全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４３(３): ２４９￣２５７(２０１３)
收稿日期: ２０１２￣０９￣１０ꎻ 修回日期: ２０１３￣０３￣１０
基金项目: 公益性行业(农业)科研专项(２０１００３０６６)资助
通讯作者: 罗来鑫ꎬ博士ꎬ主要从事种子病理学和种传细菌病害研究ꎻ Ｔｅｌ:０１０￣６２７３２９９４ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｌｕｏｌａｉｘｉｎ＠ｃａｕ. ｅｄｕ. ｃｎ
第一作者: 蒋 娜ꎬ女ꎬ山东东营人ꎬ博士研究生ꎬ 主要从事种传细菌病害研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｊｎ２００９＠１３９. ｃｏｍꎮ
专题评述
植物病原细菌的 ＶＢＮＣ状态研究进展
蒋 娜ꎬ 李健强ꎬ 罗来鑫∗
(中国农业大学植物病理学系ꎬ种苗健康北京市工程研究中心ꎬ种子病害检验与防控北京市重点实验室ꎬ 北京 １００１９３)
摘要:有活力但不可培养状态(Ｖｉａｂｌｅ Ｂｕｔ Ｎｏｎ￣ＣｕｌｔｕｒａｂｌｅꎬＶＢＮＣ)被认为是细菌对不良环境条件的一种抗逆反应ꎬ包括 ５ 种
植物病原细菌在内的数十种细菌已报道具有 ＶＢＮＣ状态ꎮ 这种特定的生理状态已经导致细菌学研究中一些方法的探索和
改进ꎬ对基于分离培养的植物病原细菌学研究产生了重大影响ꎮ 本文对已经报道 ＶＢＮＣ状态的植物病原细菌进行了综述ꎬ
介绍了 ＶＢＮＣ状态细菌的诱导因素、恢复条件、致病性、检测方法等方面的研究进展ꎬ对未来植物病原细菌的 ＶＢＮＣ 研究
提出了展望ꎮ
关键词:ＶＢＮＣꎻ植物病原细菌ꎻ诱导ꎻ检测ꎻ恢复ꎻ致病性
Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｔｈｅ ＶＢＮＣ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ＪＩＡＮＧ Ｎａꎬ ＬＩ
Ｊｉａｎ￣ｑｉａｎｇꎬ ＬＵＯ Ｌａｉ￣ｘｉｎ (Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎻ Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｅｅｄ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｈｅａｌｔｈꎻ Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｅｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９３ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ｖｉａｂｌｅ ｂｕｔ ｎｏｎ￣ｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ (ＶＢＮＣ) ｓｔａｔｅ ｉｓ ａ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｈａｒｓｈ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ. Ｔｈｅ ＶＢＮＣ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｆｉｖｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｒｅｐｏｒｔｅｄ. Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈｙｓｉｏ￣
ｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｈａｓ ｌｅａｄｅｄ ｔｏ ｓｏｍｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｗｉｌｌ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｔｈｅ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ
ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ. Ｔｈｉｓ ｒｅｖｉｅｗ ｄｅｓｃｒｉｂｅｓ ｔｈｅ ＶＢＮＣ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａꎬ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ
ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓꎬ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓꎬ ｔｈｅ ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＶＢＮＣ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｉｔｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ. Ｓｏｍｅ
ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＶＢＮＣ ｓｔａｔｅ ａｒｅ ｐｒｏｖｉｄｅｄ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ＶＢＮＣꎻ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａꎻ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎꎻ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎꎻ ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎꎻ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ
中图分类号: Ｓ４３２. ４２ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１３)０３￣０２４９￣０９
１ 植物病原细菌的 ＶＢＮＣ状态概述
１. １ ＶＢＮＣ状态
１９８２ 年 Ｘｕ 等[１]通过对大肠杆菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ)和霍乱弧菌(Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ)存活规律的研
究ꎬ首次发现并提出了细菌的“有活力但不可培
养”(Ｖｉａｂｌｅ Ｂｕｔ Ｎｏｎ￣ＣｕｌｔｕｒａｂｌｅꎬＶＢＮＣ)状态ꎬ即细
菌处于不良环境条件下ꎬ细胞会发生生理上和形态
上的变化ꎬ用常规培养方法不能使其分裂生长ꎬ但
是仍具有代谢活性ꎮ ＶＢＮＣ 状态被认为是多种革
兰氏阴性(Ｇ － )细菌和某些不形成芽孢的革兰氏
阳性(Ｇ ＋ )细菌的一种抗逆反应ꎬ也有学者认为
ＶＢＮＣ 状态是细菌生命循环中的一个环节 [２ ~ ４]ꎮ
近三十年内ꎬ在动物病原细菌、食品微生物和环境
微生物等领域ꎬＶＢＮＣ研究较多ꎬ已有 ５０ 余种病原
细菌报道了 ＶＢＮＣ 状态(表 １) [５]ꎬ包括与某些植
物病原细菌分类地位非常近的 Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａ￣
ｃｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ 和 Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ 等ꎬ但
在植物病原细菌方面ꎬ研究时间较短ꎬ且集中在
Ｇ －细菌上ꎬ范围相对更窄(表 ２)ꎮ
植物病理学报 ４３ 卷
Ｔａｂｌｅ １ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｋｎｏｗｎ ｔｏ ｅｎｔｅｒ ｔｈｅ ＶＢＮＣ ｓｔａｔｅ[５]
Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ
Ａ. ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｋ. ｐｎｅｕｍｏｎｉａ Ｓ. ｆｌｅｘｎｅｒｉ
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ Ｋ. ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ Ｓ. ｓｏｎｎｅｉ
Ｂ. ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ
Ｃ. ｊｅｊｕｎｉ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｖ. ａｎｇｕｉｌａｒｕｍ
Ｃ. ｌａｒｉ Ｍ. ｓｍｅｇｍａｔｉｓ Ｖ. ｃａｍｐｂｅｌｌｉｉ
Ｃｙｔｏｐｈａｇａ ａｌｌｅｒｇｉｎａｅ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｐｉｓｃｉｃｉｄａ Ｖ. ｃｈｏｌｅｒａ
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ Ｖ. ｈａｒｖｅｙｉ
Ｅ. ｃｌｏａｃａｅ Ｐ. ｓｙｒｉｎｇａｅ Ｖ. ｍｉｍｉｃｕｓ
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ Ｖ. ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ
Ｅ. ｈｉｒａｅ Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ Ｖ. ｓｈｉｌｏｉ
Ｅ. ｆａｅｃｉｕｍ Ｒ. ｍｅｌｉｌｏｔｉ Ｖ. ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ ( ｔｙｐｅ １ ＆２)
Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ( ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＥＨＥＣ) Ｓ. ｔｙｐｈｉ Ｘ. ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ. ｃｉｔｒｉ
Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ Ｓ. ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ
１. ２ 已报道 ＶＢＮＣ状态的植物病原细菌
迄今为止ꎬ报道 ＶＢＮＣ 状态的植物病原细菌
均为 Ｇ － 细菌ꎬ包括引起多种植物根癌病的
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ[６]ꎬ引起十字花科蔬菜黑
腐病的 Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ
(Ｘｃｃ) [７]ꎬ引起茄科作物青枯病的 Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏ￣
ｌａｎａｃｅａｒｕｍ[８ ~ １１]ꎬ引起梨火疫病的 Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏ￣
ｖｏｒａ[２ꎬ ３ꎬ １２ꎬ １３]ꎬ和引起柑橘溃疡病的 Ｘ. ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ
ｐｖ. ｃｉｔｒｉ(Ｘａｃ) [１４]ꎬ研究环境有不同形式的液体培
养基、土壤环境和寄主植株体等(表 ２)ꎮ
１. ３ ＶＢＮＣ细菌的形态变化
一般认为ꎬＶＢＮＣ状态的细菌比正常生理状态
的细菌个体小ꎮ 例如:处于对数生长期的 Ｖ.
ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ长度为 ２ μｍꎬ但是进入 ＶＢＮＣ 状态后ꎬ
Ｖ. ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ变为直径仅有 ０. ６ μｍ的球状[５]ꎮ 目
前已报道 ＶＢＮＣ 状态的植物病原细菌均为杆状
菌ꎬ在 ＶＢＮＣ状态下形态也会发生变化ꎮ Ｏｒｄａｘ 使
用浓度为 ０. ０５ ｍＭ的 Ｃｕ２ ＋诱导 Ｅ. ａｍｙｌｏｖｏｒａꎬ７ ｄ
后得到 ＶＢＮＣ 状态的细菌ꎬ通过扫描电镜观察ꎬ
ＶＢＮＣ状态的细菌菌体较正常生理状态的菌体有
轻微的伸长ꎬ细胞外层部分增厚[２]ꎬ该结果与 Ｖ.
ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ等动物病原细菌的报道有所出入ꎮ 由于
缺乏更多的相关研究ꎬ对 Ｅ. ａｍｙｌｏｖｏｒａ 的研究结
果是否能代表更多植物病原细菌 ＶＢＮＣ 状态的形
态变化仍有待于进一步验证ꎮ
２ ＶＢＮＣ状态的诱导
温度、光照、紫外线、渗透压、ｐＨ值、氧气、寡营
养等因素都可以诱导细菌进入 ＶＢＮＣ 状态[１５]ꎻ在
植物病原细菌的研究中ꎬ诱导因素多集中在寡营
养、低温、低氧、重金属(Ｃｕ２ ＋ )等物理和化学因素ꎬ
其中寡营养状态和铜离子是目前研究最多的ꎮ
２. １ 物理因素
报道中ꎬ用于诱导植物病原细菌 ＶＢＮＣ 状态
的物理因素主要为寡营养条件ꎮ 使用 ０. ９％ 的
ＮａＣｌ溶液培养 Ｒ. ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ２ 个月后ꎬ大约有
２０％的细菌进入了 ＶＢＮＣ 状态[８]ꎮ 此外ꎬＸｃｃ 在
ＡＢ盐溶液(１ ｇ / Ｌ ＮＨ４Ｃｌꎬ０. ３ ｇ / Ｌ ＭｇＳＯ４ꎬ０. １５
ｇ / Ｌ ＫＣｌꎬ０. ０１ ｇ / Ｌ ＣａＣｌ２ꎬ２. ５ ｍｇ / Ｌ ＦｅＳＯ４)中培
养 ３９ ｄ 后 ７５％的细菌都进入了 ＶＢＮＣ 状态[７]ꎮ
这表明ꎬ在缺乏营养的条件下ꎬ细菌进入 ＶＢＮＣ 状
态来抵抗不良环境条件ꎮ
０５２
３ 期 蒋 娜ꎬ等:植物病原细菌的 ＶＢＮＣ状态研究进展 １５２
植物病理学报 ４３ 卷
２. ２ 化学因素
重金属对细菌的生存影响很大ꎬ在植物病原细
菌 ＶＢＮＣ状态研究中ꎬ最常用的是不同浓度的 Ｃｕ￣
ＳＯ４ 进行诱导ꎮ 在 Ｘｃｃ 的相关研究中ꎬ通过在 ＡＢ
盐溶液中添加 ＣｕＳＯ４ 使其浓度分别为 ０. ００５、
０ ０５０ 和 ０. ５００ ｍｍｏｌ / Ｌꎬ在灭菌土中添加浓度为
１０ ｍｇ / ｋｇ和 ５００ ｍｇ / ｋｇ 的 ＣｕＳＯ４ꎬ均成功诱导出
了 ＶＢＮＣ状态的细菌[７]ꎮ 在 Ａ. ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ[６]、Ｒ.
ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ[８]、Ｅ. ａｍｙｌｏｖｏｒａ[２ꎬ １２ꎬ １３]和 Ｘａｃ[１４]的
研究中ꎬ也均是在不同基质中添加了低浓度的 Ｃｕ￣
ＳＯ４ 进行诱导ꎬ分别得到了上述几种植物病原细菌
的 ＶＢＮＣ状态ꎮ
３ ＶＢＮＣ状态的检测
植物病原细菌 ＶＢＮＣ状态的检测方法多是从
环境微生物中借鉴过来的ꎬ通过分别测定可培养细
菌(ｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ)和活菌(ｖｉａｂｌｅ)的数量ꎬ间接计算得
到 ＶＢＮＣ状态细菌的数量ꎮ 可培养细菌检测一般
是在适宜的固体培养基上(如 ＬＢ等)涂板计数ꎬ方
法较简单ꎬ无需赘述ꎻ活菌的检测相对繁琐ꎬ多为基
于光学的染色方法和基于分子生物学的 ＰＣＲ 方
法ꎮ
３. １ 基于光学的检测方法
基于光学的检测方法是最经典的 ＶＢＮＣ 检测
方法ꎬ从 １９８２ 年 Ｘｕ 等[１]第一次报道 ＶＢＮＣ 状态
开始ꎬ该方法仍是报道一种新菌 ＶＢＮＣ 状态时的
首选方法ꎮ
３. １. １ 基于细胞生长和吖啶橙染色的直接计数
方法 １９７９ 年ꎬＫｏｇｕｒｅ等[１６]首次使用了活菌直接
计数法 (Ｄｉｒｅｃｔ Ｖｉａｂｌｅ ＣｏｕｎｔꎬＤＶＣ)ꎮ 此后ꎬＧｒｅｙ
使用 ＤＶＣ法验证了细菌活力试剂盒检测方法的
准确性ꎮ 其方法是将 ０. １ ｍＬ 细菌加入到含
０ ０１％酵母浸粉和 ０. １％萘啶酮酸的 １ ｍＬ 培养基
中ꎬ２５℃过夜培养ꎻ用 ０. １ ｍＬ浓度为 ０. ５％的吖啶
橙染色 ３０ ｍｉｎ后ꎬ再通过 ０. ２２ μｍ 孔径的黑色聚
碳酸酯膜收集菌体并通过荧光显微镜观察ꎮ 与缺
少酵母浸粉和吖啶橙的对照相比ꎬ增长的细菌被认
为是活细菌[８]ꎮ 在环境微生物的 ＶＢＮＣ 状态检测
中ꎬＤＶＣ法是目前最常用的检测方法ꎬ但该方法存
在一定的局限性ꎮ 绝大多数 Ｇ ＋细菌和少数 Ｇ －细
菌对萘啶酮酸具有抗性ꎬ比如番茄溃疡病菌
(Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ. ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓꎬ
Ｃｍｍ)ꎬ其菌体的 ＤＮＡ 复制不能完全被萘啶酮酸
所抑制ꎬ因此不能通过 ＤＶＣ 法进行检测和计数ꎮ
另外ꎬ培养基中残存的酵母提取物能与细菌固定液
结合产生沉淀ꎬ该沉淀可被吖啶橙染色ꎬ造成背景
色过高ꎬ不利于靶标菌的观察ꎮ
３. １. ２ 基于细胞呼吸作用的检测方法 ５￣氰基￣
２ꎬ３￣二(４￣甲基苯基)四唑氯化物(５￣ｃｙａｎｏ￣２ꎬ３￣ｄｉ￣
ｔｏｌｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅꎬＣＴＣ)是一种电子受体物
质ꎬ在细菌呼吸作用过程中ꎬ无色氧化态的 ＣＴＣ可
以被还原为红色[１７]ꎮ 在待测细菌溶液中添加低浓
度的 ＣＴＣꎬ室温条件下避光培养一段时间后ꎬ显微
镜下观测或是利用流式细胞仪检测具有红色荧光
的菌体ꎬ这些菌体被认为是活菌ꎮ 此法比 ＤＶＣ 法
的适用范围广ꎬ但目前还不清楚是否所有的细菌均
可降解 ＣＴＣ[１５]ꎮ 在 Ｅ. ａｍｙｌｏｖｏｒａ 的 ＶＢＮＣ 状态
研究中ꎬ使用 ＣＴＣ 法对病原菌的活菌数目进行了
检测和计算[２]ꎮ
３. １. ３ 基于细胞质膜结构完整性的检测方法(核
酸荧光染色) 在近几年关于 ＶＢＮＣ的报道中ꎬ多
数研究使用了 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ 公司的 ＬＩＶＥ /
ＤＥＡＤ ＢａｃＬｉｇｈｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔｓ(活 /死细菌
检测试剂盒)ꎮ 此试剂盒包含 ２ 种荧光染料￣碘化
丙啶(Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ＩｏｄｉｄｅꎬＰＩ)和 ＳＹＴＯ ９ꎮ ＳＹＴＯ ９
可以穿过完整的细胞膜ꎬ进入菌体内与核酸结合而
呈现绿色荧光ꎬ其激发光为 ４８０ ｎｍꎬ发射光为 ５００
ｎｍꎮ ＰＩ不能穿过完整的细胞膜ꎬ只能通过破损的
细胞膜进入菌体结合核酸而呈现红色荧光ꎬ其激发
光为 ４９０ ｎｍꎬ发射光为 ６３５ ｎｍꎮ 此试剂盒使用方
便ꎬ染色效果好ꎬ但是对于不同的细菌ꎬＰＩ 和 ＳＹＴＯ
９ 的比例需要做出适当的调整ꎮ
Ｏｒｄａｘ 等[２] 用活 /死细菌检测试剂盒将 Ｅ.
ａｍｙｌｏｖｏｒａ染色后用流式细胞仪(ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ
ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ ｂｅｎｃｈ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ)检测ꎬ发现有一部分
细菌呈现红色和绿色两种荧光ꎬ此部分被两种染料
染色的细菌是属于活细菌还是死细菌并不容易确
定ꎮ 笔者认为ꎬ虽然在细胞膜不完整的细菌中ꎬ红
色荧光会覆盖绿色荧光ꎬ但 ＰＩ 和 ＳＹＴＯ ９ 在竞争
结合位点的过程中ꎬ仍然会有少部分 ＳＹＴＯ ９ 与核
酸结合ꎬ而流式细胞仪的检测灵敏度非常高ꎬ故可
以检测到此部分绿色荧光ꎮ
ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｏｌｆ 等[１８]使用 ＰＩ 对 ８０℃加热处理
２５２
３ 期 蒋 娜ꎬ等:植物病原细菌的 ＶＢＮＣ状态研究进展
１５ ｍｉｎ的马铃薯环腐病菌(Ｃ. ｍ. ｓｕｂｓｐ. ｓｅｐｅｄｏｎｉ￣
ｃｕｓꎬＣｍｓ)的死细胞进行染色ꎬ以未加热的活细胞
为对照ꎬ通过紫外体视镜检测ꎬ发现此方法并不能
把死细胞和活细胞分开ꎮ 笔者以和 Ｃｍｓ 同种但不
同亚种的番茄溃疡病菌(Ｃｍｍ)为材料ꎬ使用该试
剂盒中的 ＰＩ 进行染色ꎬ通过共聚焦显微镜(Ｌｅｉｃａ
ＴＣＳ ＳＰ５)观察ꎬ发现死细菌呈现红色荧光ꎬ而活细
菌检测不到荧光ꎬ证明可以通过 ＰＩ 染色的方法把
Ｃｍｍ的死细胞和活细胞分开的ꎬ与之前 ｖａｎ ｄｅｒ
Ｗｏｌｆ对 Ｃｍｓ的研究结果存在一定出入ꎮ
以上 ３ 种染色方法中ꎬ第 １ 种和第 ２ 种染色方
法检测的是细菌的代谢活性ꎬ而第 ３ 种方法检测的
是细菌膜结构的完整性ꎮ 在实验过程中ꎬ可以将这
２ 种不同原理的检测方法结合使用ꎬ使结果更具说
服力ꎮ
３. ２ 基于分子生物学的检测方法
随着分子生物学技术的发展ꎬ利用分子手段检
测 ＶＢＮＣ状态的细菌已成为一种趋势ꎮ 目前ꎬ分
子检测方法在植物病原细菌中未见报道ꎬ但是在其
他微生物中已有应用ꎬ值得借鉴ꎮ
３. ２. １ 基于 ＤＮＡ 的检测方法 单叠氮乙啶
(Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｍｏｎｏａｚｉｄｅꎬＥＭＡ)和单叠氮丙啶( Ｐｒｏ￣
ｐｉｄｉｕｍ ｍｏｎｏａｚｉｄｅꎬＰＭＡ)是 ２ 种双链 ＤＮＡ 染料ꎬ
可通过破损的细胞膜进入胞内ꎬ与 ＤＮＡ 发生不可
逆的共价结合ꎬ阻止死细胞的 ＤＮＡ 被扩增ꎮ 近年
来ꎬＥＭＡ 和 ＰＭＡ 在有活力细胞的检测中被大量
应用ꎬ如 Ｌｕｏ 等[１９]将 ＥＭＡ 应用于 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ
中ꎬ可实现选择性定量检测样品中有活力的番茄溃
疡病菌ꎮ Ｎｏｃｋｅｒ 等[２０]对 ＰＭＡ 和 ＥＭＡ 进行了比
较ꎬ发现 ＥＭＡ也可以进入某些种类细菌的活细胞
中ꎬ活细胞通过外排泵将 ＥＭＡ 排出体外时ꎬ会存
在少量的残留ꎬ这些残留可能影响活细胞 ＤＮＡ 的
扩增ꎮ ＰＭＡ 比 ＥＭＡ 多一个正电荷ꎬ透膜性更差ꎬ
更不容易进入到活细胞内部ꎬ能够有效避免来自活
细胞中的 ＤＮＡ不被染料结合ꎮ
Ｓｌｉｍａｎｉ等[２１]用 ０. ４ μｍ的聚碳酸酯膜过滤热
处理和非热处理混合的 Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａꎬ将
６. ２５ μＭ的 ＰＭＡ溶液添加到滤膜上ꎬ经处理后再
提取 ＤＮＡꎬ可以很好地抑制死细胞 ＤＮＡ 的扩增ꎬ
该方法可用于 ＶＢＮＣ 状态 Ｌ. ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ 的计
数ꎮ
３. ２. ２ 基于 ＲＮＡ 的检测方法 由于细菌 ｍＲＮＡ
的半衰期一般只有 ３ ~ ５ ｍｉｎ[２２]ꎬ在不可培养的细
胞中ꎬ仍有 ｍＲＮＡ 的表达[２３]ꎬ所以 ｍＲＮＡ 也被当
作一种 ＶＢＮＣ 细菌的指示因子ꎬ基于 ｍＲＮＡ 水平
检测的 ＲＴ￣ＰＣＲ技术越来越多地被应用于有活力
细胞的检测中ꎮ 但是ꎬ该方法需在明确 ＶＢＮＣ 机
制或者某个靶标基因在 ＶＢＮＣ 状态的表达情况的
前提下ꎬ才可以实施ꎮ
Ｅ. ｃｏｌｉ作为重要的模式生物ꎬ在 ＶＢＮＣ 方面
的研究相对比较透彻ꎮ Ｌｉｕ 等[２４]应用 ＲＴ￣ＰＣＲ 结
合电子芯片的技术ꎬ以编码脂多糖的 ｒｆｂＥ 基因和
编码 Ｈ７ 鞭毛蛋白的 ｆｌｉＣ 基因为靶标ꎬ检测不同水
样中 ＶＢＮＣ状态的 Ｅ. ｃｏｌｉ Ｏ１５７:Ｈ７ꎮ 该方法的检
测限可达到梯度稀释的细菌培养物中 １ ＣＦＵ的 Ｅ.
ｃｏｌｉꎬ自来水中 ３ ~ ４ ＣＦＵ / Ｌ 的 Ｅ. ｃｏｌｉꎬ河水中 ７
ＣＦＵ / Ｌ的 Ｅ. ｃｏｌｉꎬ１ Ｌ河水中 ５０ 个 ＶＢＮＣ状态的
Ｅ. ｃｏｌｉ细胞ꎬ灵敏度极高ꎮ
植物病原细菌的 ＶＢＮＣ 机制尚不清楚ꎬ限制
了基于 ＲＮＡ检测方法的应用ꎮ
４ ＶＢＮＣ状态的恢复及其恢复后的致病性
４. １ ＶＢＮＣ状态的恢复
如果 ＶＢＮＣ是细菌的一种抗逆机制ꎬ那么有
必要证明处于 ＶＢＮＣ状态的细菌是可以恢复到正
常生长和存活状态的ꎮ 在进行 ＶＢＮＣ 状态的恢复
时ꎬ一般有如下 ３ 种策略:１ꎬ去除细菌所在环境条
件中的诱导物质ꎬ如在培养基中添加 ＥＤＴＡ 螯合
Ｃｕ２ ＋ ꎻ２ꎬ用营养充足的液体培养基或在培养基中
添加寄主植物的汁液等进行培养ꎬ促进 ＶＢＮＣ 状
态细菌部分基因的表达ꎻ３ꎬ直接接种寄主植物ꎬ在
寄主体内进行恢复ꎮ
Ｇｒｅｙ等[８]于 ２００１ 年首次报道了植物病原细
菌 ＶＢＮＣ状态的恢复ꎬ通过在土壤中接种 ＶＢＮＣ
状态的 Ｒ. ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍꎬ随后在靠近番茄根部的
位置检测到了恢复后的 Ｒ. ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍꎬ这说明
植物根系的某些分泌物质ꎬ可能对 ＶＢＮＣ 细菌的
恢复有促进作用ꎮ
Ｏｒｄａｘ等[２]的研究结果表明ꎬ由 Ｃｕ２ ＋诱导的
Ｅ. ａｍｙｌｏｖｏｒａ的恢复能力与添加剂结合 Ｃｕ２ ＋的能
力、细菌进入 ＶＢＮＣ的时间、Ｃｕ２ ＋的浓度有关ꎮ 比
较几种添加剂的恢复效果ꎬＫＢ 溶液、新鲜的未成
熟的梨汁效果最好ꎬＥＤＴＡ 和天冬酰胺效果次之ꎬ
３５２
植物病理学报 ４３ 卷
柠檬酸效果最差ꎮ
Ｓａｎｔａｎｄｅｒ等[３]利用 ０. ７ μｇ / ｍＬ 的氯气诱导
Ｅ. ａｍｙｌｏｖｏｒａ的 ＶＢＮＣ状态ꎬ之后用 ３ 种不同方法
对其进行恢复处理ꎮ 结果表明ꎬ氯气诱导 ３０ ｍｉｎ
的 Ｅ. ａｍｙｌｏｖｏｒａꎬ接种 ＫＢ 培养基、未成熟的梨和
梨树幼苗的方法都可将其恢复ꎻ但是氯气诱导 １ ｈ
或更长时间后ꎬ仅接种梨树幼苗的方法可将其恢
复ꎮ 由此看来ꎬ用活体植株进行恢复的效率是最高
的ꎮ
４. ２ ＶＢＮＣ细菌恢复后的致病性
对从 ＶＢＮＣ状态恢复后的 Ｅ. ａｍｙｌｏｖｏｒａ 菌体
进行致病性研究ꎬ结果表明ꎬ在健康的梨果实上接
种处于 ＶＢＮＣ 状态的 Ｅ. ａｍｙｌｏｖｏｒａꎬ仅有 ４０ ~
６０％的梨在接种的前五天显症ꎬ与对照相比ꎬ坏死
斑小且渗出物少ꎮ 然而ꎬ将从 ＶＢＮＣ 状态恢复后
的 Ｅ. ａｍｙｌｏｖｏｒａ 接种梨ꎬ发病情况与对照相似[２]ꎮ
上述结果表明ꎬ自然条件下ꎬ寄主中的营养物质可
促进细菌从 ＶＢＮＣ 状态恢复ꎬ且恢复后的细菌能
够重新获得与正常状态细菌相当的致病力ꎮ
笔者认为ꎬ当细菌处于 ＶＢＮＣ 状态时ꎬ体内的
新陈代谢水平非常低ꎬ与致病相关的基因基本处于
不表达或表达量极低的状态ꎬ不能引发病害或发病
比较轻ꎮ 当细菌恢复到可培养状态时ꎬ新陈代谢恢
复正常ꎬ基因表达也恢复到正常水平ꎬ因此致病力
也得到了恢复ꎮ
５ ＶＢＮＣ状态的机制
在目前关于植物病原细菌 ＶＢＮＣ 的研究报道
中ꎬ尚未涉及 ＶＢＮＣ 状态的机制ꎮ 而在环境微生
物方面ꎬ已有报道通过对 ＶＢＮＣ 状态、饥饿状态和
对数生长期的 Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ 蛋白表达图谱
进行分析ꎬ发现三者之间存在很大差异ꎮ 例如ꎬ与
对数生长期的细菌蛋白图谱相比ꎬＶＢＮＣ状态细菌
的果糖二磷酸醛缩酶(Ｆｒｕｃｔｏｓｅ￣ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｌｄｏｌａ￣
ｓｅ)表达量上调ꎬ且等电点降低ꎬ而饥饿状态细菌的
果糖二磷酸醛缩酶表达量下调ꎮ 果糖二磷酸醛缩
酶在代谢途径中发挥重要作用ꎬ在 ＶＢＮＣ 状态和
饥饿状态下ꎬ该酶的表达量不一致ꎬ表明 ＶＢＮＣ 和
饥饿是两种不同的机制[４]ꎮ 另有报道称卤化呋喃
等小分子物质在细菌进入 ＶＢＮＣ 状态的过程中起
到了信号传递的作用[２５]ꎮ
在 ＶＢＮＣ的诱导过程中ꎬ细菌的碳水化合物、
蛋白被降解ꎬ ＲＮＡ、 ＤＮＡ 含量下降[２３]ꎮ Ｒｏｚｅｎ
等[２６]利用 ＤＮＡ 微阵列方法分析了 ＶＢＮＣ 状态的
Ｅ. ｃｏｌｉ 的基因转录谱ꎬ发现有 ３２０ 个与细胞分裂
和核酸合成相关的基因表达量下调ꎬ９３７ 个与小分
子代谢、能量代谢、ＴＣＡ循环等相关的基因表达量
上调ꎮ
Ｃｈｉｕ等[２７]使用黄色荧光蛋白(ＹＦＰ)标记 Ｖ.
ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ 中细胞骨架蛋白 ＭｒｅＢꎬ发现
ＭｒｅＢ被降解为小片段ꎮ ＶＢＮＣ诱导 １２ ｈ 后ꎬ短杆
状的 Ｖ. ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ经过膨大过程ꎬ变为三种
形状的细胞:完全膨大的球形细胞ꎬ一端膨大的
“鸡腿状”细胞ꎬ中间膨大的“兔耳状”细胞ꎮ ３６ ｈ
后ꎬ所有细胞经过缩小过程ꎬ变为小球形ꎮ 这说明
细胞骨架蛋白 ＭｒｅＢ 与 ＶＢＮＣ 状态细菌的形态变
化密切相关ꎮ
培养基中存在大量的过氧化氢ꎬ会对细胞产生
毒害ꎮ 在 Ｖ. ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ 中编码过氧化氢酶的 ｋａｔＧ
基因下调ꎬ导致细胞不能合成足够的过氧化氢酶应
对培养基中的过氧化氢ꎬ这可能是 ＶＢＮＣ 细菌无
法在培养基上形成菌落的一个重要原因[２８]ꎮ
通过 ＲＴ￣ＰＣＲ 的方法ꎬ在 ＶＢＮＣ 状态的 Ｖ.
ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ[２８]和 Ｅ. ｃｏｌｉ[２４]中仍可以检测到某些毒
性基因的表达ꎬ说明 ＶＢＮＣ 状态的细菌保留了部
分的致病能力ꎬ从病原学上分析ꎬ仍然存在很高的
风险ꎮ
在 ＶＢＮＣ状态的恢复过程中ꎬ细胞首先合成
ＲＮＡꎬ翻译蛋白ꎬ细胞增长ꎬ细菌完成自身的生长ꎮ
随后复制 ＤＮＡꎬ分裂繁殖后代[２３]ꎮ Ｅ. ｃｏｌｉ中编码
外膜蛋白的 ｏｍｐＷ 基因在感应外界刺激和启动应
激反应中发挥重要作用ꎬ但是其表达可抑制细菌
ＶＢＮＣ状态的恢复[２９]ꎮ 在恢复过程中ꎬＶ. ｐａｒａｈ￣
ａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ中与 ＴＴＳＳ２ 和溶血素相关的基因表达
量没有发生变化ꎬ证明致病基因并不是所有处于
ＶＢＮＣ状态的细菌恢复所必需的[３０]ꎮ
６ 植物病原细菌 ＶＢＮＣ状态的研究意义
植物病原细菌的 ＶＢＮＣ 状态作为微生物学中
的一个全新概念ꎬ在植物病理学领域受到高度关
注ꎬ它对传统的病害循环、病原菌检测、病害防治等
均提出了新的挑战ꎬ因此研究植物病原细菌的
ＶＢＮＣ状态具有重要的意义ꎮ
４５２
３ 期 蒋 娜ꎬ等:植物病原细菌的 ＶＢＮＣ状态研究进展
６. １ 为田间病害初侵染来源和病害流行学研究
提供参考
在实际生产中ꎬ切断病害的初侵染源是重要的
病害管理措施ꎮ 目前公认的对于植物病原细菌的
鉴定和检测方法中ꎬ均是以培养基的分离培养结果
为基础[３１]ꎬ当在某些情况下ꎬ如果从土壤、种子、田
间病残体、自生植物等介体上均无法检测到病原细
菌ꎬ而田间病害仍然大量发生时ꎬ我们不妨从病原
细菌的 ＶＢＮＣ 状态入手ꎬ对上述材料进一步进行
分析和检测ꎮ 研究病原菌是否能以 ＶＢＮＣ 状态存
在ꎬ在作物生长阶段ꎬ受到植物的根系分泌物或植
物体中的某些物质刺激后ꎬＶＢＮＣ细菌恢复正常状
态ꎬ从而导致病害的发生[８]ꎮ 当然ꎬ这个假设需要
后续通过实验进一步验证ꎮ
６. ２ 指导田间病害防治
当前ꎬ含 Ｃｕ２ ＋的保护性药剂如可杀得等ꎬ是防
治植物细菌病害最常用的农药[３２]ꎮ 但是ꎬ由于
Ｃｕ２ ＋可作为一种细菌 ＶＢＮＣ 状态的诱导剂ꎬ低浓
度条件下可能使细菌进入 ＶＢＮＣ 状态而并未完全
杀死细菌[２ꎬ ６ ~ ８ꎬ １２ ~ １４]ꎮ 因此ꎬ在田间用药时ꎬ要注
意通过调节和控制铜制剂的使用时间、施药次数、
浓度、安全间隔期等ꎬ避免病原细菌进入可能的
ＶＢＮＣ状态而对下一生长季造成潜在危害ꎬ提高防
病效果ꎮ 针对不同的植物病原细菌ꎬ可在实验条件
下分别测定 Ｃｕ２ ＋杀死细菌和诱导 ＶＢＮＣ状态的最
高浓度和最低浓度ꎬ从而为病害防治提供参考ꎮ
６. ３ 促使种子健康检测和种子调运过程中检疫
方法的改进
细菌 ＶＢＮＣ状态的提出ꎬ对种子健康检测的
冲击是最直接的ꎮ 由国际种子检验协会( Ｉｎｔｅｒｎａ￣
ｔｉｏｎａｌ Ｓｅｅｄ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎꎬ ＩＳＴＡ)颁布的«国
际种子检验规程»ꎬ是国际通用也是最常用的种子
健康检验方法ꎬ但是这些常规的方法无法检测到处
于 ＶＢＮＣ 状态的细菌ꎮ 因此ꎬ对于已报道存在
ＶＢＮＣ状态的细菌ꎬ尤其在检测那些可引起重大病
害发生的检疫性病原细菌时ꎬ必要的条件下ꎬ应当
增加 ＶＢＮＣ状态的检测ꎬ确保万无一失ꎮ
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[２７] Ｃｈｉｕ Ｓ Ｗꎬ Ｃｈｅｎ Ｓ Ｙꎬ Ｗｏｎｇ Ｈ Ｃꎬ ｅｔ ａｌ. Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭｒｅＢ ｉｎ Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ ｕｎ￣
ｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒｅｓｓｅｓ [ Ｊ] . Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００８ꎬ ７４(２２): ７０１６ －７０２２.
[２８] Ｓｍｉｔｈ Ｂꎬ Ｏｌｉｖｅｒ Ｊ Ｄ. Ｉｎ ｓｉｔｕ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｅｎｅ
６５２
３ 期 蒋 娜ꎬ等:植物病原细菌的 ＶＢＮＣ状态研究进展
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ ｄｕｒｉｎｇ ｅｎｔｒｙ ｉｎｔｏꎬ ｐｅｒ￣
ｓｉｓｔｅｎｃｅ ｗｉｔｈｉｎꎬ ａｎｄ ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｉａｂｌｅ ｂｕｔ
ｎｏｎｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ ｓｔａｔｅ [ Ｊ] . Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００６ꎬ ７２(２): １４４５ －１４５１.
[２９] Ａｓａｋｕｒａ Ｈꎬ Ｋａｖａｍｏｔｏ Ｋꎬ Ｈａｉｓｈｉｍａ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. Ｄｉｆｆｅｒ￣
ｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗ
(ＯｍｐＷ) ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅｓｃｈｅ￣
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７:Ｈ７ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ｖｉａｂｌｅ ｂｕｔ ｎｏｎ￣
ｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ ｓｔａｔｅ [Ｊ] . Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００８ꎬ
１５９(９ －１０): ７０９ －７１７.
[３０] Ｃｏｕｔａｒｄ Ｆꎬ Ｌｏｚａｃｈ Ｓꎬ Ｐｏｍｍｅｐｕｙ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ
ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ￣ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｖｉａｂｌｅ
ｂｕｔ ｎｏｎｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ ａｆｔｅｒ ｒｅｃｏｖ￣
ｅｒｙ ｆｒｏｍ ｃｕｌｔｕｒａｂｉｌｉｔｙ [Ｊ] . Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００７ꎬ ７３(１６): ５１８３ －５１８９.
[３１] Ａｇｒｉｏｓ Ｇ Ｎ. Ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ( ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ) [Ｍ] .
ＵＳＡ: Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓꎬ ２００５ꎬ ２３.
[３２] Ｂａｓｉｍ Ｈꎬ Ｍｉｎｓａｖａｇｅ Ｇ Ｖꎬ Ｓｔａｌｌ Ｒ Ｅꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｈａｒａｃ￣
ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｃｏｐｐｅｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｆｒｏｍ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｖｅｓｉｃａ￣
ｔｏｒｉａ [ Ｊ] . Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ
２００５ꎬ ７１(１２): ８２８４ －８２９１.
责任编辑:张宗英
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