全 文 ：书西北植物学报!
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&修改稿收到日期$!"#$)"$)!" 基金项目$国家自然科学基金"
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#&教育部博士点基金优先发展领域"
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#&陕西省财政厅项目"
!"#"12$""$
#&陕西省
科学院科技计划"
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#
作者简介$柏国清" #4(% #!男!在读博士研究生!助理研究员!主要从事系统与进化植物学研究 5)67.8$
9
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6/+<79+7=+=0
"
通信作者$赵桂仿!教授!主要从事植物系统进化与分子生态研究 5)67.8$
:
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!
0BC+DEC+=0
中国特有金钱槭属植物物种分化研究
柏国清#!!李思锋#!李为民#!李忠虎!!杨
!
娟%!赵桂仿!"
"
#
陕西省西安植物园%陕西省植物研究所!西安
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!
西北大学 生命科学学院 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实
验室!西安
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&
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西安交通大学 环境与疾病相关基因教育部重点实验室 生物医学研究实验中心%医学院遗传学与分子生物
学系!西安
,#""&#
#
摘
!
要$金钱槭属" !" #$%&(")F8.G+
#隶属于槭树科"
H=DI7=D7D
#!是北温带植物区系中古老(残遗的木本属之一!为
中国特有属!属下仅包括金钱槭"
!*+"(%(+"+F8.G+
#和云南金钱槭"
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-
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K
#
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个物种本实验从形态学(
分子遗传学及基因序列分析等方面对金钱槭"
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#和云南金钱槭"
!*,
-
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K
#进行对比研究!
探讨其物种间分化程度结果表明$" # #形态学研究显示两物种形态性状存在显著差异!表明其在形态上发生了显 著分化&" ! #基因组 LMH 的 HNOP 标记分析表明!两物种间存在极显著遗传分化" ! QR S"+%4"* #!在物种水平及群 体水平!两物种遗传多样性及遗传变异水平皆有明显差异"金钱槭 # 云南金钱槭#&" % #从 TD0U70V 数据库中选出 ! 物种已知的叶绿体基因" # +./0$&(!
(
$&(!0$&(1
(
$&(2 ($&(20$&(3 ( & # 4#& #和核基因 WRQ " 516# ($*(6789
(
516!
#进
行序列进化比对分析!
$)XD/X 检验表明! 物种叶绿体基因序列间有极显著差异研究结果表明$金钱槭和云南金钱
槭两物种间产生了极显著的分化!推测可能由于长期的地理隔离所致
关键词$金钱槭&云南金钱槭&形态学&分子遗传学&种间分化 中图分类号$
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文献标志码$H$%&()
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金钱槭属"
!"
#
$%&(")F8.G+ #隶属于槭树科 " H=DI7=D7D #!是北温带植物区系中古老(残遗的木 本属之一!为中国特有属*#+该属植物为落叶乔木! 花期 * " & 月!果期 ( " #" 月!染色体 !0S#( !属于 少种属属下仅包括云南金钱槭" !*, - %&)()JD0) I K #和金钱槭" !*+"(%(+"+F8.G+ # ! 个物种!分别被 列为国家二级(三级珍稀濒危保护植物两物种形 态特征存在显著差异!二者不同之处在于金钱槭为 圆锥状花序无毛!而云南金钱槭圆锥状花序有密的 黄绿色短绒毛&金钱槭果实小于云南金钱槭两物 种在自然地理分布区上也存在着明显不同!无重叠 分布区金钱槭分布于中国陕西(甘肃(河南(湖北( 湖南(贵州(四川及重庆等地而云南金钱槭仅零星 分布于中国云南省文山县(蒙自县(屏边县等地 区*!+长期以来!关于金钱槭属植物的研究多集中 在该属的形态发育和系统分类方面*%)&+鉴于金钱 槭属内两物种生物学性状存在明显差异!本研究拟 对金钱槭和云南金钱槭进行形态学比较研究!检测 两物种的形态分化程度 HNOP " 76 b 8.>.DE>I7 : 6D0X8D0 : X@ b A8 K 6AI) b @./6 #标记是一种用于群体分子生态(群体遗传研 究的有效方法*,+近年来在种群生态(品系鉴定(基 因定位(遗传多样性研究等方面表现出广泛的应用 价值 HNOP 是显性标记!该技术不但具备其他 LMH 分子标记如$
H`PL
(
N`OP
(
QQ`
等所具有的
优点!而且还具有用量少(灵敏度高(扩增条带丰富(
可重复性高(快速高效等特点!一次分析可获得基因
组大量的遗传信息!并可检测出大量的多态性条带!
特别是对具亲缘关系及遗传上区别不大的种类来说
是较合适的分子标记方法*()4+本研究将结合形态
学(基于基因组
LMH
的
HNOP
标记对金钱槭属内
两物种进行比较研究!分析两物种的形态分化程度!
检测两物种的遗传多样性水平!揭示其种间分化程
度!探讨种间亲缘关系另外结合
TD0U70V
中两物
种已知的几个叶绿体基因及核基因的序列比对结
果!从分子水平进一步揭示两物种间的分化水平!为
金钱槭属及槭树科植物的进化生物学研究奠定理论
基础
#
!
材料和方法
>+>
!
研究材料
本研究所用的植物材料分别采自金钱槭自然地
理分布区陕西(河南(甘肃(四川(重庆(湖北(湖南(
贵州等
(
个省区的
#%
个居群!云南金钱槭采自云南
境内
*
个居群"表
#
#为保证取样的可靠性!对各
个居群中的每个被调查个体!从东(南(西(北
*
个方
向选最基部分枝和近基部第
%
个分枝!从分支中部
选取
!
对羽状复叶!将复叶上近基部的
&
片小叶摘
下浸于
NHH
固定液中&并从东(西(南(北
*
个方
向!分上下
!
层在果序上选取成熟翅果!并压制成标
本&同时采集金钱槭(云南金钱槭各个居群新鲜幼嫩
的植物叶片!迅速装入密封袋用硅胶迅速干燥!带回
实验室置于超低温冰箱"
("c
#保存!用于分子遗
传学实验
>+?
!
研究方法
>+?+>
!
形态学研究
!
参照李珊*#"+的方法!形态学
性状研究共测量
#,
项宏观(微观形态性状每个居
群取
%
个个体的平均值作为该居群的各项指标数
值用
QPQQ##+"
软件包计算同种内不同居群各项
形态指标的平均值
d
标准误差!用
FI.
:
.0PIA,+$软 件对 ! 种植物各项形态学指标数值分别进行单因素 方差分析!在 "+"# 及 "+"$
水平下对
!
物种总样本
的各项数值进行显著性
$检验 >+?+? ! 群体遗传学研究 ! 采用植物基因组 LMH 的 HNOP 分子标记对金钱槭和云南金钱槭进行遗 传多样性(遗传结构和种间分化研究采用改良的 _RHU 法提取金钱槭属植物基因组 LMH * ##)#! + HNOP 反应按照酶切连接一步法(预扩增 ) 选择 性扩增两步法进行*#!+选择性扩增从 %! 对 :+$
#
Z%
%
/+%
#
Z%
引物组合中筛选出多态位点检出率
*!##
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
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%$卷 表 > ! ? 个物种的居群信息 R798D# ! PA b C87X.A0ID/ACI=DA>XBA/ b D=.D/ 物种 Q b D=.D/ 居群编码 PA b +MA 地点 OA=7X.A0 数量 Q76 b 8D/.?D 海拔 H8X.XCED % 6 经度 OA0 : .XCED 纬度 O7X.XCED 金钱槭 !" #$%&(")+"(%(+"+
RUQ
陕西太白山
R7.97.2AC0X7.0
!
Q@770<. #" ##$* #",e*&f %%e!$f
O^Q
甘肃小陇山
.^7A8A0
:
2AC0X7.0
!
T70/C 4 #$!& #"&e""f %*e!#f _L四川川洞子 _@C70EA0 : ?. ! Q.=@C70 #% #*&( #"!e*!f %"e!(f OLT 四川陇东沟 OA0 : EA0 : g78D K ! Q.=@C70 #" #4$" #"!e*$f %"e!4f 1\^ 重庆箭竹 1.70?@C ! _@A0 :; .0 : & #*,4 #"(e*%f %!e"%f \PJ 湖南纸棚河 \@. b D0 : @D ! JC070 ( #%(( ##"e%!f %"e"!f JPQ 湖南壶瓶山 JC b .0 : 2AC0X7.0 ! JC070$ #$"" ##"e%#f %"e"#f 1_Q 湖北九冲山 1.C=@A0 : 2AC0X7.0 ! JC9D. 4 (," ##"e%$f %#e!*f
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湖北万家沟
[70
-
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!
JC9D. ( (## ##"e%%f %#e!*f
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湖北龙门河
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:
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湖北猪槽沟
\@C=7Ag78D
K
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JC9D. 4 #,%$##"e$$f %#e"$f
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湖北青潭湾
Y.0
:
X70B70
!
JC9D. , #&($##"e$$f %#e"%f Q` Q 河南石人山 Q@.ID02AC0X7.0 ! JD070 , ##%( ##!e#&f %%e*%f 云南金钱槭 !" #$%&("),
-
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云南文山
[D0/@70
!
]C0070 $!!#, #"*e!*f !%e%,f 2云南蒙自 2D0 : ?. ! ]C0070$ #4"! #"%e!%f !%e!*f
PU
云南屏边
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:
9.70
!
]C0070 $!"#4 #"%e$!f !%e"#f
JOR
云南黑龙潭
JD.8A0
:
X70
!
]C0070 & #4!% #"!e$*f !$e"!f
高(扩增结果稳定的
(
对引物组合"
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%
/)
_HH
(
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%
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(
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%
/)_HT
(
:)THT
%
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_HH
(
:)THT
%
/)_HH
(
:)THT
%
/)_H_
(
:)THT
%
/)
_RT
(
:)THT
%
/)_RR
#!对金钱槭和云南金钱槭进行
比较研究
扩增结果按照条带的有无"显性(隐性#记为
"
(
#
数据!形成
HNOP
原始数据矩阵应用
PFPT5M5
"
GDI+#+%#
#
*
#%
+计算种水平(群体水平的多态位点百分
率"
::;
#(
Q@700A0
多样性指数"
5
#(
MD.
基因多样性
指数"
<
#以及种内居群间遗传分化系数"
=
/X
#检测
种内群体间基因多样度"
<
X
#以及群体内基因多样度
"
<
/
#
H2FgH
"
H078
K
/./A>2A8D=C87Ig7I.7X.A0
#用
来分析种间遗传分化系数"
!
QR
#以及种内居群间(居
群内遗传变异成分"
>?
#
>+?+@
!
序列比对分析
!
从
TD0U70V
搜索金钱槭和云
南金钱槭叶绿体基因"
#
+./0$&(! ($&(!0$&(1 ($&(2
(
&
#
4#&
(
$&(20$&(3
#以及核基因
WRQ
"
516#
(
$*(6789 ( 516! #!采用 U.A5E.XG$+"+&
*
#*
+软件中
_8C/X78[
进行
序列比对分析!计算插入缺失(成对序列的相似性等
采用
25THG$+" * #$
+分析成对序列的碱基组成(相同
位点(转换(颠换(转换与颠换比值(同一基因及间隔
区序列间的遗传距离采用
QPQQ##+"
软件对两物
种已知叶绿体基因序列进行显著性检验
!
!
结果与分析
?+>
!
形态学分析
对金钱槭和云南金钱槭植物的
#,
项形态指标
"表
!
#分析比较发现!云南金钱槭小叶长(小叶宽(
小叶脉数及复叶叶柄长高于金钱槭!且有显著差异
云南金钱槭果实长(果实宽(果实厚及果实重量高于
金钱槭!且有显著差异云南金钱槭种子长(种子
宽(种子厚及种子重显著高于金钱槭通过结果分
析发现!两物种形态水平存在显著差异!较明显的差
异是果实的大小(种子的重量及小叶形态
?+?
!
遗传多样性
通过筛选出的
(
对引物组合对金钱槭和云南金
钱槭进行选择性扩增!共得到
%!*
个扩增片段!由表
!
可以看出!金钱槭种内多态性片段"
::;
#为
(&+,%h
!云南金钱槭为
,(+"4h
&
MD.
)
/
基因多样性
指数"
<
#在金钱槭和云南金钱槭物种水平分别为
"+%%!#
和
"+%"*,
&
Q@700A0
多样性指数"
5
#在
!
物
种水平分别为
"+*(,*
和
"+**$" 在群体水平! % 个指数" ::; ! < ! 5 &表 % #在金钱槭种群内平均值 为$,+!4h
(
"+!%*%
(
"+%%4$!在云南金钱槭种群内$!##
&
期
!!!!!!!!!!!!!!!
柏国清!等$中国特有金钱槭属植物物种分化研究 为$!+#&h
(
"+!"**
(
"+!44#

H2FgH
分析表明在
金钱槭种内有
!#+$%h 变异发生在群体间! ,(+*,h 变 异存在于群体内&云南金钱槭种内有 !&+*4h 变异发 生在群体间! ,%+$#h
变异存在于群体内
?+@
!
遗传分化
本研究对金钱槭(云南金钱槭两物种的基因多
样性"
MD.
)
/
#进行分析!结果"表
%
#表明$金钱槭的 基因多样度为 "+%%%# " < X #和 "+!%*! " < / #!云南金 钱槭为 "+%"%$
"
<
X
#和
"+!"**
"
<
/
#&两物种居群间
遗传分化指数"
=
/X
#分别为
"+!4,"
和
"+%!&&
&基因流
"
8
6
#分别为
#+#(%(
和
#+"%#"
!
H2FgH
分析表明
金钱槭与云南金钱槭两种间存在极显著的遗传分化
表
?
!
?
个物种的形态比较
R798D!
!
2AI
b
@A8A
:
.=78=A6
b
7I7X.A0A>XBA/
b
D=.D/
项目
WXD6
金钱槭
!*+"(%(+"+
云南金钱槭
!*,
-
%&)()
叶形态指标
OD7>6AI
b
@A8A
:K
小叶长
OD0
:
X@A>>A8.A8D
%
=6 4+"(9 #!+$&7 小叶宽 [.EX@A>>A8.A8D % =6 !+!(9 %+"(7 小叶数 MC69DIA>>A8.A8D ##+,*7 #%+"*7 小叶脉数 MC69DIA>0DIG7X.A0 #,+ !%+*(7 主侧脉夹角 H0 : 8DA>0DIG7X.A0 *,+$%+4#7
复叶叶柄长
OD0
:
X@A>70/7D
%
=6 ,+4&9 4+&"7
小叶形系数
_AD>>.=.D0XA>8D7>>AI6 !+*!9 *+"*7
果实形态指标
NIC.X6AI
b
@A8A
:K
果实长
OD0
:
X@A>>IC.X
%
=6 !+%49 *+,,7
果实宽
[.EX@A>>IC.X
%
=6 !+##9 *+((7
果实厚
R@.=V0D//A>>IC.X
%
=6 "+"49 "+%(7
果实重
[D.
:
@XA>>IC.X
%
:
"+"!9 "+!,7
果梗长
OD0
:
X@A>>IC.X/X78V
%
=6 #+*#7 #+$"7 果行系数 _AD>>.=.D0XA>>IC.X>AI6 #+#%7 "+4,9 种子形态指标 QDDE6AI b @A8A :K 种子长 OD0 : X@A>/DDE % =6 "+&%9 #+##7 种子宽 [.EX@A>/DDE % =6 "+$!9 "+(!7
种子厚
R@.=V0D//A>/DDE
%
=6 "+"*9 "+!*7
种子重
[D.
:
@XA>/DDE
%
:
"+"!9 "+#!7
种行系数
_AD>>.=.D0XA>>IC.X>AI6 #+!*7 #+%&7
!!
注$表中不同字母表示两个物种之间具有显著性差异" :$
"+"$# MAXD$
L.>>DID0X8DXXDI/.0E.=7XDE/.
:
0.>.=70XE.>>DID0=D/9DXBDD0XBA/
b
D=.D/
"
:
$"+"$
#
+
表
@
!
?
个物种间遗传参数的比较
R798D%
!
H=A6
b
7I./A0A>
:
D0DX.=
b
7I76DXDI/9DXBDD0XBA/
b
D=.D/
遗传参数
TD0DX.=
b
7I76DXDI
金钱槭
!*+"(%(+"+
云南金钱槭
!*,
-
%&)()
样本量
Q76
b
8D/.?D #"( !#
多态位点数量
MA+A>
b
A8
K
6AI
b
@.=8A=. !(# !$% 物种水平 Q b D=.D/8DGD8 多态位点比率 ::; % h (&+,% ,(+"4 MD. ) / 基因多样性指数 < "+%%!# "+%"*, Q@700A0 多样性指数 5 "+*(,* "+**$"
居群水平
PA
b
C87X.A08DGD8
多态位点比率
::;
%
h $,+!4$!+#&
MD.
)
/
基因多样性指数
< "+!%*% "+!"**
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基因库中金钱槭和云南金钱槭的序列分析
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