全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
#"""($"!)
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#"+&*"*
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,
+-../+#"""($"!)+!"#$+"!+"!%&
收稿日期$
!"#%(##(")
&修改稿收到日期$
!"#$("#(#"
基金项目$国家自然科学基金"
%#"&#&0&
!
%#!&!#$1
#&福建省亚热带果树及特种经济作物种质资源共享平台"
!""02!""#
#
作者简介$赖呈纯"
#1&)
#!男!博士!副研究员!主要从事植物生物技术方面的研究
3(45-6
$
677-.65/8
!
#*%+794
"
通信作者$赖钟雄!博士!研究员!主要从事园艺植物生物技术与遗传资源方面的研究
3(45-6
$
65-:;"#
!
#*%+794
龙眼体胚发生相关未知蛋白
$%&()
基因的克隆与表达分析
赖呈纯#!!赖钟雄#"!林玉玲#
"
#
福建农林大学 园艺植物生物工程研究所!福州
%)"""!
&
!
福建省农业科学院 农业工程技术研究所!福州
%)"""%
#
摘
!
要$在龙眼体胚发生早期的蛋白质组学研究中!发现
#
个体胚发生相关未知蛋白
<6=>(%
!通过简并引物结合
?@A3
技术进行其基因全长序列克隆结果显示$"
#
#克隆到的龙眼体胚发生相关未知蛋白基因
!"#$(%
的全长
7<2@
序列为
#*0#B
C
!开放阅读框由
#"#&
个核苷酸组成!编码
%%0
个氨基酸"
DE/F5/G
登录号为
DH#*&!"!
#
"
!
#生物信息学分析发现!该基因推导蛋白分子量为
%*0)$+!<5
!
C
I
为
1+")
&该蛋白为
?5.
蛋白质家族成员!具有
@J>
%
DJ>(B-/8-/
K
.-LE49L-M@
"
>(699
C
#结合位点和
#
个典型的
?5.
(
6-GE
(
DJ>5.E.N
C
EOM54-6
P
组件!无典型信号肽
结构!但有跨膜螺旋的亲水性蛋白&不规则卷曲是其最大量的结构元件!散布于整个蛋白质中"
%
#实时荧光定量
>A?
分析显示!该基因在龙眼体胚发生过程中均有表达!其中以胚性愈伤组织阶段表达量最低!而球形胚阶段最
高研究表明!
!"#$(%
基因在龙眼体胚发生过程尤其是球形胚阶段有重要的作用!为进一步研究该基因在龙眼体
胚发生过程中的功能奠定了基础
关键词$龙眼&体胚发生&未知蛋白
<6=>(%
&基因克隆&定量表达
中图分类号$
H&01
文献标志码$
@
*%"+#+
,
-+!./
0
1233#"+4+-%
5
3#3"6&+7+"8+1"92#+$%&():2+2
;2%-92!9"<"=-9#>.=?1
5
"
,
2+23#3#+1-2&"$(
3
45*&/
6
$/@"A1B
Q@IARE/
K
7RN/
#
!
!
Q@ISR9/
K
;-9/
K
#
"
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QI2TN6-/
K
#
"
#I/.L-LNLE9MU9OL-7N6LNO56F-9LE7R/969
KP
!
VN
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-5/@
K
O-7N6LNOE5/8V9OE.LO
P
=/-WEO.-L
P
!
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!
AR-/5
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!I/.L-LNLE9M@
K
(
O-7N6LNO563/
K
-/EEO-/
K
5/8JE7R/969
KP
!
VN
,
-5/@758E4
P
9M@
K
O-7N6LNO56X7-E/7E.
!
VN:R9N%)"""%
!
AR-/5
#
4?391->9
$
@/N/G/9Y/
C
O9LE-/
K
E/EOE65LE8L9.945L-7E4BO
P
9
K
E/E.-.R58BEE/8-.79WEOE85/8/54E8!%&
()*+
,
-."(/
0
*/N/G/9Y/
C
O9LE-/
K
E/E%
"
!"#$(%
#
8NO-/
K
LRE
C
O9LE94-75/56
P
.-.9ME5O6
P
.945L-7E4BO
P
(
9
K
E/E.-.-/69/
K
5/+ILY5.769/E8B
P
N.-/
K
8E
K
E/EO5LE96-
K
9/N76E9L-8E
C
O-4EO.L9
K
ELREOY-LR?@A3+JRE
MN6(6E/
K
LR7<2@.E
Z
NE/7E9M!"#$(%
K
E/EY5.#*0#B
C
+IL79/L5-/.5#"#&(/N76E9L-8E.(69/
K
9
C
E/OE58-/
K
MO54E
"
[?V
#
YR-7RE/798E85
C
O9LE-/9M%%054-/957-8OE.-8NE.
"
DE/F5/G29+DH#*&!"!
#
+F-9-/M9O45L(
-7.5/56
P
.-..R9YE8LR5LLRE496E7N65OYE-
K
RL9M<6=>(%
C
O9LE-/-.%*0)$+!<5Y-LR
C
I1+")
!
-L-.54E4(
BEO9MLRE?5.
C
O9LE-/.N
C
EOM54-6
P
!
YR-7RR5.@J>
%
DJ>(B-/8-/
K
.-LE49L-M@
"
>(699
C
#
B-/8-/
K
.-LE
!
?5.
(
6-GE
(
DJ>5.E.N
C
EOM54-6
P
498N6E
!
R
P
8O9
C
R-6-77R5O57LEO-.L-7.5/8LO5/.4E4BO5/E
C
O9
C
EOL-E.BNL/9.-
K
/56
C
E
C
L-8E+?5/89479-6.5OELRE49.L45;-4N4.LON7LNO56E6E4E/L.5/8YEOEM9N/8.
C
OE58-/
K
-/LREYR96E
C
96
PC
E
C
L-8E7R5-/+JREE;
C
OE..-9/9M!"#$(%
K
E/EY5.56.9-/WE.L-
K
5LE88NO-/
K
69/
K
5/.945L-7E4BO
P
9
K
E/(
E.-.5779O8-/
K
L9LREOE.N6L.9MOE56(L-4E
Z
N5/L-L5L-WE>A?+IL.E;
C
OE..-9/Y5.LRE69YE.L5LLRELREMO-5B6E(
E4BO
P
9
K
E/-7756N..L5
K
E5/8LRER-
K
RE.L5L
K
69BN65OE4BO
P
9..L5
K
E+JREOER585/E6E4E/L5O
P
N/8EO.L5/8(
-/
K
L9LRE-4
C
9OL5/LMN/7L-9/9M!"#$(%
K
E/E8NO-/
K
69/
K
5/.945L-7E4BO
P
9
K
E/E.-.
!
E.
C
E7-56
P
5L
K
69BN65O
E4BO
P
9..L5
K
E+JR-.OE.N6L65-85M9N/85L-9/M9OLREMNOLREO.LN8
P
9/LREMN/7L-9/9M!"#$(%
K
E/E8NO-/
K
69/
K
5/.945L-7E4BO
P
9
K
E/E.-.+
C2
5
8"1!3
$
!%()*+
,
-."(/
0
*/
&
.945L-7E4BO
P
9
K
E/E.-.
&
N/G/9Y/
C
O9LE-/<6=>(%
&
K
E/E769/E
&
Z
N5/L-L5L-WE
E;
C
OE..-9/
!!
植物体胚发生是体细胞向胚胎途径转变的复杂
形态建成的过程!受细胞内外诸多因素的共同影响!
这必然引起植物细胞内代谢与基因表达模式发生巨
大的变化因此!对植物体胚发生过程中差异表达
基因进行研究!分离胚胎发育特异表达的基因!无论
是在理论上还是在生产上都具有重大的意义)#($*
有关植物体胚发生早期的研究主要是对体胚发生过
程基因差异表达的研究!随着分子生物学研究技术
的不断进步!人们对植物体胚相关基因表达的研究
越来越集中到特异基因的分离克隆及其在体胚发生
过程中的特异表达)$*这些基因在植物体胚复杂的
形态建成过程中各自在不同的阶段扮演不同的作
用!在体胚发生的信号通路上参与活化或抑制的特
殊功能自从建立龙眼胚性愈伤组织细胞系并获得
高频率体胚发生再生植株开始)(0*!
#"
多年来对龙
眼体胚发生的生理生化+体胚相关基因克隆+体胚发
生过程的蛋白质组学等进行了一系列研究)1*
在龙眼体胚发生早期的蛋白质组学研究中!获
得了大量差异表达的蛋白!其中蛋白点
"1%
在
!<
图谱上显示的分子量
%#&)0<5
+
C
I
为
*+01
!其表达
量变化是在龙眼松散型胚性愈伤组织阶段表达量极
低!胚性愈伤
"
阶段迅速升高!不完全胚性紧实结构
阶段又急剧下降!到胚性紧实球形结构阶段表达量
又大幅升高!到球形胚阶段达到最高)#"*这种变化
表明其在龙眼体胚发生早期可能参与重要的生理过
程通过质谱分析发现!其质谱图质量很高!但却没
有得到可靠的匹配为了进一步研究该未知蛋白在
龙眼体胚发生过程中的功能!本实验根据串联质谱
所得的肽段序列!尝试通过简并引物的方法来克隆
该蛋白基因!并进行龙眼体胚发生过程该基因的定
量表达分析!以便了解该基因在龙眼体胚发生过程
中的功能!同时该研究结果对于植物体胚发生相关
未知蛋白基因的分离提供了一条新的途径
#
!
材料和方法
D+D
!
材
!
料
以长期继代保持且遗传稳定的,红核子-龙眼胚
性愈伤组织"
QA!
细胞系#作为试验材料)*按龙眼
体胚发生同步化调控的方法)##*!获得龙眼体胚
0
个
不同阶段的胚性培养物!即松散型胚性愈伤组织+胚
性愈伤
"
+不完全胚性紧实结构+胚性紧实球形结
构+球形胚+心形胚+鱼雷形胚和子叶形胚!将其作为
龙眼基因荧光定量分析的试验材料
D+E
!
方
!
法
DBEBD
!
总
;F4
提取与
>$F4
合成
!
按
I/W-LO9
K
E/
公司的
JO-:96
试剂盒说明书操作!取龙眼体胚发生
各阶段的胚性培养物
"+!
K
提取总
?2@
!并按
VEO(
4E/L5.
公司
?EWEOL@-8
JV-O.L(XLO5/8X
P
/LRE.-.
X
P
.LE4
的试剂盒说明书操作合成龙眼胚性愈伤
"
阶段的保守区
7<2@
第一链并根据不同的试验
目的!合成不同的
7<2@

DBEBE
!
全长
>$F4
序列克隆
!
从串联质谱结果选
取一组分值较高的肽段 "
V\IQ>3]UDIH?
和
QX3VQD2@@ID@QUQ#设计
!
组简并引
物!即第一组上游引物
X=#
和下游引物
@<#
!第二
组上游引物
X=!
和下游引物
@"表
#
#!进行保守
区序列
>A?
扩增采用
?@A3
法克隆龙眼体胚
!"#$(%
基因
%^
端和
)^
端序列据保守区序列设计
%^
端特异引物
X=%(#
和
X=%(!
!分别以通用引物
@=@>
"表
#
#进行二轮
>A?
扩增据
!"#$(%
基因
保守区和
%^
端拼接后的序列设计
)^
端特异引物
@<)(#
和
@<)(!
"表
#
#!分别与通用引物
@=@>
进
行二轮
>A?
扩增根据拼接得到的
!"#$(%
基因
全长!设计
#
对引物"
=>%[=
和
=>%[<
#用于完整
开放阅读框的扩增所得目的片段经回收+纯化后!
连接到
C
\<#0(J
"
J5]5?5
#载体上!热激转化大肠
杆菌
#
重组质粒经
>A?
鉴定后!送上海英俊
生物技术有限公司进行测序
D+E+)
!
生物信息学分析
!
序列拼接与
[?V
比对
后进行蛋白质的保守区域预测用
3;>@X
P
服务
系统中的
>O9L>5O54
工具预测分析蛋白质基本理
化性质!利用
>OE8-7L>O9LE-/
进行蛋白功能位点分
析!
I/LEO>O9X75/
进行蛋白家族分析!
2AFI
的
A9/(
.EOWE8<945-/
进行结构域分析!
X-
K
/5I>%+"XEOWEO
信号肽分析!
JC
OE8
跨膜结构域分析!
>U<
对该
蛋白进行二级结构预测
D+E+G
!
龙眼体胚发育不同阶段的基因表达
!
参照
Q-/
等)#!*的方法进行实时荧光定量
>A?
操作!并以
其筛选的
123$
!
+
13&#
!
和
34!
基因为内参基因!检
测龙眼体胚发生不同阶段材料的目的基因
!"#$(%
0%!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
表
D
!
龙眼体胚相关未知蛋白基因
1*78()
克隆及实时荧光定量
*;
所用引物
J5B6E#
!
XE
Z
NE/7E.9M
C
O-4EO.N.E8-/!"#$(%
K
E/E769/E5/8OE56(L-4E>A?
引物名称
>O-4EO
引物序列
>O-4EO.E
Z
NE/7E
"
)^
#
%^
# 备注
?E45OG
X=#
@<#
JJA@JD@JAAJ2AA2D@D@@
"
@
%
D
#
A@
"
A
%
J
#
DD2@J
@J2DA2DADJJ2AA2@D
"
@
%
D
#
@@
"
A
%
J
#
JA
!"#$(%
基因片段的分离
I.965L-9/9M!"#$(%MO5
K
4E/L
X=!
@D@DJJAAJ2DD2@@
"
A
%
J
#
DA2DA2@J
@J2AA@JDAJJAJA2DD2@DD@JA@J
"
@
%
D
#
@@
!"#$(%
基因片段的分离
I.965L-9/9M!"#$(%MO5
K
4E/L
X=%(#
X=%(!
@AJJAAAJJDJJA@JAJD@JJDJA
AJADAAAJAAAA@@@A@@J
%^(?@A3
?5
C
-854
C
6-M-75L-9/9M7<2@%^(?@A3
@=@> DDAA@ADADJAD@AJ@DJ@AJ
通用引物
=/-WEO.56
C
O-4EO
@<)(#
@<)(!
DDAD@DA@DJDD@@D@@AA
D@@DJJJJAAAA@A@AAJD@
)^(?@A3
?5
C
-854
C
6-M-75L-9/9M7<2@)^(?@A3
=>%[=
=>%[<
@JDJJAJDD@D@D@DADDD@@@DDD@D@AJ
AJ@D@A@JJD@J@JAJD@DADAJJJD@AAD@D
[?V
引物
>O-4EOM9O[?V
=>%T=
=>%T<
@@@DDJJAJJAA@AJDAJADA
A@JDJAAJD@J@A@JAAA@@@D
实时荧光定量
>A?
引物
>O-4EOM9OOE56(L-4E?J(>A?
在转录水平上的相对表达量根据
!"#$(%
基因全
长开放框!设计
#
对引物
=>%T=
和
=>%T<
"表
#
#!用于实时荧光定量
>A?
扩增具体操作按赖呈
纯等)#%*步骤进行
!
!
结果与分析
EBD
!
1*78()
基因
>$F4
序列克隆
以龙眼胚性愈伤
"
阶段的保守区
7<2@
为模
板!第二组简并引物
>A?
扩增得到的保守区序列约
)""B
C
左右条带"图
#
!
@
#&在
%^(?@A3
反应中!以
龙眼胚性愈伤
"
阶段
%^
端
7<2@
为模板!
X=%(#
和
@=@>
为上下游引物进行第一轮
>A?
扩增!产物
稀释
#"
$ 倍后为第二轮
>A?
反应的模板!以
X=%(!
和
@=@>
为第二轮引物!
>A?
扩增获得约
#!""B
C
左右的条带!其它条带为杂带或单引物扩增"图
#
!
F
#&在
)^(?@A3
反应中!以龙眼胚性愈伤
"
阶段
)^
端
7<2@
为模板!
@=@>
和
@<)(#
为上下游引物
进行第一轮
>A?
扩增!产物稀释
#"
$ 倍后为第二轮
>A?
反应的模板!以
@=@>
和
@<)(!
为第二轮
>A?
扩增引物!扩增得到约
))"B
C
左右的条带"图
#
!
A
#!
%""B
C
左右的条带为单引物扩增&在开放框
扩增反应中!以龙眼胚性愈伤
"
阶段的保守区
7<(
2@
为模板!
=>%[=
和
=>%[<
为引物扩增得到约
#"""B
C
左右的条带"图
#
!
<
#图中其它条带经验
证后均为非特异扩增条带和引物二聚体
EBE
!
1*78()
基因测序结果与序列分析
对序列测序结果进行拼接!获得该基因
7<2@
的全长序列!为
#*0#B
C
!其最大开放框从第
%1#
个
碱基开始!到
#$"&
个碱基终止!共
#"#&
个碱基编
码
%%0
个氨基酸这与随后该基因
[?V
扩增测序
的结果一致将
!"#$(%
基因全长及其推导蛋白质
与
DE/F5/G
中的序列进行同源比较!发现其核苷酸
序列与拟南芥+克莱门柚+草莓+大豆+苜蓿+毛果杨+
蓖麻+马铃薯和葡萄等植物中的未知蛋白基因或推
定的
DJ>(B-/8-/
KC
O9LE-/
基因具有较高的一致
性!都在
&1_
以上!保守区同源性为
01+1$_
"图
!
#在氨基酸水平上!与毛果杨+蓖麻+葡萄+拟南芥
和克莱门柚等植物的氨基酸序列一致性在
0"_
$
0*_
其中在核酸和氨基酸水平上与蓖麻推定的
DJ>(B-/8-/
KC
O9LE-/
"
PC
LW%
#基因一致性最高!分别
图
#
!
龙眼体胚相关未知蛋白基因
!"#$(%
序列扩增结果
\+&
#+
目标片段&
@+
保守区片段&
F+%^(?@A3
&
A+)^(?@A3
&
<+[?V
序列
V-
K
+#
!
>A?
C
O98N7L.9M!"#$(%
K
E/EMO9469/
K
5/E4BO
P
9
K
E/-77N6LNOE.
\+&
#+J5O
K
ELMO5
K
4E/L
&
@+>A?
C
O98N7L9M79/.EOW5L-WEOE
K
-9/
&
F+%^(?@A3
&
A+)^(?@A3
&
<+[?V
1%!
!
期
!!!!!!!!!
赖呈纯!等$龙眼体胚发生相关未知蛋白
<6=>(%
基因的克隆与表达分析
为
0!_
和
0*_

以上的分析结果表明!龙眼体胚相关未知蛋白
基因
!"#$(%
全序列已经成功克隆虽然与蓖麻推
定的
DJ>(B-/8-/
KC
O9LE-/
一致性较高!但它们的
碱基覆盖率只有
*"_
!其它植物也大多为未知功能
蛋白由于该基因是在龙眼体胚中发现的第
%
个未
图
!
!
龙眼
!"#$(%
基因与其他物种同源基因保守区比较
<6=>(%
+
@LR
+
A76
+
VWE
+
D45
+
\LO
+
>LO
+
?79
+
XLN
+
W`-
分别为龙眼"
!"#$(%
#+拟南芥"
?5.(OE65LE8
.456DJ>(B-/8-/
K
M54-6
PC
O9LE-/
K
E/E
#+柑橘+草莓+大豆+苜蓿+毛果杨+蓖麻+马铃薯+葡萄的同源基因保守区
V-
K
+!
!
@6-
K
/4E/L9M69/
K
5/!"#$(%
K
E/E5/89LREOR94969
K
9N.
K
E/E.
<6=>(%
!
@LR
!
A76
!
VWE
!
D45
!
\LO
!
>LO
!
?79
!
XLN
!
W`-.L5/8M9OLRE.E
Z
NE/7E.9M!"#$(%R94969
K
9N.
K
E/EMO94
!%()*+
,
-."(/
0
*/
!
5+*6%7(
,
.%.89*"%*/*
!
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!
3+*
0
*+%*<;.)*
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0
(8+-/)*8-"*
!
$(
,
-"-.8+%)9()*+
,
*
!
A%)%/-.)(-/%.
!
4("*/-8-6;+(.-
!
B%8%.<%/%
C
;+*
图
%
!
2AFI
龙眼体胚相关未知蛋白
<6=>(%
蛋白氨基酸序列的保守结构域检索
V-
K
+%
!
XE5O7RM9O79/.EOWE88945-/9M<6=>(%
C
O9LE-/54-/957-8.E
Z
NE/7E9M69/
K
5/.945L-7E4BO
P
9.B
P
2AFI
"$!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
知功能蛋白的基因!将其命名为
!%()*+
,
-."(/&
0
*/N/G/9Y/
C
O9LE-/
K
E/E%
"
!"#$(%
#!
DE/F5/G
登录号为
DH#*&!"!

EB)
!
$%&()
蛋白特性!功能位点和结构域分析
根据
<2@\@2*+"
软件和
3;>@X
P
系统中的
>O9L>5O54
工具对龙眼体胚
<6=>(%
蛋白序列的基
本理化性质进行综合预测分析结果表明!龙眼体
胚
<6=>(%
蛋白分子量为
%*0)$+!<5
!理论等电点
C
I1+")
&原子组成
A
#*!1
U
!))#
2
$)1
[
)"0
X
)
!总原子数为
)#)!
&总平均疏水性为
"+)%%
!为亲水蛋白&该蛋
白由
!"
种氨基酸组成!其中以丝氨酸+甘氨酸+脯氨
酸等含量较为丰富!比例分别为
#%+1_
+
0+1_
+
0+"_
!半胱氨酸含量最少"仅
!
个#!占
"+*_

>OE8-7L>O9LE-/
在线软件分析结果表明!
<6=>(%
蛋白存在
!
个糖基化位点
2VX<
和
2TXQ
!
#
个粘多
糖附着位点
XD` D
!
&
个蛋白激酶
A
磷酸化位点!
J@?
+
XI]
+
X3?
+
XH?
+
XH?
+
J@?
和
X]?
!
)
个酪蛋白
激酶
II
磷酸化位点!
X3?<
+
XDU3
+
XJX3
+
X<3<
和
X` >3
!
0
个 酰 基 化 位 点!
DD>>XD
+
D` D]JX
+
DXXJ@?
+
DAJ` D`
+
D2XDXX
+
DJ?DXX
+
DQQXJX
和
DXDD@I
!
#
个
@J>
%
DJ>
结合位点基序
@
)
@J>
%
DJ>(B-/8-/
K
.-LE49L-M@
"
>(699
C
#*
D!
#
个
X-
K
45()$-/LEO57L-9/8945-/@J>(B-/8-/
K
OE
K
-9/@
.-
K
/5LNOE
位点
Q`` D`可以看出!龙
眼体胚
<6=>(%
蛋白可能是
DJ>(B-/8-/
KC
O9LE-/
"
D
蛋白#!但这种推测有待进一步实验来验证
I/LEO>O9X75/
数据库检索发现!该蛋白是
?5.
蛋白家族成员
2AFI
在线分析结果"图
%
#表明!
<6=>(%
蛋 白 有 一 个 典 型 的
?5.
(
6-GE
(
DJ>5.E
.N
C
EOM54-6
P
组件!包含了
DJ>5.E
特有的保守基序
D#B9;
$
D)B9;
!这是所有
DJ>5.E
结合和水解必
需的结构域可进一步推断
<6=>(%
蛋白可能是
DJ>(B-/8-/
KC
O9LE-/

X\@?J
分析结果表明!龙
图
$
!
X\@?J
龙眼体胚相关未知蛋白
<6=>(%
蛋白氨基酸序列的保守结构域检索
V-
K
+$
!
XE5O7RM9O79/.EOWE88945-/9M<6=>(%
C
O9LE-/54-/957-8.E
Z
NE/7E9M69/
K
5/
.945L-7E4BO
P
9.B
P
X\@?J
图
)
!
龙眼体胚发生不同阶段
!"#$(%
基因的转录水平
#+
松散型胚性愈伤组织&
!+
胚性愈伤
"
&
%+
不完全胚性紧实结构&
$+
胚性紧实球形结构&
)+
球形胚&
*+
心形胚&
+
鱼雷形胚&
0+
子叶形胚
V-
K
+)
!
JO5/.7O-
C
L-9/6EWE6.9M!"#$(%
K
E/E-/
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K
E.9M69/
K
5/.945L-7E4BO
P
9
K
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#+JREMO-5B6E(E4BO
P
9
K
E/-7756N.
&
!+34BO
P
9
K
E/-7756N.
"
&
%+I/794
C
6ELE794
C
57L
C
O9(E4BO
P
9
K
E/-77N6LNOE.
&
$+A94
C
57L
C
O9(E4BO
P
9
K
E/-77N6LNOE.
K
69BN65OE4BO
P
9.
&
)+D69BN65O
E4BO
P
9.
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*+UE5OLE4BO
P
9.
&
+J9
C
E89E4BO
P
9.
&
0+A9L
P
6E89/5O
P
E4BO
P
9.
眼体胚
<6=>(%
蛋白属于小
D
蛋白类"图
$
#
X-
K
/5I>%+"XEOWEO
分析表明!
<6=>(%
蛋白没
有明显的信号肽
JC
OE8
跨膜结构在线分析!
<6=>(%
蛋白存在跨膜结构域!属跨膜蛋白!可能是
一种质体蛋白
>U<
对该蛋白的二级结构预测结
果表明!
<6=>(%
蛋白由
#1+!%_
的
#
螺旋+
#%+1#_
的延伸链和
**+0*_
的不规则卷曲组成!纵观蛋白
的整体结构!不规则卷曲是该蛋白最大量的结构元
件!散布于整个蛋白质中
EBG
!
龙眼体胚不同发育阶段胚性培养物中
1*78()
基因的转录水平分析
用实时荧光定量
>A?
方法!对龙眼体胚不同发
育阶段胚性培养物中
!"#$(%
基因的
4?2@
转录
水平进行分析!结果"图
)
#显示!
!"#$(%
基因在松
散型胚性愈伤组织阶段的转录水平极低!到了胚性
愈伤
"
阶段维持在一个较低转录水平略有升高!到
球形胚阶段转录水平大幅上调方差分析表明!球
形胚阶段
!"#$(%
基因的转录水平与其它
&
个阶段
存在极显著差异"
$
$
"+"#
#!心形胚阶段急速下调!
之后到子叶胚阶段维持在一个较低的转录水平&这
种现象说明了
!"#$(%
基因可能是体胚发育过程中
阶段差异表达的基因!尤其是在球形胚阶段!该基因
转录水平异常升高!可能对球形胚的形成有特殊作
用对
<6=>(%
蛋白功能预测分析其为小
D
蛋白!
那说明这种小
D
蛋白在龙眼球形胚的形成过程中
扮演重要的角色或是决定性的因素!该蛋白的缺乏
有可能引起胚胎中途败育
#$!
!
期
!!!!!!!!!
赖呈纯!等$龙眼体胚发生相关未知蛋白
<6=>(%
基因的克隆与表达分析
%!
讨
!
论
)BD
!
龙眼体胚
1*78()
基因的功能推测及其在体
胚发生早期的作用
对龙眼体胚
!"#$(%
基因的碱基序列和编码氨
基酸序列同源分析发现!其与蓖麻推定的
DJ>
结
合蛋白一致性比较高!在随后的一系列生物信息学
分析都显示其为
?5.
(
6-GE
(
DJ>5.E.N
C
EOM54-6
P
的
成员!其为
DJ>
结合蛋白的可能性最大!是一种小
D
蛋白!并且可能是质体类型
DJ>
结合蛋白"
D
蛋白#广泛存在于原核和真核生物中!一般可分为
!
种类型!一种是异源三聚体!主要是参与信号转导&
另一种是小
D
蛋白!主要是行使信号转导+蛋白的
合成+细胞骨架形成的调控等功能)#$(#**!对植物基因
表达的调控和细胞的生长有重要作用
?5.
蛋白位
于细胞膜内侧!它在传递细胞生长分化信号方面起
重要作用!它属于三磷酸鸟苷"
DJ>
#结合蛋白!通
过
DJ>
与二磷酸鸟苷"
D<>
#的相互转化来调节信
息的传递通过生物信息学分析推测从龙眼体胚克
隆到的
<6=>(%
蛋白为小
D
蛋白!根据不同的功能
小
D
蛋白可分成
)
个家族!即
?5.
+
?R9
+
?5B
+
@OM
和
?5/
对拟南芥的研究表明!植物中存在
?5B
+
@OM
+
?5/
和
?R9
!但尚未找到与动物
?5.
有较高同
源性的小
D
蛋白)#&*在龙眼体胚发生早期!我们分
离得到的
<6=>(%
蛋白!经生物信息学功能分析发
现!其可能是
?5.
家族的成员!该小
D
蛋白可能参
与调节与体胚发生相关基因的开启和关闭!对龙眼
体胚早期的形态建成起到重要的调控作用但这种
推测还有待进一步的试验来证明
)BE
!
龙眼体胚
1*78()
基因与龙眼体胚发生关系
基于龙眼胚性培养物
!"#$(%
基因在松散胚性
愈伤组织阶段转录水平极低!而在球形胚阶段异常
高的事实!推测龙眼胚性培养物
!"#$(%
基因是体
胚特异表达的基因!并且是在体胚发生早期阶段特
异表达的!尤其是在球形胚阶段!它在龙眼球形胚的
形成过程中扮演重要的角色或是决定性的因素!如
果是预测的小
D
蛋白!它可能在球形胚形成时行使
信号转导+蛋白的合成+细胞骨架形成等的调控功
能如果该蛋白的缺乏!有可能引起胚胎中途败育
该蛋白有可能作为单因素来调控龙眼胚胎中途败
育!在生产上有很好的应用前景但这种推测还需
要实验来验证
参考文献"
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