够促
使香豆酸辅酶
I
和丙二酰辅酶
I
反应形成芪类化
合物白藜芦醇多数植物如烟草+#+,*小麦+#1,*大
麦+#0,等!在转入外源芪合酶基因后可提高白藜芦醇
积累量!并且能增强自身对一些真菌病害的抗性
中国作为葡萄属植物重要的起源地之一!拥有
丰富的抗性种质资源+#)%,!研究这些资源中的抗性基
因有重要的研究和利用价值本课题组段朝辉等
!""!
年利用高效液相色谱法"
TNRO
#对中国葡萄野
生种中
##
个种或变种共
%$
个株系浆果中的白藜芦
醇含量进行研究+!",!其中抗白粉病的毛葡萄(丹凤
)
!
)白藜芦醇的含量很高!可达
+*

"
:
-
:
#
!此后
史江莉等+!#,的研究也发现!毛葡萄(丹凤
)!
)浆果中
的白藜芦积累量较高
基于芪合酶在白藜芦醇代谢过程中的重要作
用!本研究在史江莉研究的
(#
个芪合成酶基因中!
选取了
!
%
,-,!#
*
!
%
,-,%"
和
!
%
,-,%!
这
%
个芪
合成酶基因!利用同源克隆技术分离获得了这
%
个
基因
7GHI
全长&利用生物与非生物因素胁迫处
理!研究
!
%
,-,!#
*
!
%
,-,%"
和
!
%
,-,%!
基因的
表达差异与功能!进一步通过农杆菌介导法将这
%
个基因转入烟草中!通过
TNRO
检测
%
个转芪合酶基
因烟草植株中芪类物质表达的含量!以确定毛葡萄
%
个芪合酶基因
!
%
,-,!#
*
!
%
,-,%"
和
!
%
,-,%!
的表
达与功能!筛选芪合酶活性表达较高的基因!为定向
改良欧洲葡萄抗病性提供依据
#
!
材料和方法
C*C
!
材料与处理
供试材料为西北农林科技大学葡萄种质资源圃
中保存的抗白粉病毛葡萄(丹凤
)!
)与感白粉病欧洲
葡萄(赤霞珠)生物胁迫是田间选取受葡萄白粉病
菌感染的葡萄叶片!利用压片法+!!,将白粉病接种于
未感病的(丹凤
)!
)与(赤霞珠)叶片上!在接种后
"
*
$
*
!(
*
(1
*
+!
*
0$
和
#!"A
分别取样!收集叶片立即
置于液氮中冷冻!并于
1"`
保存!用于提取
@HI
和获得芪合成酶
7GHI
全长分析
非生物胁迫分别用
#""
"
385
%
R
水杨酸"
LI
#*
&"
"
385
%
R
脱落酸"
ICI
#和
&"
"
385
%
R
茉莉酸甲
酯"
M>EI
#以及
(`
低温*
(!`
高温和
!""3385
%
R
H4O5
溶液对生长健康的(丹凤
)!
)与(赤霞珠)进行
胁迫!激素诱导后于
"
*
"*&
*
#
*
%
*
$
*
#!
和
!(A
取样!
其余在处理后
"
*
%
*
$
*
#!
*
!(
*
(1
和
+!A
取样!收集
叶片立即置液氮中速冻!并于
1"`
保存
按照 前 期 提 交
HOCS
公 布 的 芪 合 酶 基 因
!
%
,-,!#
*
!
%
,-,%"
和
!
%
,-,%!
"
B>/C4/D
登录号
EF1$1$++
*
EF1$1$$1
和
EF1$1$$$
#的
7GHI
序列!
设计引物扩增和实时定量
NO@
引物!引物由北京奥
科公司合成"表
#
#
C*%
!
实验方法
C>%>C
!
葡萄叶片总
=D3
提取及其芪合酶基因
1?$
D3
全长克隆
!
参照张今今等改良的
LGL
%酚法+!%,!
提取(丹凤
)!
)幼叶总
@HI
!参照王西平的方法进行
总
@HI
纯化+!(,!利用琼脂糖凝胶电泳和
H4/8
GX8
K
检测总
@HI
的质量与浓度!参照
NX-3>)
L7X-
K
Y
^M
@^ X>4
:
>/Y]-Y
试剂盒说明书上的试验步
骤对总
@HI
进行反转录
以毛葡萄(丹凤
)!
)
7GHI
为模板进行扩增!
$#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
NO@
反应条件为$
01`
预变性
#".
!
&&`
变性
#&
.
!
+!`
退火
!3-/
!
%"
个循环&
+!`
延伸
&3-/
!
(
`
保存琼脂糖凝胶电泳检测反应产物!利用天根
公司
GHI
回收试剂盒回收后!连接至
K
B2M)^)
>4.
;
"大连
4^]4@4
#并转化
8^
K
#"
感受态细胞中!
在含
a)
:
45
和
SN^ B
的
#""3
:
%
RI3
K
平板上蓝白
斑筛选后!将阳性的重组菌送北京奥科鼎盛测序部
测序
C>%>%
!
实时荧光定量
EF=
分析
!
分别采取不同时
间接种葡萄白粉菌*外源施用
ICI
*
LI
*
M>EI
与高
温*低温和高盐非生物因素胁迫下的毛葡萄(丹凤
)
!
)和(赤霞珠)叶片组织总
@HI
!参照
@>\>XYI-?
^M
[-X.YLYX4/?7GHIL
;
/YA>.-.]-Y
说明书反转录为
7GHI
根据
!
%
,-,!#
*
!
%
,-,%"
和
!
%
,-,%!
基
因的
7GHI
序列设计定量
NO@
分析引物!葡萄
#1L
X@HI
作为内参基因"表
#
#按照
LQC@NX>3-V
2V-(
%
#
说明书进行实时定量
NO@
扩增实验
C*%*&
!
植物表达载体构建
!
依据
%
个基因
!
%
,-,!#
*
!
%
,-,%"
和
!
%
,-,%!
的开放阅读框两
端序列设计引物!分别引入
,(/
$
与
56(
$
酶切位
点!并分别构建到
K
CS#!#
植物表达载体中!将这
%
种表达载体利用电转化的方法转入农杆菌菌株
Bb%#"#
!挑取阳性克隆于
RC
液体培养基培养至对
数生长期!用
ML
重悬至
_G
$""
值为
"*(
!用作农杆
菌介导的遗传转化侵染
C*%*G
!
农杆菌转化烟草及转基因苗的获得
!
采用
表
C
!
本实验所用引物
4^J5>#
!
NX-3>X.>
6
<>/7>.<.>?-/YA-.Y>.Y
引物名称
NX-3>X/43>
引物序列
NX-3>X.>
6
<>/7>
"
&c
#
%c
#
!
%
,-,!#)[ BOB^ OBIOI^ BBO^ O^IB^ OBIBBIII^ I^BIIIOB
!
%
,-,!#)@ BO^ O^ IBI^ OII^ ^^ B^ IIOOI^IBBII^ BO^ I^ B
!
%
,-,%")[ BOB^ OBIOI^ BBO^ ^^ I^^ B^IBBIII^ OIBIIIOB
!
%
,-,%")@ BO^ O^ IBI^ I^I^ ^^ BIIIOOI^IBBII^ BO^ I^ B
!
%
,-,%!)[ BOB^ OBIOI^ OII^ BBOB^ I^B^ B^IBBI
!
%
,-,%!)@ BO^ O^ IBI^ OOIO^ OII^ ^^ B^ IIOOI^IB
!
%
,-,!#)@^)[ O^OOBIOOIO^ B^ B^ O^ IOO
!
%
,-,!#)@^)@ OO^ O^II^ BO^ BO^ O^O^ I^O
!
%
,-,%")@^)[ ^^ O^BB^ BI^ BBB^ O^ BO
!
%
,-,%")@^)@ OO^ B^^ B^O^ ^^ BIB^ ^^ O^ B^
!
%
,-,%!)@^)[ B^ O^^ ^^ BO^ O^ I^ O^^ OO^ OI^ O^
!
%
,-,%!)@^)@ O^^ OOBBOOI^ O^^ OOI
#1.X@HI)[ B^ IIOBBB^ BIOBBIBII^ I^B
#1.X@HI)@ OOB^ B^ OIBBI^ B^BB^ II^
HN^)[ IBIBBO^ I^ O^BBO^ I^ BIO^ B
HN^)@ OIIBO^ O^ O^IBOII^ I^ OIOB
农杆菌介导的叶盘法转化烟草植株
HO10
!分别用
含有这
%
个目的基因的农杆菌侵染无菌烟草叶片!
将侵染过的叶片置于共培养基"
MLd!""3
:
%
R
HIId!3
:
%
R$)CI
#
!1`
黑暗条件下培养
!
%
%
?
!而后转移至筛选培养基"
MLd!""3
:
%
RHIId
!3
:
%
R$)CId!""3
:
%
R]4/d(""3
:
%
RO4XJ
#
进行抗性芽筛选分化!当长出比较明显的抗性芽时!
切下抗性芽再生成苗!此后!转移至生根培养基"
ML
d!""3
:
%
R]4/d(""3
:
%
RO4XJ
#诱导转基因烟
草植株生根!获得转基因烟草植株提取转基因烟
草基因组
GHI
!用于
NO@
分析检测转基因植株
C*%*H
!
转基因烟草中的芪类物质测定
!
取转基因
烟草幼叶
#
:
!参照周起的方法+!&,进行样品制备与
高效液相色谱分析混合标样中各标样通过标准曲
线保留时间的不同区分与鉴定!同时通过对比相同
保留时间内标样的峰面积与样品峰面积的比值!计
算测定样品芪合成酶表达产物的含量芪合成酶基
因表达白藜芦醇产物的不同存在形式与顺序是$葡
萄素*紫檀芪*反式白藜芦醇和反式云杉新苷
!
!
结果与分析
%>C
!
毛 葡 萄 (丹 凤
$%
)
1
3
060%C
!
1
3
060&I
和
1
3
060&%
基因的克隆与序列分析
对提取(丹凤
)!
)叶的总
@HI
检测!结果显示!
提取的
@HI
没有发生降解!纯度较高!可用于后期
同源克隆以及
@^ )NO@
反应"图
#
!
I
#根据
B>/)
M*M4XD>X X^4/.!]N5<.
&
#
%
%*
(丹凤
)!
)幼叶
@HI
&
(*!
%
,-,!#7GHI
全长克隆&
*!
%
,-,%"7GHI
全长克隆&
$*!
%
,-,%!7GHI
全长克隆
图
#
!
毛葡萄(丹凤
)!
)幼叶
@HI
电泳检测"
I
#
及其芪合酶基因
7GHI
全长序列扩增"
C
#
M*M4XD>X X^4/.!]N5<.
&
#%*@HI8=
(
G4/=>/
:
)!
)
;
8:
5>4=
&
(*^A>=<55>/
:
YA7GHI43
K
5-=-74Y-8/8=!
%
,-,!#
&
&*^A>=<55>/
:
YA7GHI43
K
5-=-74Y-8/8=!
%
,-,%"
&
$*^A>=<55>/
:
YA7GHI43
K
5-=-74Y-8/8=!
%
,-,%!
[-
:
*#
!
I
:
4X8.>
:
>5>5>7YX8
K
A8X>.-.4/45
;
.-.8=@HI=X83
!4
%
&"
%
&(
)
&*(+"$@>A?*
(
G4/=>/
:
)!
)
5>4\>.
"
I
#
4/?
YA>=<55>/
:
YA8=!
%
,-,7GHI43
K
5-=-74Y-8/
"
C
#
+#!
!
期
!!!!!!!!!!
杜杨建!等$中国野生毛葡萄(丹凤
)!
)
%
个芪合酶基因表达与功能分析
C4/D
中已登录的毛葡萄(丹凤
)!
)芪合酶基因序列
"表
!
#!设计引物"表
#
#!利用反转录
7GHI
作为模
板!进行
NO@
扩增!获得约
#!""J
K
大小的扩增产
物"图
#
!
C
#!经测序分析!获得了与早期
7GHI
全长
序列一致结果+!#,
通过
HOCS
"
AYY
K
$%%
999*/7J-*/53*/-A*
:
8%#
网站
C54.Y/
对所获得的基因序列进行比对分析!获
得了目的基因
!
%
,-,!#
*
!
%
,-,%"
和
!
%
,-,%!
全
长序列"表
!
#通过序列分析!这
%
个基因均编码
%0!J
K
氨基酸对这
%
个基因的氨基酸序列进行
同源比对分析"图
!
#!发现三者之间同源性很高!其
中
!
%
,-,!#
与
!
%
,-,%!
的同源性为
01*"e
!
!
%
,-,!#
与
!
%
,-,%"
以及
!
%
,-,%"
与
!
%
,-,%!
间同源性分别为
0$*+e
与
0+*(e

%*%
!
葡萄白粉菌诱导后毛葡萄
&
个芪合酶基因表
达分析
经接种白粉菌诱导毛葡萄(丹凤
)!
)和(赤霞珠)
后!这
%
个基因
!
%
,-,!#
*
!
%
,-,%"
和
!
%
,-,%!
!
表达方式不同!
%
,-,!#
与
!
%
,-,%"
虽诱导表达!
但表达量较低!而
!
%
,-,%!
基因表达量随时间的
延长而升高!其表达量在(赤霞珠)中低于毛葡萄中
!
%
,-,%!
基因的表达!而
!2,-,!#
*
!2,-,%"
和
!2,-,%!
三者的表达趋势一致"图
%
#
%*&
!
毛葡萄(丹凤
)%
)的
&
个芪合酶基因在施用不
同外源激素诱导下的表达分析
外源施用
ICI
*
LI
和
M>EI
作为非生物胁迫
处理!毛 葡 萄 (丹 凤
)!
)
%
个 基 因
!
%
,-,!#
*
!
%
,-,%"
和
!
%
,-,%!
的表达随处理时间的不同而
上下波动$
ICI
处理后
$A
!在(丹凤
)!
)中基因
!
%
,-,!#
受诱导表达最显著!其表达量在处理
$A
后达到 最 高 "图
(
!
I
#&而 在 (赤 霞 珠)中!则
!2,-,%"
基因受诱导表达相对略微显著!其表达量
在处理
%A
后达到最高!
!2,-,%!
与
!2,-,!#
基
因均在处理
$A
后表达量达到最高"图
(
!
C
#&经
LI
处理!毛葡萄(丹凤
)!
)中的
!
%
,-,!#
*
!
%
,-,%"
和
!
%
,-,%!
基因均诱导表达明显!三者的表达量在处
理
#!A
后达到最高"图
&
!
I
#!此后下降&而在(赤霞
珠)中!
%
个基因的表达量没有发生明显变化!呈现
双峰!在处理
#A
和
#!A
后其表达量均达到高值
"图
&
!
C
#&经
M>EI
处理!在(丹凤
)!
)中
!
%
,-,!#
表
%
!
毛葡萄(丹凤
$%
)芪合酶基因序列分析
4^J5>!
!
L>
6
<>/7>4/45
;
.-.8=!
%
,-,
:
>/>.=X83OA-/>.>9-5?!4
%
&"
%
&(
)
&*(+"$
(
G4/=>/
:
)!
)
基因
B>/>
登录号
I77>..-8/
/<3J>X
全长
[<55>/
:
YA
%
J
K
OGL
全长
OGL=<5
5>/
:
YA
%
J
K
蛋白分子
NX8Y>-/
34..
%
DG
蛋白等电点
NX8Y>-/
-.8>5>7YX-7
K
8-/Y
不稳定系数
S/.Y4J-5-Y
;
-/?>V
!
%
,-,!# EF1$1$++ ##0& ##+0 (!*+&1 $*!% %+*1+
!
%
,-,%" EF1$1$$1 ##0& ##+0 (!*1## $*!% %0*&%
!
%
,-,%! EF1$1$$$ ##0& ##+0 (!*1#+ $*%& %1*#$
氨基酸序列相同的部分用黑色阴影表示
图
!
!
毛葡萄丹凤
)!
的
%
个基因
!
%
,-,!#
*
!
%
,-,%"
和
!
%
,-,%!
氨基酸序列比对分析
L7A>34Y-7YA>.43>43-/847-?X>.-?<>.4X>A-
:
A5-
:
AY>?-/J547D
[-
:
*!
!
I3-/847-?.>
6
<>/7>45-
:
/3>/Y438/
:
!
%
,-,!#
!
%
,-,%"4/?
!
%
,-,%!8=OA-/>.>9-5?!4
%
&"
%
&(
)
&*(+"$
1#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
与
!
%
,-,%"
的表达量均呈现先升后降的趋势!在
处理后
$A
其表达量达到最高!而
!
%
,-,%!
表达处
于相对较低水平"图
$
!
I
#&在对照(赤霞珠)中!
!2,-,%"
与
!2,-,%!
基因均呈现出先下降后上
升再下降的表达趋势!
2,-,!#
基因的表达较低!
但三者的表达量在处理后
$A
达到最高"图
$
!
C
#
%*G
!
&
个芪合酶基因在高盐*低温和高温胁迫处理
下的表达模式分析
在高盐*低温和高温的胁迫下!毛葡萄(丹凤
)!
)
的
%
个基因
!
%
,-,!#
*
!
%
,-,%"
和
!
%
,-,%!
的表
达水平随处理时间的不同而不同在高盐处理下!
基因
!
%
,-,!#
的表达水平波动最显著!未处理时
表达量最高"图
+
!
I
#!经处理表达量减少!处理
$A
后!处于低水平表达&在 (赤霞珠)中!表达量变化最
显著的是
!2,-,%"
基因!在处理
#!A
后其表达量
达到最高"图
+
!
C
#在高温处理下!毛葡萄(丹凤
)
!
)
%
个基因中!
%
,-,%!
基因表达较显著!在处理
后
(1A
!其表达量持续上调!在
(1A
达到最高值"图
1
!
I
#&在 (赤霞珠)中!
%
个
!2,-,
基因的表达趋势
不一"图
1
!
C
#在低温处理后!毛葡萄(丹凤
)!
)中!
%
个基因表达量呈现表达增加&在 (赤霞珠)中!
!2,-,!#
基因与在(丹凤
)!
)中的表达大体一致!均
图
%
!
接种白粉病诱导后
%
个基因在毛葡萄(丹凤
)!
)"
I
#和(赤霞珠)"
C
#中的表达
[-
:
*%
!
2V
K
X>..-8/4/45
;
.-.8=YAX>>,-,
:
>/>.8=J8YA!4
%
&"
%
&(
)
&*(+"$477>..-8/
(
G4/=>/
:
)!
)"
I
#
4/?
(
O4J>X/>YL4<\-
:
/8/
)"
C
#
J
;
-/87<54Y-8/8=.40/(#1+X=->5?78/?-Y-8/
图
(
!
外源施用脱落酸诱导后
%
个基因在毛葡萄(丹凤
)!
)"
I
#和(赤霞珠)"
C
#的表达
[-
:
*(
!
2V
K
X>..-8/
K
X8=-5>.8=YAX>>,-,
:
>/>.-/?<7>?J
;
ICI
图
&
!
外源施用水杨酸诱导后
%
个基因在毛葡萄(丹凤
)!
)"
I
#和(赤霞珠)"
C
#中的表达
[-
:
*&
!
2V
K
X>..-8/
K
X8=-5>.8=YAX>>,-,
:
>/>.-/?<7>?J
;
LI
0#!
!
期
!!!!!!!!!!
杜杨建!等$中国野生毛葡萄(丹凤
)!
)
%
个芪合酶基因表达与功能分析
为逐渐增加!表达量均在处理后
+!A
达到最高!
!2,-,%"
基因的表达情况也与在(丹凤
)!
)中相一
致!即在处理后
!(
%
+!A
均处于高水平表达!
!
%
,-,%!
基因则在处理后
#!
%
+!A
表达较高"图
0
#
%>H
!
转芪合酶基因烟草
DFJK
植株的
EF=
检测与
芪类物质含量的测定
%
个
!
%
,-,
基因利用农杆菌介导叶盘法获得
抗卡那霉素的转芪合酶基因烟草
HO10
植株"图
#"
#!随机选取
#"
株以及
#
株阴性对照烟草
HO10
的嫩叶!以重组载体作为阳性对照!利用
NO@
分析
检测"图
##
#&在阳性对照及转基因植株中均可扩增
出
$(+J
K
的新霉素磷酸转移酶基因
78-SS
!而阴
性对照未扩增出
$(+J
K
片段!
NO@
检测初步说明
%
个毛葡萄芪合成酶基因
!
%
,-,
已经转入了烟草
HO10
中
TNRO
标准检测结果如下$
(
种芪类化合物
"
b-/-=>X-/
!
1*++$ 3-/
&
K
Y>X8.Y-5J>/>
!
#(*##0 3-/
&
#+($)X>.\>X4YX85
!
#+*"1+3-/
&
#+($)
K
-7>-?
!
$*&13-/
#
均被检测到"图
#!
#&在转入
!
%
,-,%"
与
!
%
,-,%!
的
转基因烟草
HO10
植株中均检测到反式云杉新苷的
存在!其他
%
种芪类物种均未检测到"图
#%
#在转
入
!
%
,-,%!
基因的转基因烟草
HO10
植株中反式
云杉新苷含量最高!为
!$*%+#
"
:
%
:
&在转入
!
%
,-,%"
图
$
!
外源施用茉莉酸甲酯诱导后
%
个基因在毛葡萄(丹凤
)!
)"
I
#和(赤霞珠)"
C
#中的表达
[-
:
*$
!
2V
K
X>..-8/
K
X8=-5>.8=YAX>>,-,
:
>/>.-/?<7>?J
;
M>EI
图
+
!
高盐处理下
%
个基因在毛葡萄(丹凤
)!
)"
I
#和(赤霞珠)"
C
#的表达
[-
:
*+
!
2V
K
X>..-8/
K
X8=-5>.8=YAX>>,-,
:
>/>.-/?<7>?J
;
H4O5
图
1
!
高温处理下
%
个基因在毛葡萄(丹凤
)!
)"
I
#和(赤霞珠)"
C
#中的表达
[-
:
*1
!
2V
K
X>..-8/
K
X8=-5>.8=YAX>>,-,
:
>/>.-/?<7>?J
;
A-
:
AY>3
K
>X4Y
"!!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
0
!
低温处理后
%
个基因在毛葡萄(丹凤
)!
)"
I
#和(赤霞珠)"
C
#中的表达
[-
:
*0
!
2V
K
X>..-8/
K
X8=-5>.8=YAX>>,-,
:
>/>.-/?<7>?4Y589Y>3
K
>X4Y
I*
烟草子叶于
ML
培养基上预培养
%?
&
C*
烟草子盘和农杆菌在分化培养基上进行共培养&
O*#
个星期后烟草子叶生长出愈伤&
G*
愈伤组织开始长出真叶&
2*
将抗性芽移植到生根培养基上&
[*#
个星期后抗性芽出根
图
#"
!
毛葡萄(丹凤
)!
)
%
个
!
%
,-,
基因转入烟草与成苗
I*O8Y
;
5>?8/.=X837"/1#"((#(6(/&9
:
X>98/ML3>?-<3-/YAX>>?4
;
.
&
C*I=Y>X78)7<5Y-\4Y-8/8/?-==>X>/Y-4Y-8/3>?-<3
&
O*N8.-Y-\>>3JX
;
8.4
KK
>4X>?4=Y>X#9>>D
&
G*^X4/.
:
>/-7>3JX
;
8.98<5?J>743>
:
X>>/8/
:
>X3-/4Y>?3>?-<3
&
2*BX>>/
:
>X3-/4Y>?
>3JX
;
8.9>X>YX4/.=>XX>?8/Y8
K
54/Y-/
:
3>?-<3
&
[*@88Y=8X3-/
:
4
KK
>4X>?4=Y>X#9>>D
[-
:
*#"
!
A^>.>>?5-/
:
.8=YX4/.=>XX-/
:
YAX>>!
%
,-,
:
>/>.=X83!4
%
&"
%
&(
)
&*(+"$
@>A?*
(
G4/=>/
:
)!
)
-/Y87"/1#"((#(6(/&94/?.>>?5-/
:
.=8X3>?
H^ *
野生型烟草
HO10
&
^
#
%
^
%
*
转入
!
%
,-,!#
的烟草
HO10
株系&
^
(
%
^
$
*
转入
!
%
,-,%"
的烟草
HO10
株系&
^
+
%
^
#"
*
转入
!
%
,-,%!
的烟草
HO10
株系&
N*
阳性质粒对照&
M*M4XD>X
图
##
!
%
个
!
%
,-,
基因转入烟草
HO10
植株的
NO@
检测
H^ *W^HO10
&
^
#
^
%
*^X4/.
:
>/-75-/>.78/Y4-/-/
:
78/.YX<7Y8=
!
%
,-,!#
&
^
(
^
$
*^X4/.
:
>/-75-/>.78/Y4-/-/
:
78/.YX<7Y8=
!
%
,-,%"
&
^
+
^
#"
*^X4/.
:
>/-75-/>.78/Y4-/-/
:
78/.YX<7Y8=!
%
,-,%!
&
N*N54.3-?
&
M*M4XD>X
[-
:
*##
!
G>Y>7YYA>YAX>>!
%
,-,YX4/.
:
>/-75-/>.8=
7"/1#"((#(6(/&97\*HO10J
;
NO@4/45
;
.-.
#*
葡萄素!保留时间为
1*++$3-/
&
!*
紫檀芪!保留时间为
#(*##03-/
&
%*
反式白藜芦醇!保留时间为
#+*"1+3-/
&
(*
反式云杉新苷!保留时间为
!$*&1#3-/
图
#!
!
芪合酶基因"
L^ L
#表达产物高效
液相色谱分析的标准品图示
#*b-/-=>X-/
!
1*++$3-/
&
!*NY>X8.Y-5J>/>
!
#(*##03-/
&
%*^X4/.)X>.\>X4YX85
!
#+*"1+3-/
&
(*^X4/.)
K
-7>-?
!
$*&1#3-/
[-
:
*#!
!
L7A>34Y-7.Y4/?4X?
K
X8?<7Y.8=YA>>V
K
X>..-8/
=X83.Y-5J>/>.
;
/YA4.>
:
>/><.-/
:
TNRO7AX834Y8
:
X43
#!!
!
期
!!!!!!!!!!
杜杨建!等$中国野生毛葡萄(丹凤
)!
)
%
个芪合酶基因表达与功能分析
I*
野生型烟草
HO10
&
C*%
株转入
!
%
,-,%"
的烟草
HO10
株系&
O*%
株转入
!
%
,-,!#
的
烟草
HO10
株系&
G*(
株转入
!
%
,-,%!
的烟草
HO10
株系
图
#%
!
高效液相色谱分析转毛葡萄芪合酶"
!
%
,-,
#基因烟草
HO10
植株的表达产物
I*W^HO10
&
C*^X4/.
:
>/-75-/>.78/Y4-/-/
:
78/.YX<7Y8=!
%
,-,%"
&
O*^AX>>YX4/.
:
>/-75-/>.78/Y4-/-/
:
78/.YX<7Y8=!
%
,-,!#
&
G*[8:
>/-75-/>.78/Y4-/-/
:
78/.YX<7Y8=!
%
,-,%!
[-
:
*#%
!
2V
K
X>..-8/
K
X8?<7Y.8=.Y-5J>/>.
;
/YA4.>
:
>/>YX4/.
:
>/-7
5-/>.8=7"/1#"((#(6(/&97\*HO10J
;
TNRO7AX834Y8
:
X43
表
&
!
转毛葡萄(丹凤
$%
)的
&
个芪合成酶
1
3
060
基因烟草植株中芪类物质种类和含量的检测
4^J5>%
!
G>Y>7YYA>78/Y>/Y8=?-==>X>/Y=8X3.8=X>.\>X4YX85.-/YA>?-==>X>/Y!
%
,-,
:
>/>YX4/.
:
>/-75-/>.8=7"/1#"((#(6(/&97\*HO10
株系
R-/>
葡萄素
&
)b-/-=>X-/
%"
"
:
%
:
#
紫檀芪
NY>X8.Y-5J>/>
%"
"
:
%
:
#
反式白藜芦醇
X^4/.)X>.\>X4YX85
%"
"
:
%
:
#
反式云杉新苷
X^4/.)
K
-7>-?
%"
"
:
%
:
#
W^
!
%
,-,!#
!
%
,-,%" !$*"1+
!
%
,-,%! !$*%+#
基因的转基因烟草!反式云杉新苷含量为
!$*"1+
"
:
%
:
"表
%
#&而在阴性对照和转
!
%
,-,!#
的转基因
烟草
HO10
植株中均没有检测到上述
(
种芪类物质
的积累"表
%
#
%
!
讨
!
论
改进与提高欧洲葡萄的抗病性是世界葡萄育种
者研究的重要课题之一!培育欧洲葡萄品种抗白粉
病可以通过杂交育种获得抗性种质+!)%,!也可以通过
转基因途径定向改良欧洲葡萄的抗病性+!)(,自
#00+
年首次报道芪合成酶表达产物白藜芦醇对人
体的健康作用+(,和植物抗病性以来+#+)#0,!研究芪合
成酶基因及其表达功能一直是研究的重要方向与领
域+!#)!!,芪合酶是白藜芦醇代谢中的关键酶+#%,!芪
类化合物的合成与累积增加了植物的抗病性!这也
是近年来国内外学者研究植物抗病防御机制和反应
的核心所在+#)%!#+)!#!%)!(!$)!+,本研究就是根据芪合
成酶基因在植物中具有抗病作用!对人体具有保健
作用!毛葡萄(丹凤
)!
)存在着芪合酶基因+!#,!并且
可以在目的植物中表达的特点+!!,!我们克隆了中国
野毛葡萄 (丹凤
)!
)
%
个芪合酶基因
!
%
,-,!#
*
!
%
,-,%"
和
!
%
,-,%!
&通过接种葡萄白粉菌诱导*
外源施用
ICI
*
LI
*
M>EI
处理及采用非生物的高
温*低温和高盐胁迫处理!研究毛葡萄这
%
个
!
%
,-,
基因的表达特性!进一步将这
%
个芪合酶基
因转入模式烟草中!检测转基因植物的表达产物与
基因 功 能研 究 结 果 表 明!
!
%
,-,%!
相 较 于
!
%
,-,!#
和
!
%
,-,%"
在葡萄白粉菌诱导下表达显
著!且
!
%
,-,%!
转基因烟草
HO10
植株中芪类化合
物反式云杉新苷累积量较高!表明
!
%
,-,%!
积极
参与了葡萄早期的防御反应!这与
[:
等在葡萄
中研究白粉菌入侵时!芪合酶基因参与葡萄防御反
!!!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
应的基因的表达量会上调结果相一致+!&,另一方
面!国内外学者对生物信号分子
ICI
*
LI
和
M>EI
积极的参与植物的生长发育和防御反应也进行了研
究+!1)!0,植物在受到病原微生物入侵时能够启动复
杂的信号传导网络来获得局部和系统性抗性+%",!植
物信号传导网络中的
LI
*
M>EI
等抗病信号分子被
认为是病原菌侵染的次级信号!能提高许多病源菌
响应基因的表达+%#,!对模式植物拟南芥的研究表
明!
LI
信号途径主要参与抵御生物类胁迫中活体
营养型病原物如霜霉病菌*白粉病菌*假单孢杆菌的
防卫反应+%!)%%,!
M>EI
信号途径主要参与抵御生物
类胁迫中对坏死营养型病原物如灰霉菌*腐霉病菌
和土传病菌等的防卫反应+%(,!
ICI
则广泛地参与
调控植物生长发育以及抵抗逆境胁迫的多个方
面+%&)%$,在植物体内!各种抗病信号途径相互拮抗
或相互协同形成一个复杂的信号传递网络来增加植
物的防卫能力+%+,植物在生长发育过程中也常常
遭受诸如高温*低温和盐胁迫等逆境胁迫!均会造成
对生长发育的伤害+%1,逆境胁迫诸如高温*低温和
盐胁迫均能诱导
ICI
的合成来增加植物对逆境胁
迫的抗性+%0)(#,!植物内源
ICI
能促进能够充当第
二信使参与植物胁迫响应
T
!
_
!
产生+(!,本研究
表明在 (丹凤
)!
)与(赤霞珠)中受到逆境胁迫高温*
低温和盐胁迫处理下这
%
个
!
%
,-,
基因均存在诱
导!其 中
!
%
,-,!#
基 因 对 高 盐 的 表 达 明 显!
!
%
,-,%!
基因对高温的表达较高!而这
%
个毛葡萄
(丹凤
)!
)芪合酶基因
!
%
,-,
基因在高温*低温和高
盐的胁迫表现了不同的反应与表达
综上所述!通过对中国野生毛葡萄(丹凤
)!
)的
%
个基因
!
%
,-,!#
*
!
%
,-,%"
和
!
%
,-,%!
在接种
葡萄白粉病*外源施用小分子物质和非生物高盐*高
温与低温的胁迫处理下基因表达的比较!筛选出中
国野生华毛葡萄(丹凤
)!
)芪合酶基因
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