全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
!"#)###$
基金项目$十二五国家科技支撑计划课题"
!"#%123"#1"*
#&国家自然科学基金"
%#(*"$0)
#&北京市共建项目专项
作者简介$王
!
晶"
#00"&
#!女!在读硕士研究生!主要从事园林植物资源与育种研究
456-7
$
89/
:,
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!
#$%+;95
"
通信作者$潘会堂!教授!博士生导师!主要从事园林植物与观赏园艺研究
456-7
$
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>
6/
!
?
,
@A+BCA+;/
基于荧光原位杂交技术的紫薇属植物核型分析
王
!
晶#!杨冰洁#!潘隆应!!蔡
!
明#!丁晓六#!潘会堂#"!张启翔#
"
#
花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室!国家花卉工程技术研究中心!城乡生态环境北京实验室!北京林业大学 园林学
院!北京
#"""D%
&
!
福建金森林业股份有限公司!福建三明
%$)"""
#
摘
!
要$以紫薇"
!"
#
$%&%($)*"*+,*-"
#(尾叶紫薇"
!.-"/,""
#(屋久岛紫薇"
!.
0
"/%*$*
#和福建紫薇"
!.1*)**
#
(
种
紫薇属植物为材料!利用染色体荧光原位杂交技术"
EFGH
#获得了
(
种紫薇属植物的有丝分裂中期染色体
EFGH
图
及核型参数!分析了
()GI3J2
在紫薇属植物染色体上的数量和分布特点结果表明!
(
种紫薇属植物染色体上均
具有
#
对
()GI3J2
杂交位点!位于较长染色体短臂的近端部!紫薇(尾叶紫薇(屋久岛紫薇和福建紫薇的核型公式
分别为
!/K(DK!LM!(5M!!.5
(
!/K(DK%"5M#D.5
(
!/K(DK!LM!"5M!$.5
和
!/K(DK!LM%!5M
#(.5
!均为
!2
型该研究首次获得了紫薇属植物
()GI3J2
荧光原位杂交核型!为紫薇属植物亲缘关系研究和细
胞生物学研究提供了分子细胞学依据
关键词$紫薇属&
()GI3J2
&荧光原位杂交技术&核型
中图分类号$
N%(%+!
M
!
&
N*D#
文献标志码$
2
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2
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R2JP1-/
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S2JT9/
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3FJPW-697-A
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S2JHA-=6/
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XH2JPN-Y-6/
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U
9@[I/65B/=67S76/=.PBI5
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J6=-9/674/
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VB/=BI@9I@79I-;A7=AIB
!
1B-
,
-/
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U
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!
1B-
,
-/
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U
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EFGH
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5979
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U
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#
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$
!"
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()GI3J2
&
EFGH
&
b6I
U
9=
U>
B
!!
紫薇"
!"
#
$%&%($)*"*+,*-"T+
#是中国重要的夏
季观花植物!具有花色丰富(色泽艳丽(夏季单花及花
序观花期长等观赏特性!同时还有耐高温(耐污染(栽
培养护简单等优点)#*!在中国已有
#)""
多年的栽培
史关于紫薇属植物!前人在种质资源调查)!(*(植物
遗传多样性分析)D*(新品种培育 )0##*等方面进行了
广泛研究由于该属植物的染色体很小!染色体数目
较大!导致紫薇属植物制片难度大!传统的核型分析
方法很难明确识别其染色体前人关于紫薇属植物
核型研究较少!陈瑞阳)#!*报导了紫薇的核型公式为
!D5M#D.5M!.=
!染色体数目为
!/K(D
&另有研究
表明紫薇(屋久岛紫薇(福建紫薇的染色体数目均为
(D
)
#%
*
!但未获得其相应的核型公式
原位杂交技术"
*+&*/<
U
?I-C-`6=-9/
!
FGH
#是根
据核酸分子碱基互补配对原则!将探针与经过染色
体变性的
3J2
进行碱基互补配对!结合成专一的(
可被检测到的核酸杂交分子!经过特定检测手段显
示探针在染色体上的物理位置的技术手段原位杂
交技术在植物多倍体的起源(非整倍体的鉴定(物种
特定基因序列在染色体上的物理定位(染色体导入片
段确定(杂种鉴定(植物基因组间关系(植物亲缘关系
研究等方面有很大的优势!并得到广泛的应用)#(!"*
在亚洲百合+
SB=-=1I-
:
-==B
,(青岛百合"
!*1*/)&*+
#
2
"/$+&$
#及其杂交后代进行
()GI3J2
物理定位!研
究表明+
SB=-=1I-
:
-==B
,有
#"
个
()GI3J2
位点(青岛
百合有
D
个位点!所有杂种后代均有
0
个
()GI3J2
位点!说明杂种后代的染色体分别源于+
SB=-=1I-
:
-==B
,和青岛百合)!#*利用双色荧光原位杂交技术
"
EFGH
#对
%
种蔷薇属植物的中期染色体进行
)G
I3J2
(
)GI3J2
的物理定位!通过位点数目及分
布特点的观察!可以为识别
%
种蔷薇属植物的染色
体提供明确有效的分子细胞学标记)!!*利用栽培
黄瓜全基因组
3J2
与
()GI3J2
同时作为探针!
进行
!
个黄瓜变种染色体荧光原位杂交!可以对
!
个黄瓜变种每条染色体进行清晰地鉴别!并快速建
立
!
个变种的核型模式)!%*荧光原位杂交技术与
E^TS
(
SV^
(
G9A=(
2^S3
或染色体分带等结
合!可以相互印证!为物种的遗传改良研究提供技术
支撑)!(!)*
为了给紫薇属植物研究提供分子细胞学证据!
本研究以
(
种紫薇属植物为材料!系统研究了紫薇
属植物染色体荧光原位杂交技术体系!首次获得了
基于
EFGH
技术的紫薇"
!.*+,*-"
#(尾叶紫薇"
!.
-"/,""
#(屋久岛紫薇"
!.
0
"/%*$*
#和福建紫薇"
!.
1*)**
#的染色体核型图!并分析了
()GI3J2
在
(
种
紫薇属植物中期染色体上分布特点研究结果为紫
薇属植物基因在染色体上的物理定位提供了技术基
础!也为进一步在分子细胞学水平探讨紫薇属植物
亲缘关系奠定了基础
#
!
材料和方法
=+=
!
取材
实验材料为紫薇品种+多花粉,(尾叶紫薇(屋久
岛紫薇和福建紫薇!均栽植于北京昌平小汤山国家
花卉工程技术研究中心花卉种质资源圃取各材料
当年生枝条茎尖生长点!
&!"c
条件下于改良固定
液)无水乙醇
d
冰醋酸"分析纯#
d
三氯甲烷"分析
纯#
K)d%d!
!
3
%
3
*中固定过夜"
#"
"
#!<
#待用
=+>
!
染色体制片
参考本课题组前期研发的方法)#%*!将固定好的
生长点用蒸馏水洗脱后!在
!+)e
纤维素酶
d!+)e
果胶酶
d"+"#e
蛋白酶
ZK!d#d%
"
3
%
3
#的混合
酶液中
%*c
水浴酶解
(
"
)<
!通过火焰干燥法获得
染色体制片!置于
&!"c
保存备用
=+?
!
探针制备
()GI3J2
克隆自玉米"
4$
5
)"
5
#!探针质粒为
中国农业大学玉米改良中心金危危教授实验室馈
赠!质粒浓度
(*+)/
:
%
#
T
采用缺口平移法进行探
针标 记!地 高 辛 标 记 试 剂 盒 "
9^;!
3-
:
J-;b
aI6/.76=-9/L-Y
!
J9+##*()D#$0#"
#标记质粒!按照
说明书操作
=+4
!
染色体制片处理
于
&!"c
冰箱中取出做好的染色体制片!
$)
c
烘箱内干燥
#<
!制片上加
#""
#
T"+#5
:
%
5T
J^2
酶溶液!盖上封口膜!放入底部有水的湿盒中!
%*c
条件下分别温育
"+)
(
#
和
#+)<
揭去封口
膜!
fGGV
摇洗
!f)5-/
后无需晾干!加
!"
#
T
"+#5
:
%
5T
胃蛋白酶
Z
溶液于染色体片上!盖上封
口膜!放入底部有水的湿盒中!在
%*c
条件下分别
温育
)
(
#"
和
#)5-/
"表
#
#
=+5
!
杂交液的制备
按照每张染色体制片加入
!"
#
T
杂交液的量配
制杂交液!取
(
#
T#"5
:
%
5T
鲑鱼精溶液于离心管
中!分别加入
#
(
!
(
%
( 和
)
#
T
探针标记混合液!放
于
$)c
烘箱内开盖烘烤至
(
#
T
刻度处&加入去离
表
=
!
杂交前染色体制片的处理
a6?7B#
!
3-@@BIB/=
>
IB=IB6=5B/=5B=<9C.@9IEFGH
9@!"
#
$%&%($)*".
>
B;-B.
处理编号
aIB6=5B/=J9+
J^2
酶处理时间
J^6.B=IB6=5B/=
=-5B
%
<
胃蛋白酶
Z
处理时间
SI9=B-/6.BZ
=IB6=5B/==-5B
%
5-/
$
"+) )
%
"+) #"
&
"+) #)

# )
(
# #"
)
# #)
*
#+) )
+
#+) #"
,
#+) #)
#%
#
期
!!!!!!!!!!!!
王
!
晶!等$基于荧光原位杂交技术的紫薇属植物核型分析
子甲酰胺
#"
#
T
(
!"fGGV
溶液
!
#
T
(
)"e 3G
溶液
(
#
T
!短暂离心
=+@
!
变性
!
#
"探针变性
!
将制得的杂交液在
0)c
金属浴
避光变性
#"5-/
!转入冰水中处理
#"5-/
!得变性
探针
!"染色体变性
!
每张染色体制片加入
#""
#
T
变性液"去离子甲酰胺
dCCH
!
[d!"fGGVK*d!d#
!
3
%
3
#!把变性液加到染色体制片上!盖上盖玻片!
D)
c
烘箱内分别避光变性
!
(
!+)
(
%
(
%+)
(
(
(
(+)
和
)
5-/
!然后迅速甩脱盖玻片!用
*"e
(
0)e
(
#""e
乙
醇
&!"c
逐级脱水!每级脱水
)5-/
!空气中晾干
待用
=+A
!
原位杂交和图像摄取
杂交液变性后加在染色体制片上!放入湿盒中
%*c
恒温暗处理
#$
"
#D<
!经
!fGGV
和
#fS1G
洗脱每张制片加
#""
#
T!
#
:
%
5T
地高辛抗体
"
9^;!
J9+##!"**)"0#"
!
)e1G2
溶液稀释#!
%*
c
温育
#<
!
#fS1G
洗脱晾干!加上约
#%
#
T
含有
32SF
的封片液!于
[7
U
5
>
A.1W)#
荧光显微镜下
镜检!
V
U
=9\-.-9/
软件采集图像
=+B
!
数据分析
利用
S<9=9.<9
>
软件进行图像处理后进行染色
体数据统计
!
!
结果与分析
>+=
!
染色体制片前处理方法对杂交效果的影响
不同的染色体制片前处理对杂交效果有不同的
影响通过观察发现!染色体制片前处理
$
杂质太
多!完全观测不到杂交信号&处理
%
杂质较少!但杂
交信号不清晰&处理
&
有部分染色体丢失!且杂交信
号不清晰&处理

杂质较多!杂交信号不清晰&处理
(
杂质较少!杂交信号也较清晰&处理
)
部分染色体
丢失!杂交信号较清晰&处理
*
杂质较少!但杂交信
号不清晰&处理
+
部分染色体丢失!杂交位点较清
晰&处理
,
染色体丢失严重!杂交信号不清晰综
上!
#""
#
T"+#5
:
%
5T J^2
酶处理
#<
!结合
!"
#
T"+#5
:
%
5T
胃蛋白酶
Z
溶液
%* c
温育
#"
5-/
!细胞质等杂质去除较完全!信号较清晰!探针
与染色体杂交效果较好!制片效果最好
>+>
!
探针用量对杂交效果的影响
探针用量为
#
"
!
#
T
时!杂交信号太弱!亮度较
小!甚至难以看清"图
#
!
2
#&探针用量为
%
"
(
#
T
时!信号点明亮度适中!信号清晰可辨!效果最好"图
#
!
1
#&当探针量为
)
#
T
时!不仅影响信号显示!还
会出现杂质点"图
#
!
V
#综合分析认为适宜的探针
用量为
%
"
(
#
T

>+?
!
变性时间对杂交结果的影响
D)c
烘箱内避光变性时间为
!
"
%5-/
时!制
片染色体
3J2
双链未完全打开!无法进行碱基互
补配对!探针无法与靶染色体杂交!无特异性信号出
现&变性
%+)5-/
!染色体形态完好!变性完全!信号
点清晰!数目稳定!观察得到的杂交效果最好染色
体变性时间大于或等于
(5-/
时!由于变性时间过
长!染色体会发生明显的膨胀变形!且时间越久!膨
胀变型越明显
>C4
!
450&67+
在紫薇属植物中期染色体上的物理
定位
在获得优化的紫薇属
EFGH
技术体系的基础
上!得到了
(
种紫薇属植物中期染色体
()GI3J2
EFGH
制片!并测定核型参数!进行核型分析
(
种
紫薇属植物染色体数目均为
!/K!YK(D
!紫薇属植
物染色体绝对长度在
#
"
!
#
5
之间!属小染色
体植物!且很多染色体呈颗粒状"表
!
#不同种类
紫薇属植物的核型公式和染色体相对长度略有不
同按照由对称到不对称的核型分类方法!可以判
定紫薇属植物在植物进化上比较原始
()GI3J2
在紫薇(尾叶紫薇(屋久岛紫薇和福
建紫薇染色体有丝分裂中期染色体上的定位如图
!
和图
%
所示
(
种紫薇属植物染色体与
()GI3J2
探针杂交后均得到了
#
对杂交信号点!信号点均位
于较长染色体短臂近端部!紫薇染色体杂交信号位
表
>
!
4
种紫薇属植物核型基本参数
a6?7B!
!
Z6I
U
9=
U>
B
>
6I65B=BI.9@@9AI!"
#
$%&%($)*".
>
B;-B.
种名
G;-B/=-@-;/65B
染色体数目
JA5?BI
相对长度
B^76=-\B7B/
:
=<
最长%最短
T=
%
G=
核型公式
E9I5A769@b6I
U
9=
U>
B.
染色体相对长度
B^76=-\B7B/
:
=<
核型分类
Z6I
U
9=
U>
B
紫薇
!.*+,*-" (D !+**
"
)+!0 %+!) !/K(DK!LM!(5M!!.5 !/K(DK($L
#
M!G !2
尾叶紫薇
!.-"/,"" (D #+))
"
!+0$ #+0! !/K(DK%"5M#D.5
!/K(DK($L
#
M!G
!2
屋久岛紫薇
!.
0
"/%*$* (D !+*#
"
)+#) #+0" !/K(DK!LM!"5M!$.5 !/K(DK($L
#
M!G !2
福建紫薇
!.1*)** (D !+$!
"
)+D# !+$" !/K(DK!LM%!5M#(.5
!/K(DK((L
#
M(G
!2
!%
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
2+!
#
T
&
1+%+)
#
T
&
V+)
#
T
图
#
!
探针用量对杂交效果的影响
E-
:
+#
!
a>
I9?B\97A5B9/<
U
?I-C-`6=-9/
2+
紫薇&
1+
尾叶紫薇&
V+
屋久岛紫薇&
3+
福建紫薇&
6+()GI3J2
杂交信号"红色#与
32SF
复染的
染色体"蓝色#的合成图&
?+()GI3J2
杂交信号&
;+
有丝分裂中期染色体
图
!
!
()GI3J2
在
(
种紫薇属植物中期染色体上的物理定位
2+!.*+,*-"
&
1+!.-"/,""
&
V+!.
0
"/%*$*
&
3+!.1*)**
&
6+25BI
:
BC-56
:
B9@=>
<6.B;=:
/67.+()GI3J2
"
IBC
#!
32SF
"
?7AB
#&
?+EFGH.-
:
/67.9@()GI3J2
&
;+LB=6
>
<6.B;E-
:
+!
!
T9;67-`6=-9/9@()GI3J29/5B=6
>
<6.B;#
$%&%($)*".
>
B;-B.
%%
#
期
!!!!!!!!!!!!
王
!
晶!等$基于荧光原位杂交技术的紫薇属植物核型分析
2%
6+
紫薇&
1
%
?+
尾叶紫薇&
V
%
;+
屋久岛紫薇&
3
%
C+
福建紫薇
图
%
!
(
种紫薇属植物核型图和核型模式图
2
%
6+!.*+,*-"
&
1
%
?+!.-"/,""
&
V
%
;+!.
0
"/%*$*
&
3
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C+!.1*)**
E-
:
+%
!
aU
9=
U>
B9@@9AI!"
#
$%&%($)*".
>
B;-B.
(%
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
于第
!
对染色体的染色体短臂近端部!尾叶紫薇染
色体杂交信号位于第
#
对染色体上!屋久岛紫薇染
色体杂交信号位于第
(
对染色体上!福建紫薇染色
体杂交信号位于第
!
对染色体上
%
!
讨
!
论
?+=
!
染色体荧光原位杂交的影响因素
!
#
"杂交前染色体制片的处理
!
染色体制片预
处理可有效去除细胞中的
J^2
和蛋白质!减少探
针与载玻片上核酸和蛋白质的非特异性结合胃蛋
白酶可消化细胞中残留的杂质!暴露
3J2
核酸片
段!利于检测分子的穿透!增加探针与靶核酸的结合
率多次试验发现!用胃蛋白酶处理紫薇属植物细胞
#"5-/
的消化效果最好!
#""
#
T"+#5
:
%
5T J^2
酶
溶液在
%*c
湿盒中温育
#<
消化结果最佳
!"杂交液浓度
!
本试验中!紫薇属植物探针用
量
#
"
!
#
T
"浓度
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了使探针与靶染色体结合!双链
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探针和染色
体杂交前必须经过变性处理!呈单链状态!才能按照
碱基互补配对原则进行杂交通过共变性或染色
体(探针分开变性的方法均可以达到变性目的!但共
变性的变性时间不好掌握!而分开变性可以有效防
止目标染色体复性在紫薇属植物原位杂交中采用
对染色体和探针分开变性的方法效果较好
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紫薇属植物的核型
紫薇属植物的染色体非常小!绝对长度在
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!染色体形态多数呈颗粒状!有很多染色体仅凭
肉眼很难分辨其是否同源!错配的几率非常大本
研究得到的紫薇核型公式与前人的结果)#!*有一定
的相似性!如$核型公式中均为
5
"着丝点位于中部#
或者
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"着丝点位于亚中部#的居多!染色体相对组
成中为
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#
"中短染色体#居多&同时!所得的核型公
式也存在一定差异!紫薇属植物常规核型分析中染
色体均经人为配对!加之染色体非常小(数目较多!
且不排除染色体变形的可能!所以不同的研究得到
的结果有差异是在所难免的在高等植物中!
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与核仁的形成有关!前人的研究
表明随体染色体数目与
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杂交位点的数目
一般是一致的!如在棉花)!0*(玉米)%"*(水稻)%#*等作
物中!
()GI3J2
荧光杂交位点数目与随体数目相
同!但在芸薹属植物原位杂交试验中!所得到的杂交
信号的个数多于随体染色体数)%!*本试验中发现!
(
种紫薇属植物均具有
#
对
()GI3J2
杂交位点!
故推测
(
种紫薇属植物均具有
#
对随体!但由于紫
薇染色体太小!随体染色体的存在不能通过肉眼识
别!所以还需通过其他多种检测手段才能确定是否
存在故而在今后的研究中!如果能够开发出更多(
更有效的特异性探针!并在靶染色体上进行精确的
物理定位!将会推动紫薇属植物以及其他小染色体
植物在染色体分析(核型分析及分子细胞生物学等
方面的深入研究
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在紫薇属植物中期染色体上的定位
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编码的次缢痕一般在染色体短臂近
着丝点部位!或是位于端粒上微小染色体所含基
因较少!其染色体场发育不全!不具有正常的着丝点
和端粒本研究中!
(
种紫薇属植物均仅有
#
对
()G
I3J2
杂交位点!可能是小染色体的着丝点或端粒
等部位发育不全
()GI3J2
是一种有效的染色体
标记!可为研究基因组在分子或染色体水平的进化
提供证据!有效反映植物种(属间的分化程度利用
单色
EFGH
和双色
EFGH
技术在几种葫芦科植物染
色体上的定位表明在种属分化过程中葫芦科植物可
能进行过染色体非整倍化以及染色体断裂(重排或
不等价交换)%%*所以!通过观测紫薇属植物不同种
间染色体上
()GI3J2
位点的数目(位置(信号强
弱!可以在细胞分子水平对紫薇属植物进行分类鉴
别(判定其亲缘关系与系统进化程度随着研究的
深入!必将获得更多专属于紫薇属植物的基因序列
I3J2
在紫薇属染色体上的成功定位不仅有助于在
细胞和分子水平上对紫薇属植物进行系统的研究!
也是构建紫薇属植物物理图谱的第一步
参考文献!
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