全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第1期，2006年2月 87
一种定量分析水稻细胞过敏反应的方法
齐放军* 高世强 吴茂森 何晨阳**
中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100094
A Method for the Quantitative Determination of Hypersensitive Response
of Rice Cells
QI Fang-Jun*, GAO Shi-Qiang, WU Mao-Sen, HE Chen-Yang**
State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural
Sciences, Beijing 100094, China
提要 在定量分析水稻细胞过敏反应(HR)方法中，溴酚蓝染色法的效果明显优于伊文氏蓝染色法。线形回归分析显示，
在 0.625~20 mg·mL-1 范围内的溴酚蓝最大光吸收值与其浓度间的相关系数为 0.9994。溴酚蓝染色法优化的测定条件为：
0.03% 溴酚蓝染色 15 min，水洗去除未结合染料，再在 50℃下用含 50% 甲醇和 1% SDS 抽提液抽提与死亡细胞结合的染
料 30 min，测定抽提液光吸收值(OD595)，以甲醇处理 15 min 的细胞作为全杀死细胞参照。用优化方法测定的水稻细胞
死亡率与实际死亡率一致。
关键词 水稻细胞；过敏反应；植物病原细菌；溴酚蓝染色法
收稿 2005-05-26 修定 　 2005-11-23
资助　 国家自然科学基金(30571212、30370922)。
*E-mail: qfj@sdu.edu.cn, Tel: 010-62896063
** 通讯作者(E-mail: cyhe@caas.net.cn, Tel: 010-62894147)。
植物细胞过敏反应(hypersensitive response，
HR)是抗病反应的特征性标志之一(Greenberg 等
1994)。与动物细胞凋亡相似，植物细胞 HR 是受
基因表达控制的程序化细胞快速死亡反应
(Greenberg和 Yao 2004)。植物HR的发生不仅能
将病原菌限制在侵染位点内，还可激发植物其它
类型抗病反应的产生( G r e e n b e r g 等 1 9 9 4；
Greenberg和Yao 2004)。
定性检测植物 H R 的方法很多( D a n o n 等
2000；Houot等 2001；Sasabe等 2000；Solomon
等 1999)，如细胞学方法分析亚细胞结构的特征
性变化、生化方法测定细胞死亡的标志酶和 DNA
Laddering等分子生物学技术测定编程性死亡的分
子特征。此外，定量分析植物 HR 也是揭示其产
生机制的手段，染色法是目前定量检测细胞死亡
中的主要研究方法之一(Delledonne 等 1998,
2001)。染色法的基本原理是染料能渗入死亡细
胞，而活细胞由于其有完整的细胞膜和选择性通
透能力，可阻止染料进入细胞内( W e i s s 和
Zychlinsky 2002)。伊文氏蓝(Evan’s blue)染料分子
量较大，活细胞拒染明显，是检测细胞死亡中最
常用的染料之一(Delledonne等1998, 2001)。我们
发现伊文氏蓝染料不能有效地染色水稻死亡细胞，
因而不适宜于水稻细胞死亡的定量测定。而分子
量较小的溴酚蓝(bromphenol blue)染料则能显著区
分活细胞和死亡细胞，可准确测定水稻细胞死亡
率。本文报道定量分析水稻细胞HR的溴酚蓝染色
方法及其测定条件优化所得到的结果。
材料与方法
1 水稻悬浮培养细胞制备
参照Kuchitsu等(1993)的方法进行。将水稻
品种‘日本晴’(Oryzae sativa cv. Nipponbare)的
成熟胚接种在附加 2 mg·L-1 2,4-D 的 MS 培养基
(Murashige和Skooge 1962)上诱导，形成的愈伤
组织转至MS 培养基上继代培养，20 d 继代 1次。
生长良好的愈伤组织接入附加1.5 mg·L-1 2,4-D的
MS 液体培养基中，在28℃、100 r·min-1 条件下
振荡培养。每周更换培养基，继代培养悬浮细
胞。取继代培养 5 代以上，生长良好、均一的
悬浮细胞分装至50 mL 三角瓶中(10 mL培养基中
1 g 细胞)，用于下列实验。
2 不同染色方法和细胞死亡率测定
用0.03% 溴酚蓝或0.05% 伊文氏蓝染色正常
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生长的水稻细胞和杀死细胞，染色15 min后以流
水充分冲洗去除未结合染料，在 50℃下用 20 mL
含 50% 甲醇和 1% SDS 的溶液抽提与死细胞结合
的染料30 min，测定抽提液光吸收值，伊文氏蓝
染色的测定波长为600 nm，溴酚蓝染色的测定波
长为595 nm。具体测定内容有：(1)甲醇处理 15
min 杀死的水稻细胞，分别用不同浓度溴酚蓝染
色后测定，比较染料浓度对测定的影响；(2)用甲
醇或乙醇处理，或煮沸处理水稻细胞不同时间
后，再用 0.03% 溴酚蓝染色测定，比较细胞杀死
处理方法的优劣；(3)精确称量水稻活细胞和甲醇
处理的死细胞，人工制备已知死亡率的水稻细胞
样品，对这些已知死亡率的水稻细胞样品进行测
定。按公式：细胞死亡率(%)=(OD595 处理 -OD595
对照)/(OD595 全杀死 -OD595 对照)×100% 计算。
3 溴酚蓝光谱特性分析
用可见 - 紫外分光光度计(Perkin Elmer
Lambda 35)对不同浓度溴酚蓝进行波长(500~650
nm)扫描分析。线形回归分析溴酚蓝最大光吸收
值与其浓度间的相关性。
4 病原细菌诱导水稻细胞HR的测定
亲和菌株水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae
pv. oryzae)‘Jxo I’和细菌性条斑病菌(X. oryzae
pv. oryzicola)‘Rs63’，由南京农业大学刘凤权
先生惠赠；不亲和菌株辣椒细菌性斑点病菌(X.
campestris pv. vesicatoria)‘Xv1’、‘Xv5’和
‘Xv18’、甘蓝黑腐病菌(X. campestris pv.
campestris)‘Xc9’，由本所孙福在先生提供。菌
株在NA (方中达 1996)上培养，其单菌落接种在
NB (方中达 1996)中，于28℃、150 r·min-1下过
夜振荡培养，离心收集菌体，并悬浮于 MS 培养
基中，制备菌悬液，接种浓度为108 cfu·mL-1。接
种 24 h 后测定水稻细胞死亡率。
结果与讨论
1 不同染色测定水稻细胞过敏反应方法的比较
结果如图 1 所示。伊文氏蓝对水稻死亡细胞
的染色效果差，染色后的活细胞和死细胞光吸收
值差异不明显，表明该染料对水稻死亡细胞的染
色效果差，不能准确测定水稻 HR 的死细胞。而
用溴酚蓝染色，则能显示出水稻活细胞和死细胞
光吸收值的差异，即能明显区分活细胞和死细
胞，显示其效果明显优于伊文氏蓝。
2 溴酚蓝的光谱特性
溴酚蓝有单一的光吸收峰，最大光吸收波长
为 595 nm (图 2)。0.625、1.25、2.5、5、10
及20 mg·mL-1浓度溴酚蓝的最大光吸收值分别
为 0.072、0.173、0.376、0.808、1.569、2.964
(图 2)。线形回归分析显示，溴酚蓝的最大光吸
收值与其浓度间的相关系数为0.9994，线形关系
良好。这些结果进一步表明溴酚蓝是适用于定量
分析水稻细胞死亡的染料。
图 2 不同浓度溴酚蓝的光谱分析
　　各曲线自上而下分别代表浓度为 2 0 、1 0 、5 、2 . 5 、
1.25、0.625 mg·mL-1 溴酚蓝的波长扫描结果。
图 1 伊文氏蓝与溴酚蓝对水稻细胞染色的效果比较
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3 杀死水稻细胞的方法比较
用染色法测定细胞死亡率，杀死细胞的光吸
收值是参照的指标之一。为了确定适宜的细胞杀
死方法，我们对甲醇或乙醇处理以及煮沸处理杀
死的水稻细胞作了比较。图 3 显示，甲醇和乙醇
处理杀死的细胞光吸收值均较大，煮沸处理杀死
的细胞光吸收值略低。据此，本文即以甲醇处理
15 min 的水稻细胞作为杀死细胞的参照样品。
5 已知死亡率的水稻细胞测定
用上述最适的测定条件测定人工制备的已知
死亡率水稻细胞样品的结果表明，溴酚蓝染色法
对水稻细胞死亡率的测定值与样品的实际死亡率基
本上吻合(表1)，说明溴酚蓝染色法可用于水稻死
细胞的定量测定。由于水稻活细胞样品含水量的
差异以及用水冲洗未结合染料操作中的细胞损失，
会对实验结果造成一定的偏差，这在操作时应当
加以注意，本文中的此类偏差可控制在 1 0 % 以
内。
图4 不同浓度溴酚蓝对水稻细胞的染色结果 图5 溴酚蓝染色测定病原细菌诱导水稻细胞HR
表1 溴酚蓝染色法测定已知死亡率水稻细胞的效果
样品死亡率/%　　　　　 死亡率的测定值/%
0 0±9.8
5 4.0±8.5
10 9.0±1.9
20 19.0±2.6
40 44.1±6.7
60 68.3±1.3
80 87.0±2.4
100 100.0±9.8
6 病原细菌诱导水稻细胞HR的测定
图 5 显示，亲和菌株‘J x o I ’、“R s 6 3 ’
诱导的水稻细胞死亡率低，与未经处理的对照无
明显差异，表明亲和细菌不能诱导水稻细胞 HR；
而不亲和菌株‘X v 1 ’、‘X v 5 ’、‘X v 1 8 ’、
‘X c 9’诱导水稻细胞的死亡率分别为 4 2 . 3 %、
48.8%、64.5%、56.8%，表明不亲和细菌能够
诱导水稻细胞 H R。
4 不同浓度溴酚蓝的染色效果比较
图4结果显示，染色的溴酚蓝浓度低于0.02%，
光吸收值随着溴酚蓝浓度的增加而升高，这表明
溴酚蓝对死细胞的染色不充分；溴酚蓝浓度提高
到或超过 0.03% 时，光吸收值趋于稳定。据此，
取 0.03% 溴酚蓝用作水稻细胞染色。
图 3 不同处理杀死的水稻细胞的染色结果
　　1: 对照；2: 甲醇处理 15 min；3: 甲醇处理 30 min；4:
乙醇处理 15 min；5: 乙醇处理 30 min；6: 煮沸 5 min。
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总之，本文建立的溴酚蓝染色法为研究水稻
细胞HR研究提供了稳定而可靠的定量方法，同时
对其它植物 HR 的研究也有一定的参考价值。
参考文献
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