全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(4): 379鄄384(2011)
收稿日期: 2009鄄12鄄22; 修回日期: 2011鄄04鄄10
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(31000017; 30170238; 30670070); 河南科技大学科研创新能力培育基金(2009CZ0015)
通讯作者: 李 欣, 副教授, 博士, 主要从事植物鄄病原菌相互作用机理研究; Tel: 86鄄0379鄄64282342, Fax: 86鄄0379鄄64282342, E鄄mail:
lixinpxy@hotmail. com。
第一作者: 庞新跃(1978 - ),男,内蒙古呼和浩特人,助教,主要从事病原微生物学研究。
植物病原黄单胞菌毒性相关基因对内源
过氧化氢的上游调控作用研究
庞新跃1, 李 欣2*, 王 娜2, 刘 严2, 郭 菡2, 李红玉3
( 1河南科技大学医学技术与工程学院, 洛阳 471003; 2河南科技大学食品与生物工程学院, 洛阳 471003;
3干旱与草地农业生态教育部重点实验室,兰州大学生命科学学院, 兰州 730000)
摘要: 以植物病原细菌黄单胞菌的 avrXa7 基因和 ahpC基因的 2 个突变体及其野生型菌株为研究对象,探讨植物病原细
菌内源过氧化氢水平与菌株毒性的联系。 AR / HRP法分析病原菌的过氧化氢清除力,组织化学法对细胞内过氧化氢进行
定量和定位分析。 结果表明,avrXa7 基因的突变诱导病原菌毒性的显著降低,并引起病原菌内源过氧化氢积累水平显著下
降;ahpC基因的突变诱导病原菌内源过氧化氢水平显著降低,但未能引起病原菌毒性产生显著的变化。 研究结果说明,在
植物病原细菌黄单胞病菌的致病机制中,病原菌内源过氧化氢的积累水平并不能直接决定菌株的毒性,而是处在 avrXa7
基因的下游,受到 avrXa7 或者更多毒性相关基因的调控,参与病原菌的致病过程。
关键词: 毒性; avrXa7; ahpC; 过氧化氢; 植物病原细菌
Upstream regulation of virulent genes on endogenous hydrogen peroxide in phyto鄄
pathogenic Xanthomonas 摇 PANG Xin鄄yue1, LI Xin 2, WANG Na2, LIU Yan2, GUO Han2,
LI Hong鄄yu3 摇 ( 1Medical Technology and Engineering College, Henan University of Science and Technology, Luoyang
471003, China; 2Food and Bioengineering College, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China;
3MOE Key Laboratory of Arid and Grassland Ecology, School of Life sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)
Abstract: Two mutants, avrXa7 and ahpC and their wild strains of Xanthomonas were used in the study to
determine the corrleation between the endogenous hydrogen peroxide (H2O2) and the virulence of phytopatho鄄
genic Xanthomonas. H2O2 scavenging of the pathogen was determined by AR / HRP assay. The quantity and
localization of endogenous H2O2 were obtained by histochemical method. The results showed that the loss of
function of avirulence gene avrXa7 led to significant decrease in virulence of the patogen and resulted in a great
reduction of endogenous H2O2 accumulation in avrXa7 mutant cell, while the impairment of endogenous H2O2
level caused by ahpC mutation failed to decrease the virulence of the pathogen on rice. This inferred that the
H2O2 production was down鄄regulated by avrXa7 or other genes. H2O2 might be a downstream factor of viru鄄
lent gene production acting in the pathogenetic process of pathogens.
Key words: virulence; avrXa7; ahpC ; hydrogen peroxide; phytopathogenic bacteria
中图分类号: S432. 2摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 0412鄄0914(2011)04鄄0379鄄06
摇 摇 植物病原真菌和动物病原细菌细胞中都有内
源过氧化氢产生[1 ~ 3]。 如大肠杆菌 (Escherichia
coli)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、肺炎链球
菌 ( Streptococcus pneumoniae ) 和 化 脓 链 球 菌
摇
植物病理学报 41 卷
(Streptococcus pyogenes)都能产生大量的过氧化
氢[2, 4],过氧化氢在病原菌中具有作为信号分子或
者毒性因子不同的作用[1, 2, 5, 6]。 在动物鄄病原菌
互作中,病原菌释放大量与其致病性相关的活性氧
分子[1, 7],互作系统中的活性氧释放水平也因病原
菌的活性氧释放水平不同而有明显差异,病原菌释
放的活性氧在互作系统中起到重要的作用[2, 8]。
目前对于植物病原菌自身活性氧释放的病理
学意义研究很少。 Rolke 等[1]曾在大豆叶片悬浮
细胞中观察到与病原真菌灰葡萄孢病菌(Botrytis
cinerea)的致病性成比例的 H2O2 的产生。 研究者
推测这些 H2O2 来自于病原真菌并在植物病害病
程发展过程中扮演重要的角色[9]。 6 种灰葡萄孢
病菌的侵染能力与其自身产生的 H2O2 相联系[1]。
虽然已有研究报道了植物病原细菌黄单胞菌
中抗氧化体系的复杂机制[10 ~ 14],本实验室之前的
研究结果也已证实,黄单胞菌中有大量内源过氧化
氢的产生和积累[15 ~ 17],但对黄单胞菌中内源产生
的过氧化氢水平是否与病原菌的毒性相关还没有
明确的研究结果,植物病原细菌黄单胞菌中的内源
过氧化氢与毒性基因在病原菌的致病过程的上下
游关系还有待进一步的研究。 阐明上述问题将促
进植物病原细菌的致病机制研究,也可为更好地解
释植物抗病性的分子机制开拓新的思路,对植物鄄
病原菌互作研究具有重要意义。
1摇 材料与方法
1. 1摇 试剂
盐酸羟胺 (Hydroxylamine hydrochloride)、过
氧化氢,购自上海生工公司。
1. 2摇 菌株
烷基过氧化物还原酶亚基 C(AhpC)是烷基过
氧化物还原酶的催化亚基,在过氧化物的代谢中起
到重要的作用。 本实验使用的油菜黄单胞菌菜豆
致病变种(Xanthomonas campestris pv. phaseoli)的
ahpC基因突变体菌株 XpahpC和野生型菌株 Xpw
由泰国 Chulabhorn 研究院生物工艺学实验室
Skorn教授馈赠。 水稻白叶枯病菌菌株 ( Xan鄄
thomonas oryzae pv. oryzae)、野生型菌株 PXO1865
和 avrXa7 基因的突变体菌株 PXO0314,均由美国
堪萨斯州立大学 Leach教授馈赠。 Cruz 等[18]的研
究结果显示 PXO0314 细胞中由于 avrXa7 基因的
局部突变导致了 avrXa7 基因功能的丧失,从而导
致菌株毒性的降低。 将冻干保存的上述菌株样品
划线接种到 PSA平板上,28益下培养 48 h以上,挑
单菌落接种于 NB液体培养基中,28益振荡培养至
培养液混浊,甘油保存菌种,备用。
1. 3摇 水稻上病原菌毒性的检测
温室内对含 Xa7 基因的水稻 DV85 和水稻白
叶枯病菌的亲和水稻品系域you 838 进行育苗。 育
苗条件为:14 h光照,85%湿度以及日间温度 28益
和夜间温度 25益 [19]。 55 d后,用无菌剪刀沾取病
原菌悬浮液(5 伊 108 cfu / mL)剪叶接种水稻[20]。
接种后 14 d检测病斑长度。 用水做剪叶处理的空
白对照叶片上没有观察到病斑。 每组实验接种 15
张叶片,在多个独立的实验中得到类似的结果。
1. 4摇 细菌细胞的过氧化氢清除力
油菜黄单胞菌菜豆致病变种菌株细胞在有氧
条件下生长至少 4 代,挑取单菌落接种于 NB培养
液中,28益培养,菌悬液密度在 0. 1 至 0. 3 OD600
nm时,3 000 rpm离心收集菌体细胞,室温条件下,
用磷酸盐缓冲液(PBS, pH = 7. 3)重悬沉淀,如此
洗脱 2 次,最终重悬至菌悬液密度为 0. 1 OD。 外
加过氧化氢至终浓度 1. 5 滋mol / L,采用 Seaver 和
Imlay的 AR / HRP方法,按一定时间间隔检测过氧
化氢浓度变化[21]。
1. 5摇 电镜检测过氧化氢的积累
采用组织化学方法对水稻白叶枯病菌的内源
过氧化氢积累进行离体检测[22]。 3 000 rpm 离心
收集菌体,用含 5 mmol / L CeCl3的磷酸盐缓冲液
(PBS, pH =7. 2)重悬并在 28益下温育 1. 5 h。 细
胞中的过氧化氢积累可以被 CeCl3 (Sigma, UK)
特异染色。 采用 Bestwick 等[22]的方法,通过检测
铈过氧化物的沉积物判断过氧化氢的积累位点,切
片用透射电子显微镜在 80 kV 下观察(EM100C,
JEOL, Tokyo)。
1. 6摇 统计学分析
用 SPSS 11. 5 进行统计学分析。 独立样本间
的差异显著性分析用 nonparametric tests, 包括
Mann鄄Whitney Test、 Moses Test、 Two鄄Sample
083
摇
摇 4 期 摇 摇 庞新跃,等:植物病原黄单胞菌毒性相关基因对内源过氧化氢的上游调控作用研究
Kolmogorov鄄Smirnov Test 和Wald鄄Wolfowitz Test。
ahpC基因和 avrXa7 基因突变造成的差异显著性
用 paired鄄sample T test 分析。 结果分为显著(P <
0. 05) 和极显著(P <0. 01)。
2摇 结果与分析
2. 1摇 avrXa7 基因突变对病原菌的影响
本实验以水稻白叶枯病菌野生型菌株
PXO1865 和 avrXa7 基因突变的菌株 PXO0314 为
研究对象,分析无毒基因 avrXa7 的突变对病原菌
毒性及细胞中过氧化氢积累的影响。
2 . 1 . 1 摇 avrXa7基因突变对病原菌毒性的影响
在水稻品种域you 838 和 DV85 上,野生型菌株
PXO1865 侵染的水稻叶片病斑比 avrXa7 突变体
菌株 PXO0314 侵染病斑长的多。 剪叶法接种 14 d
后,PXO1865 在水稻域you 838 和 DV85 上诱导的
病斑分别为(11. 39 依0. 95) cm和(4. 02 依0. 62) cm。
而突变体 PXO0314 在这 2 个品种上诱导的病斑分
别为 (6. 73 依 0. 63 ) cm 和 (1. 85 依 0. 54 ) cm
(图 1)。 结果表明,突变体 PXO0314 在水稻上的
毒性显著低于野生型菌株 PXO1865(P <0. 01),图
1 说明 avrXa7 基因的局部突变导致了病原菌毒力
的降低。
2. 1. 2 摇 avrXa7 基因突变对病原菌内源过氧化氢
积累的影响摇 野生型菌株 PXO1865 和 avrXa7 基
因的突变体PXO0314细胞中,细胞内源的过氧化
氢积累定位在细胞壁上。 PXO1865 细胞中代表过
氧化氢的铈过氧化物沉积物大量沉积在细胞壁上
(图 2鄄A)。 相反,在 PXO0314 细胞的细胞壁上只
检测到微量的过氧化氢积累(图 2鄄B)。 该结果说
明,avrXa7 基因显著影响过氧化氢在病原菌中的
积累,其突变可减少过氧化氢的积累。
Fig. 1摇 Effects of avrXa7 mutation on the vi鄄
rulence of Xanthomonas oryzae pv.
oryzae
Virulence assays were conducted by inoculating the rice culti鄄
var 域you 838 susceptible to rice bacterial blight, and DV85
that harboring Xa7 gene. PXO1865: wild鄄type strain of X.
oryzae pv. oryzae; PXO0314: avrXa7 mutant of X. oryzae
pv. oryzae. Values were the means of 15 replicates, error
bars represented standard errors.
Fig. 2摇 Effect of avrXa7 mutation on endogenous hydrogen peroxide accumulation
in Xanthomonas cells (arrowed)
A: Xpw (wild鄄type strain); B: XpahpC (ahpC mutant) .
183
摇
植物病理学报 41 卷
2. 2摇 ahpC基因突变对病原菌的影响
本实验以油菜黄单胞菌菜豆致病变种菌株野
生型菌株 Xpw 和 ahpC 基因突变的菌株 XpahpC
为研究对象,分析烷基过氧化物还原酶 ahpC 基因
的突变对细胞中过氧化氢积累及病原菌毒性的影
响。
2. 2. 1摇 ahpC突变对病原菌细胞中过氧化氢清除
力的影响摇 实验结果表明,与野生型菌株 Xpw 相
比,油菜黄单胞菌菜豆致病变种的 ahpC 基因突变
体菌株 XpahpC 的过氧化氢清除速度有显著的提
高,过氧化氢清除酶的总活性显著升高(Nonpara鄄
metric tests, P <0. 05) (图 3)。 因此,AhpC 酶的
缺失导致了突变体菌株中过氧化氢清除酶总活性
的补偿性上升。
Fig. 3 摇 Effect of ahpC mutation on the
hydrogen peroxide scavenging in
Xanthomonas cells
Cultures of Xpw (wild鄄type strain), XpahpC (ahpC mutant)
were grown aerobically in NB and resuspended in PBS at an
OD600 nm of 0. 1. H2O2 was added at a final concentration of
1. 5 滋mol / L. At various time points after addition of H2O2,
the H2O2 concentration was measured
2. 2. 2摇 ahpC突变对菌株毒性的影响 摇 在水稻域
you 838 和 DV85 上,被野生型菌株 Xpw侵染后水
稻叶片病斑与 ahpC突变体菌株 XpahpC侵染病斑
没有显著差异(图 4)。 剪叶法接种 14 d 后,Xpw
在水稻域you 838 和 DV85 上诱导的病斑分别为
(9. 21 依 0. 86) cm 和(4. 41 依 0. 55) cm。 而突变
体 XpahpC在水稻域you 838 和 DV85 上诱导的病
斑分别为(10. 19 依 1. 02) cm 和(4. 45 依 0. 38) cm
(图 4)。 统计结果表明,突变体 XpahpC 在水稻上
的毒性与野生型菌株 Xpw 没有显著的差异(P >
0. 05)。
Fig. 4摇 Effects of ahpC mutation on the viru鄄
lence of Xanthomonas campestris
pv. phaseoli
Virulence assays were conducted by inoculating rice plants of
域you 838, and DV85. Xpw is wild鄄type strain of Xan鄄
thomonas campestris pv. phaseoli; XpahpC is ahpC mutant.
Values were the means of 15 replicates, error bars represented
standard errors.
3摇 讨论
白叶枯病菌是水稻的重要致病细菌病原,目前
已经从白叶枯病菌中克隆得到无毒基因。 AvrXa7
是 avrBs3 无毒基因家族的成员。 avrXa7 基因诱导
植物 R基因控制的植物防御反应,包括过敏反应
(HR) [23 ~ 25]。 本实验中,白叶枯病菌 avrXa7 基因
突变后,病原菌在含相应抗性 Xa7 基因的水稻上
的毒性显著降低(图 1)。 Cruz 等[18]在水稻 IR24
上也得到相似的结论。 结果显示,病原菌中
avrXa7 基因功能的丧失显著地阻止了含 Xa7 基因
的水稻发病。 病原菌对水稻的毒性功能依赖
avrXa7 基因的表达。
实验中通过检测铈过氧化物沉积物的形成分
析病原菌内源过氧化氢的产生和积累的细胞定位。
本实验的结果表明,与野生型菌株 PXO1865 相比,
avrXa7 基因的突变体菌株 PXO0314 的细胞中内
源过氧化氢的积累显著降低(图 2)。 avrXa7 基因
突变导致病原菌内源过氧化氢积累量的变化,
avrXa7 基因对病原菌内源过氧化氢的积累有一定
的调控作用。
另一方面,病原菌细胞中 ahpC 基因的突变导
283
摇
摇 4 期 摇 摇 庞新跃,等:植物病原黄单胞菌毒性相关基因对内源过氧化氢的上游调控作用研究
致重要抗氧化酶 AhpC酶的缺失。 ahpC 基因突变
后细胞中的过氧化氢清除活性显著上升。 Skorn等
对油菜黄单胞菌菜豆致病变种 ahpC 突变体菌株
细胞中过氧化物清除酶系的分析结果显示,油菜黄
单胞菌菜豆致病变种菌株细胞中 AhpC 的缺失诱
导 CAT 活性的补偿性显著上升,并且导致胞内过
氧化物水平的变化[13]。 本实验结果也显示,ahpC
突变体菌株 XpahpC 细胞中 AhpC 的缺失的确导
致了胞内过氧化氢清除总活性的显著上升(图 3)。
更引人注意的是,与野生型菌株 Xpw相比,代表内
源过氧化氢积累的铈过氧化物的沉积在 ahpC 突
变体菌株 XpahpC 细胞中也显著降低[15, 17]。 图 3
所示的胞内过氧化氢清除活性的升高是病原菌
ahpC突变体细胞中过氧化氢水平下降的直接原
因。
本实验室前期结果显示,野生型菌株 Xpw 细
胞中,大量过氧化氢不连续的积累在细胞壁上。 相
反,在突变体菌株 XpahpC 细胞中,在细胞壁上只
检测到微量的过氧化氢积累。 XpahpC 细胞中 ah鄄
pC基因的突变诱导病原菌细胞过氧化氢积累水平
的显著下降[15, 16]。 但是在水稻植株上的毒性检测
结果显示,ahpC基因的突变并未引起病原菌毒性
的显著变化。 在不同品系的水稻植株上,过氧化氢
水平显著不同的病原菌的毒性均未表现出显著的
差异(图 4)。
黄单胞菌中有关毒性 ( avrXa7)和过氧化氢
(ahpC)的 2 个关键基因突变后的实验结果显示,
avrXa7 突变引起毒性削弱能够诱导病原菌内源过
氧化氢积累水平产生相应地显著降低,显示
avrXa7 基因对内源过氧化氢的积累有一定的调控
作用;而 ahpC突变引起过氧化氢水平下降则未能
影响菌株毒性产生显著的变化,病原菌内源过氧化
氢的积累水平并不能直接决定菌株的毒性。
4摇 结论
过氧化氢在植物病原细菌细胞中受到 avrXa7
基因的调控,很可能是依赖 AvrXa7 的下游调控
子。 在黄单胞病菌的致病机制中,病原菌内源过氧
化氢的积累水平并不能直接决定菌株的毒性,而是
处在 avrXa7 基因的下游,受到 avrXa7 或者更多毒
性相关基因的调控,参与病原菌的致病过程。
致谢:泰国 Chulabhorn 研究院生物工艺学实验室
Skorn教授馈赠实验用油菜黄单胞菌菜豆致
病变种野生型和 ahpC 基因突变体菌株。 堪
萨斯州立大学 Leach教授馈赠实验用水稻白
叶枯病菌野生型和 avrXa7 基因突变体菌株。
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责任编辑:于金枝
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