全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４５(４): ４２５￣４３７(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０５￣０２ꎻ 修回日期: ２０１５￣０４￣３０
基金项目: 山东省科技发展计划项目(２０１１ＧＮＣ１１００６)ꎻ枣庄市科学技术发展计划项目(２０１２３３￣２)ꎻ枣庄学院青年项目(３０７０５０９０１)
通讯作者: 谭小艳ꎬ讲师ꎬ硕士ꎬ主要从事植物病害生物防治研究ꎻＴｅｌ:１３５６２２２５４９０ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｔｏｍｈａｈａ１６８＠１２６.ｃｏｍꎻ
黄思良ꎬ研究员ꎬ主要从事植物病害综合防治技术研究ꎻＴｅｌ:０３７７￣６３５１３４６１ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｓｉｌｉａｎｇｈｕａｎｇ＠１２６.ｃｏｍ
第一作者: 马耀华ꎬ讲师ꎬ硕士ꎬ主要从事植物病害生物防治及应用微生物学方面的研究ꎻ Ｔｅｌ:１３９０６３２８６３２ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｙａｏｈｕａｍａ＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０４.０１２
石榴干腐病生防菌株 Ｚ２的鉴定及其培养条件的优化
马耀华１ꎬ 谭小艳１∗ꎬ 黄思良２∗ꎬ 张 珣３ꎬ 臧丽琴１ꎬ 牛小瑞２
( １枣庄学院生命科学学院ꎬ枣庄 ２７７１６０ꎻ ２南阳师范学院生命科学与技术学院ꎬ 南阳 ４７３０６１ꎻ
３中国农业大学农学与生物技术学院植物病理学系ꎬ北京 １００１９３)
摘要:从石榴根际土壤中分离获得一株生防细菌菌株 Ｚ２ꎮ 根据 １６Ｓ ｒＤＮＡ、ｇｙｒＡ 基因序列分析和特定基因的选择性扩增ꎬ
结合形态学、生理与生化特性鉴定和 Ｂｉｏｌｏｇ 检测ꎬ将生防菌株 Ｚ２ 鉴定为解淀粉芽胞杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ)ꎮ 通
过单因素试验研究菌株的培养条件ꎬ并经过正交实验设计对培养条件进行优化ꎬ探究生防菌对 Ｚｙｔｈｉａ ｖｅｒｓｏｎｉａｎａ 引起的石
榴干腐病的防治效果ꎮ 生防菌株 Ｚ２的优化培养条件为:温度 ２７℃ꎬｐＨ ＝ ６或 ８ꎬＬＢ培养基ꎬ培养时间 ３ ｄꎮ 采用新鲜离体
石榴果实针刺接种方法进行菌株生防效力检测ꎬ与其他供试植物病原真菌相比ꎬ菌株 Ｚ２对石榴果实干腐病菌 Ｚ. ｖｅｒｓｏｎｉａｎａ
具有较强的抑菌活性ꎬ对石榴果实干腐病的病斑抑制率达 ３１.２７％~８１.８９％ꎮ 本研究获得的生防菌株 Ｚ２对石榴干腐病生物
防治具有开发应用潜力ꎬ优化的培养条件可为该生防菌的产业化和大田应用奠定基础ꎮ 另外ꎬ菌株 Ｚ２ 对植物病原真菌有
较宽的抑菌谱ꎬ表明该菌株对其他作物病害的防治也具有潜在的应用价值ꎮ
关键词:石榴干腐病ꎻ 生物防治ꎻ 菌株鉴定ꎻ 培养条件优化ꎻ 解淀粉芽胞杆菌
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２ ａｇａｉｎｓｔ ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ ｄｒｙ ｒｏｔ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｉｔｓ ｃｕｌｔｕｒａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ 　 ＭＡ Ｙａｏ￣ｈｕａ １ꎬ ＴＡＮ Ｘｉａｏ￣ｙａｎ１ꎬ ＨＵＡＮＧ Ｓｉ￣ｌｉａｎｇ２ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｘｕｎ３ꎬ
ＺＡＮＧ Ｌｉ￣ｑｉｎ１ꎬ ＮＩＵ Ｘｉａｏ￣ｒｕｉ２ 　 ( １Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｚａｏｚｈｕａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｚａｏｚｈｕａｎｇ ２７７１６０ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｓｃｈｏｏｌ
ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｎａｎｙａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｎａｎｙａｎｇ ４７３０６１ꎬ Ｃｈｉｎａ ꎻ ３Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ
Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９３ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ａ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｓｏｉｌ ｏｆ ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ (Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ)ꎬ
ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ ａｎｄ ｇｙｒＡ ｇｅｎｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅｓ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌꎬ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌꎬ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔꎬ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｕｓｉｎｇ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｉｔｓ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｚｙｔｈｉａ
ｖｅｒｓｏｎｉａｎａ ｃａｕｓｉｎｇ ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ ｄｒｙ ｒｏｔ (ＰＤＲ) . Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｕｌｔｕｒａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｓ
ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ２７ °Ｃꎬ ｐＨ ＝６ ｏｒ ８ꎬ ＬＢ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ３ ｄ. Ｔｈｅ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ
ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｎｅｅｄｌｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｆｒｅｓｈｌｙ ｄｅｔａｃｈｅｄ ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ ｆｒｕｉｔ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｕｌｔｕｒａｌ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ. Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２ ｈａｄ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｚ. ｖｅｒｓｏｎｉａｎａ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｆｕｎｇａｌ ｐｈｙ￣
ｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｔｅｓｔｅｄ. Ｔｈｅ ｌｅｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ ｆｒｕｉｔ ｄｒｙ ｒｏｔ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｏ ３１.２７％－８１.８９％ ｂｙ ｓｔｒａｉｎ
Ｚ２. Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｔｈｕｓ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ａｇｅｎｔ ａｇａｉｎｓｔ ＰＤＲ. Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｕｌｔｕｒａｌ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｌａｙ ａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｅｌｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ａｇｅｎｔ. Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎꎬ ａ ｂｒｏａｄ
ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２ ａｇａｉｎｓｔ ｆｕｎｇａｌ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄꎬ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ
　
植物病理学报 ４５卷
Ｚ２ ａｓ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ａｇｅｎｔ ａｇａｉｎｓｔ ｏｔｈｅｒ ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ＰＤＲ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ ｄｒｙ ｒｏｔꎻ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌꎻ ｓｔｒａｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓꎻ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ
中图分类号: Ｓ４７６　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０４￣０４２５￣１３
　 　 石榴(Ｐｕｎｉｃａ ｇｒａｎａｔｕｍ)原产于伊朗、阿富汗ꎬ
在亚洲、非洲和欧洲沿地中海各地均有栽培ꎬ以热
带非洲尤多[１]ꎮ 我国除东北极寒冷地区外ꎬ均适
合石榴栽培[２]ꎮ 由 Ｚｙｔｈｉａ ｖｅｒｓｏｎｉａｎａ Ｓａｃｃ.引起的
石榴干腐病是影响石榴产业最严重的病害ꎬ该病主
要侵染石榴的果实和树干ꎬ在贮藏期也造成大量烂
果[３]ꎮ 目前ꎬ国内外对石榴干腐病采取以农业防
治技术为基础ꎬ化学防治技术为主导的综合防治措
施ꎬ防治效果不甚理想ꎮ 农业防治多采用清园、套
袋、加强栽培管理等ꎮ 化学防治使用的农药有多菌
灵、甲基托布津、代森锰锌、福美砷和石硫合剂
等[１~７]ꎮ 然而化学农药造成的环境污染问题、病原
微生物抗药性的问题及其对人类健康的潜在威胁
越来越受到关注ꎮ 由于缺乏化学农药的合理使用ꎬ
过量频施化学农药ꎬ严重破坏了生态平衡和生物的
多样性ꎬ因此ꎬ寻求安全有效的病害防治途径ꎬ生物
防治或许是解决化学农药残留污染的有效途径之
一[８ꎬ ９]ꎮ Ｌｕ等[１０]从枇杷内生真菌中ꎬ筛选出对石
榴干腐病菌有拮抗活性的菌株ꎮ 目前国内外鲜有
石榴干腐病生防细菌方面的研究ꎬ本文成功分离到
对石榴干腐病菌有较强抑制活性的生防细菌 Ｚ２ꎬ
应用传统的形态学和生理生化及分子生物学相结
合的方法对生防菌株 Ｚ２ 进行了鉴定ꎬ同时通过正
交试验设计对该菌株的培养条件进行了优化ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 材料
１.１.１　 供试菌株　 石榴干腐病菌(Ｚ. ｖｅｒｓｏｎｉａｎａ)
菌株 Ｚｙ０６、抑菌谱测定所用的植物病原真菌均由
课题组分离纯化ꎬ并经致病性验证后获得ꎬ枯草芽
胞杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ)菌株 ＮＳ０３ 由本课题组分
离纯化并鉴定获得ꎮ
１.１.２　 培养基 　 本试验使用的固体培养基为 ＮＡ
和 ＰＤＡ[１１]ꎮ ＬＢ、豆芽汁葡萄糖、ＮＢ(不加琼脂的
ＮＡ)和 ＰＤＢ(不加琼脂的 ＰＤＡ)液体培养基参考文
献[１１] ~ [１３] 配制ꎮ 淀粉液体培养基(蛋白胨
１０ ｇ、ＮａＣｌ ５ ｇ、牛肉膏 ５ ｇ、可溶性淀粉 ２ ｇ、蒸馏
水１ ０００ ｍＬ)按常规方法配制ꎮ 玉米粉蔗糖液体
培养基(玉米粉 ６０ ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ３ ｇ、维生素 Ｂ１ １００
ｍｇ、蔗糖 １０ ｇ、ＭｇＳＯ４􀅰７Ｈ２Ｏ １.５ ｇ、蒸馏水 １ ０００
ｍＬ)１２１℃灭菌 ３０ ｍｉｎꎬ维生素 Ｂ１ 配成 １００ ｍｇ /
ｍＬ的母液ꎬ用一次性针头式过滤器(Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＳＬ￣
ＨＰ０３ＲＢꎬ０.４５ μｍ)过滤除菌后按比例添加ꎮ
１.１.３　 分子生物学鉴定试剂 　 基因组提取试剂
盒、Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ、ＰＣＲ 产物回收试剂盒购自宝生物
工程(大连)有限公司ꎬ引物由生工生物工程(上
海)股份有限公司合成ꎬＰＣＲ 产物由武汉华大基因
科技有限公司测序ꎮ
１.２　 生防菌株的分离和纯化
　 　 ２０１０年 ５月ꎬ在山东省枣庄市峄城区“冠世榴
园” (东经 １１７°３２′９２５″ꎬ北纬 ３４°４６′０８６″ꎬ海拔 ９１
ｍ)采集石榴根际土壤ꎬ按以下程序进行生防菌株
的分离与纯化:称取土壤 １０ ｇꎬ放入 ９０ ｍＬ 有玻璃
珠的无菌水三角瓶中ꎬ制成 １０－１土壤悬浮液后在摇
床上 １２０ ｒ / ｍｉｎ 摇荡 ２０ ｍｉｎꎬ然后梯度稀释成
１０－２、１０－３、１０－４、１０－５及 １０－６浓度ꎬ并从 １０－４、１０－５与
１０－６浓度中各吸取 ０.２ ｍＬ 土壤悬浮液涂布 ＮＡ 平
板ꎬ每处理 ３ 个重复ꎬ在 ３７℃下倒置培养ꎬ２４ ｈ 后
观察ꎬ如有单菌落ꎬ通过平板划线法进行纯化ꎬ并将
纯化后的分离物挑到 ＮＡ 斜面上ꎬ培养 ２４ ｈ 后于
４℃冰箱中保存备用[１１]ꎮ
１.３　 菌株 Ｚ２的抑菌活性测定
　 　 采用平板对峙法对分离到的菌株 Ｚ２ 进行抑
菌活性测定ꎮ 将石榴干腐病菌菌株 Ｚｙ０６ 在 ＰＤＡ
平板上 ２８℃培养至长满整个平板ꎬ用直径 ５ ｍｍ打
孔器在平板上打取菌饼ꎬ取一块菌饼反贴于 ＰＤＡ
平板中央ꎬ在离菌饼约 ２ ｃｍ两侧ꎬ用接种环挑取少
量培养 ２４ ｈ 的菌株 Ｚ２ 各划 １ 条约 ３ ｃｍ 的细线ꎬ
以只接病原菌为对照ꎬ每处理 ３个重复ꎬ２８℃培养ꎬ
待对照病原菌长满整个平皿时ꎬ观察试验结果ꎮ 菌
落生长抑制率按公式计算[１２ꎬ１３]ꎮ
６２４
　
　 ４期 马耀华ꎬ等:石榴干腐病生防菌株 Ｚ２的鉴定及其培养条件的优化
菌落生长抑制率(％)＝
对照菌落生长距离－处理菌落净生长距离
对照菌落净生长距离
× １００％
　 　 除石榴干腐病菌外还用相同方法测定了菌株
Ｚ２对其他 １７种植物病原真菌的抑菌活性ꎮ 这 １７
种供试植物病原真菌为:石榴褐斑病菌(Ｃｅｒｃｏｓｐｏ￣
ｒａ ｐｕｎｉｃａｅ)、石榴枯萎病菌 (Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ ｆｉｍｂｒｉａ￣
ｔａ)、芝麻白绢病菌(Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉ)、芝麻枯萎病
菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ)、苹果霉心病菌(Ｔｒｉｃｈｏｔｈ￣
ｅｃｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ)、苹果轮纹病菌(Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｂｅ￣
ｒｅｎｇｅｒｉａｎａ)、香蕉叶斑病菌(Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ ｒｏｓｔｒａｔｕｍ
和 Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｍｕｓａｅ)、山茱萸叶斑病菌(Ａｌ￣
ｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ、 Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ｆｏｅｄａｎｓ 和 Ｐｅｙ￣
ｒｏｎｅｌｌａｅａ ｇｌｏｍｅｒａｔａ)、大叶黄杨炭疽病菌 Ｃｏｌｌｅｔｏ￣
ｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ(菌株 ＺＺＳ４４４７和 ＺＺＳ４４４９)、
甘蔗凤梨病菌(Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｐａｒａｄｏｘａ)和玉米穗腐病
菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｅｑｕｉｓｅｔｉ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌ￣
ｌａ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ和 Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ)ꎮ
１.４　 生防菌株 Ｚ２的鉴定
１.４.１　 菌株 Ｚ２的 Ｂｉｏｌｏｇ检测、形态学特征和生理
生化特性鉴定　 Ｂｉｏｌｏｇ 检测在中国农业大学农学
与生物技术学院植物病理学系进行ꎮ 菌株 Ｚ２ 菌
体形态采用扫描电镜(Ｈｉｔａｃｈｉ ＴＭ￣１０００)观察并拍
照ꎮ 其它形态学和生理生化指标参考文献[１４]和
[１５]ꎬ按常规细菌学方法对菌株 Ｚ２进行测定ꎮ
１.４.２　 １６Ｓ ｒＤＮＡ、ｇｙｒＡ 基因序列分析及特定基因
的选择性 ＰＣＲ扩增
　 　 (１) １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列的 ＰＣＲ 扩增　 用稀释涂
布法将菌株 Ｚ２ 接种在 ＮＡ 平板上ꎬ ３０℃培养 ２４
ｈꎬ挑取单一菌落溶于 １０ μＬ １％ ＳＤＳ溶液中裂解ꎬ
漩涡振荡仪上充分摇匀ꎬ再加入 ３００ μＬ ＴＥ(Ｔｒｉｓ￣
ＨＣｌ)溶解即为 ＤＮＡ 原液ꎬ将原液稀释 １０ 倍作为
ＰＣＲ 扩 增 模 板ꎬ 采 用 通 用 引 物 ｐｒｉｍｅｒ Ｆ２７
(５′￣ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧ￣３′) 和 ｐｒｉｍｅｒ
Ｒ１４９２ ( ５′￣ＴＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ￣ ３′)
进行单菌落直接 ＰＣＲ扩增ꎮ ５０ μＬ ＰＣＲ反应体系
包括:Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ １０×ｂｕｆｆｅｒ ２５ μＬ、ｐｒｉｍｅｒ Ｆ２７ 与
ｐｒｉｍｅｒ Ｒ１４９２ 各 １ μＬ、 ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ １ μＬ 和
ｄｄＨ２Ｏ ２２ μＬꎮ ＰＣＲ反应条件:９４℃１ ｍｉｎꎬ３０ 个扩
增循环(９４℃ ４５ ｓ→５４℃ ４５ ｓ→７２℃ １.５ ｍｉｎ)ꎬ
７２℃ ５ ｍｉｎꎮ 反应结束后ꎬ取 ５ μＬ 反应液用 １％ 琼
脂糖凝胶电泳检测[１１~１３]ꎮ
　 　 (２) ｇｙｒＡ 基因序列的 ＰＣＲ 扩增 　 引物为
ｐｒｉｍｅｒ ｇｙｒＡ￣ｆ ( ５′￣ＣＡＧＴＣＡＧＧＡＡＡＴＧＣＧＴＡＣＧＴ￣
ＣＣＴＴ￣３′) 和 ｐｒｉｍｅｒ ｇｙｒＡ￣ｒ ( ５′￣ＣＡＡＧＧＴＡＡＴ￣
ＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＴＴＧＣＴ￣３′)ꎮ ＰＣＲ 反应条件:９５℃
预热 ５ ｍｉｎꎬ９４℃变性 １ ｍｉｎꎬ６２℃退火 １ ｍｉｎꎬ７２℃
延伸 ２ ｍｉｎꎬ３０个循环ꎬ７２℃延伸 １０ ｍｉｎ[１６ꎬ１７]ꎮ
　 　 上述 ２ 种 ＰＣＲ 产物均用试剂盒纯化测序后ꎬ
应用 ＢＬＡＳＴ 程序进行同源性比较ꎬ使用 ＧｅｎＢａｎｋ
中的 Ｂａｎｋｌｔ 软件提交序列ꎮ 采用 Ｍｅｇａ５. １ 中的
Ｋｉｍｕｒａ￣２￣Ｐａｒａｍｅｔｅｒ 模型ꎬ邻接法(ＮＪ)构建系统发
育树( ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ＝ １０００ꎬｂｏｏｔｓｔｒａｐ值取百分比)ꎮ
　 　 (３)特定基因的选择性 ＰＣＲ 扩增　 采用试剂
盒提取枯草芽胞杆菌菌株 ＮＳ０３ 与待测菌株 Ｚ２ 的
ＤＮＡ作为模板ꎬ分别用 ２ 对引物 ＹｙａＯ￣Ｆ / ＴｅｔＢ￣Ｒ
和 ＹｙａＲ￣ＦＬ / ＴｅｔＢ￣Ｒ进行 ＰＣＲ 扩增ꎮ 引物序列为
ＹｙａＯ￣Ｆ: ５′￣ＧＧＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＡＧＧＧＴＴＧＴＧＧ￣３′ꎻ
ＹｙａＲ￣ＦＬ: ５′￣ＡＡＧＧＡＧＡＡＴＣＡＴＴＴＡＴＧＣＧＧＴＣ￣３′ꎻ
ＴｅｔＢ￣Ｒ: ５′￣ＣＣＡＴＡＴＡＧＡＧＣＴＧＴＴＣＣＡＡＴＧＧＡＧＡ￣
ＡＧ￣３′[１８ꎬ１９]ꎮ ＰＣＲ 反应条件:９４℃ 预变性 ３ ｍｉｎꎬ９４℃
变性 ３０ ｓꎬ５５℃退火 ３０ ｓꎬ７２℃延伸 ４０ ｓꎬ３０个循环ꎻ再
７２℃延伸 ８ ｍｉｎꎬ４℃ 降温 ５ ｍｉｎꎮ 反应结束后ꎬ取 ５
μＬ 反应液用 １％ 琼脂糖凝胶电泳检测ꎮ
１.５　 培养条件对生防菌株 Ｚ２ 生物量及其抑制石
榴干腐病菌活性的影响
１.５.１　 温度　 采用抑菌圈法测定生防菌株 Ｚ２在不
同温度下的抑菌活性ꎬ将菌株 Ｚ２接种于 １０ ｍＬ ＮＢ
培养基中ꎬ然后每隔 ３℃一个梯度ꎬ分别置于 ４℃ ~
４８℃培养 ４８ ｈꎮ 将石榴干腐病菌菌株 Ｚｙ０６接种于
ＰＤＡ平板上ꎬ２８℃培养至分生孢子产生ꎬ配成约 １×
１０８个 / ｍＬ的孢子悬浮液备用ꎮ 测定时先倒一薄层
水琼脂于培养皿内ꎬ冷却后ꎬ中间放一牛津杯ꎬ将融
化的 １００ ｍＬ ＰＤＡ 培养基冷却到 ５０℃左右ꎬ加入 １
ｍＬ干腐病菌孢子悬浮液ꎬ混匀后倒入培养皿中ꎬ每
皿约 ２０ ｍＬꎬ冷却后ꎬ取出牛津杯ꎬ孔中注入 ０.１ ｍＬ
待测菌株 Ｚ２的发酵液ꎬ以 ＮＢ 培养基为空白对照ꎬ
每处理 ３个重复ꎬ于 ２８℃培养ꎬ待对照病原菌长满培
养皿时ꎬ采用十字交叉法测量抑菌圈直径ꎬ余下的菌
株 Ｚ２发酵液ꎬ在波长 ６２５ ｎｍ处测其 ＯＤ值[１２ꎬ１３]ꎮ
１.５.２　 ｐＨ值　 用 ｐＨ 计将 ＮＢ 液体培养基 ｐＨ 分
别调至 ３、４、５、６、７、８、９、１０、１１ 和 １２ꎬ分别接入菌
７２４
　
植物病理学报 ４５卷
株 Ｚ２ꎬ３７℃摇床(１２０ ｒ / ｍｉｎ)培养 ４８ ｈꎬ用 １.５.１ 方
法测其生物量和抑菌活性ꎮ
１.５.３　 培养基　 将菌株 Ｚ２分别接种于 ＮＢ、ＬＢ、玉
米粉蔗糖、豆芽汁葡萄糖、ＰＤＢ 和淀粉 ６ 种液体培
养基中ꎬ３７℃ 发酵 ４８ ｈ 后ꎮ 用 １.５.１ 方法测其生
物量和抑菌活性ꎮ
１.５.４　 培养时间 　 将菌株 Ｚ２ 接种于 ＮＢ 培养基
中ꎬ３７℃ 分别发酵 １、２、３、４、５、６、７、８和 ９ ｄ后ꎮ 用
１.５.１方法测其生物量和抑菌活性ꎮ
１.５.５　 培养条件优化 　 根据单因素试验结果ꎬ选
择温度(Ａ)、 ｐＨ(Ｂ)、培养基种类(Ｃ)和培养时间
(Ｄ)４个因素中较好的水平各取 ３个ꎬ选用 Ｌ９(３４)
正交试验ꎬ优化菌株 Ｚ２的培养条件ꎮ
１.６　 室内离体防治试验
　 　 将生防菌株 Ｚ２ 于上述优化后的培养条件进
行培养ꎬ配成浓度约为 １×１０８ＣＦＵ / ｍＬ 的菌体悬浮
液ꎮ 将石榴干腐病菌菌株 Ｚｙ０６ 接种于 ＰＤＡ 平板
上ꎬ２８℃培养至分生孢子产生ꎬ配成约 １×１０８个 /
ｍＬ的孢子悬浮液备用ꎮ 取健康新鲜未成熟的果
实(品种:大青皮)ꎬ用清水洗干净ꎬ无菌水冲洗 ３
次ꎬ置灭菌托盘ꎬ内铺 ４ 层灭菌纱布ꎮ 设 ３ 个接种
处理:处理 １为接种石榴干腐病菌 １ ｄ 后再接生防
菌ꎻ处理 ２ 为接种生防菌 １ ｄ 后再接石榴干腐病
菌ꎻ处理 ３为同时接种石榴干腐病菌和生防菌ꎮ 以
只接石榴干腐病菌为对照ꎬ每处理 ５ 个重复ꎬ每重
复 ６个果实ꎬ贴好标签ꎬ针刺后按相应的处理用喷
雾法接种生防菌菌体悬浮液和病原菌孢子悬浮液ꎬ
每个果实接种量约 ２ ｍＬꎬ接种完后用无菌水浸湿
纱布ꎬ覆盖保鲜膜保湿ꎬ２８℃培养观察ꎬ待对照发病
后第 １４ ｄ调查发病情况ꎬ采用十字相交法测量病
斑直径ꎬ计算病斑抑制率ꎮ
　 　 病斑抑制率(％)＝
　 　 对照病斑总面积￣处理病斑总面积
对照病斑总面积
×１００％
１.７　 数据分析
　 　 采用 Ｅｘｃｅｌ ２００３ 和 ＳＰＳＳ 统计软件( ｖｅｒｓｉｏｎ
１９.０ꎬ ＩＢＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎꎬ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋꎬ ＵＳＡ)对相关
数据进行方差分析ꎮ
２　 结果
２.１　 生防菌株 Ｚ２的抑菌活性
　 　 生防菌株 Ｚ２ 对包括石榴干腐病菌在内的多
种植物病原真菌均有不同程度的抑菌活性ꎬ病原真
菌的菌落生长抑制率为 １７.９７％ ~ ６９.２８％(表 １)ꎮ
在供试的 １８种植物病原真菌中ꎬ以石榴干腐病菌
(Ｚ. ｖｅｒｓｏｎｉａｎａ)对该生防菌株最为敏感ꎬ其菌落生
长抑制率最高(６９.２８％)ꎬ在 ０.０１％水平上极显著
高于其他 １７种供试植物病原真菌(表 １)ꎮ 与菌株
Ｚ２对峙培养的石榴干腐病菌菌株 Ｚｙ０６ 产生大量
深褐色的分生孢子(图 １)ꎮ
Ｔａｂｌｅ １　 Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｅｓ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２ ａｇａｉｎｓｔ ｆｕｎｇａｌ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｓ
Ｆｕｎｇａｌ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ / ％ Ｆｕｎｇａｌ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ / ％
Ｚｙｔｈｉａ ｖｅｒｓｏｎｉａｎａ ６９.２８ ａ Ａ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｅｑｕｉｓｅｔｉ ２４.９０ ｄｅｆｇｈ ＣＤＥＦＧ
Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ ４２.３２ ｂ Ｂ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ２３.８１ ｄｅｆｇｈｉ ＤＥＦＧＨ
Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ ３１.０４ ｃ Ｃ Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｂｅｒｅｎｇｅｒｉａｎａ ２２.７８ ｅｆｇｈｉｊ ＥＦＧＨ
Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｐｕｎｉｃａｅ ２２.５２ ｅｆｇｈｉｊ ＥＦＧＨ
ｓｔｒａｉｎ ＺＺＳ４４４７ ３０.４０ ｃ ＣＤ Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ ｒｏｓｔｒａｔｕｍ ２１.６０ ｅｆｇｈｉｊ ＦＧＨ
ｓｔｒａｉｎ ＺＺＳ４４４９ ２６.０５ ｃｄｅｆ ＣＤＥＦＧ Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｍｕｓａｅ ２１.４０ ｆｇｈｉｊ ＦＧＨ
Ｐｅｙｒｏｎｅｌｌａｅａ ｇｌｏｍｅｒａｔａ ２８.８７ ｃｄ ＣＤＥ Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ ２０.７９ ｇｈｉｊ ＦＧＨ
Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ｆｏｅｄａｎｓ ２８.６８ ｃｄ ＣＤＥ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ １９.８６ ｈｉｊ ＦＧＨ
Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ ｆｉｍｂｒｉａｔａ ２６.５４ ｃｄｅ ＣＤＥＦ Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ ｒｏｌｆｓｉｉ １９.６３ ｉｊ ＧＨ
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ ２５.１４ ｄｅｆｇ ＣＤＥＦＧ Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｐａｒａｄｏｘａ １７.９７ ｊ Ｈ
　 Ｖａｌｕｅｓ ａｒｅ ｔｈｅ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ. Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ ｓｈａｒｉｎｇ ｓａｍｅ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ(ｓ) ａｎｄ ｃａｐｉｔａｌ(ｓ) ｗｉｔｈ ｅａｃｈ ｏｔｈｅｒ ａｒｅ ｎｏｔ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｔ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｐ＝ ０.０５ ａｎｄ Ｐ＝ ０.０１ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
８２４
　
　 ４期 马耀华ꎬ等:石榴干腐病生防菌株 Ｚ２的鉴定及其培养条件的优化
Ｆｉｇ. １　 Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ
ｓｔｒａｉｎ Ｚ２ ａｇａｉｎｓｔ Ｚｙｔｈｉａ ｖｅｒｓｏｎｉａｎａ
ｃａｕｓｉｎｇ ｄｒｙ ｒｏｔ ｏｆ ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ ｆｒｕｉｔ
Ａ: ＣＫ ｃｏｌｏｎｙ ｏｆ Ｚ. ｖｅｒｓｏｎｉａｎａꎻ　 Ｂ: Ａ ｃｏｌｏｎｙ ｏｆ Ｚ. ｖｅｒｓｏ￣
ｎｉａｎａ (ｍｉｄｄｌｅ) ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２ ( ｒｉｇｈｔ ａｎｄ ｌｅｆｔ) .
２.２　 生防菌株 Ｚ２的鉴定
２.２.１　 形态学特征 　 生防菌株 Ｚ２ 在 ＮＡ 上培养
４８ ｈꎬ其单菌落圆形或近圆形ꎬ平均直径 １.２ ｃｍꎬ米
白色ꎬ扁平ꎬ表面干燥ꎬ有皱褶并形成同心圆ꎬ边缘
波状ꎬ不透明(图 ２￣Ａ)ꎮ 革兰氏阳性ꎬ电子显微镜
下观察ꎬ细胞呈杆状ꎬ两端钝圆ꎬ周生鞭毛ꎬ菌体大
小 ０.７９ μｍ×１.６７ μｍꎬ链状排列(图 ２￣Ｂ)ꎬ芽胞近
端生ꎬ椭圆形ꎬ胞囊不膨大ꎬ无伴胞晶体ꎮ
Ｆｉｇ. ２ 　 Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２
Ａ: Ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２ꎻ Ｂ: Ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ
ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２(ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝ ２ μｍ) .
２.２.２　 生理生化特性　 对生防菌株 Ｚ２ 进行生理
生化测定结果(表 ２)表明ꎬ显示阳性反应的测试项
目有:接触酶、Ｖｏｇｅｓ￣Ｐｒｏｓｋａｕｅｒ、明胶液化、柠檬酸
盐、淀粉水解、硝酸盐还原、葡萄糖发酵、酪素水解
和棉子糖发酵ꎮ 阴性反应的测试项目有:Ｄ￣木糖
发酵、甘露醇发酵、乳糖发酵和山梨糖发酵ꎮ 该生
防菌株在 ２０℃ ~ ４０℃能生长ꎬ６０℃下不生长ꎬ能在
７％以下的 ＮａＣｌ 和 ｐＨ ５. ８ 的 ＮＢ 液体培养基中
生长ꎮ
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２
Ｉｔｅｍ ｔｅｓｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｉｔｅｍ ｔｅｓｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ
Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｇｒｏｗｔｈ － Ｍａｌｔｏｓｅ ＋
Ｃａｔａｌａｓｅ ＋ Ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｌ￣ａｒａｂｉｎｏｓｅ ＋
Ｖｏｇｅｓ￣Ｐｒｏｓｋａｕｅｒ ＋ Ｓｏｒｂｏｓｅ －
Ｇｅｌａｔｉｎ ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ ＋ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ ａｔ ｐＨ ５.８ ＋
Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ＋ Ｇｒｏｗｔｈ ａｔ
Ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ ｓｔａｒｃｈ ＋ ５ ℃ －
Ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ＋ ２０ ℃ ＋
Ｃａｓｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ＋ ４０ ℃ ＋
Ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ６０ ℃ －
Ｄ￣ｍａｎｎｉｔｏｌ － Ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ
Ｄ￣ｇｌｕｃｏｓｅ∗ － ２ ％ ＮａＣｌ ＋
Ｄ￣ｘｙｌｏｓｅ － ５ ％ ＮａＣｌ ＋
α￣ｌａｃｔｏｓｅ － ７ ％ ＮａＣｌ ＋
Ｒａｆｆｉｎｏｓｅ ＋ １０ ％ ＮａＣｌ －
　 “＋” ａｎｄ “－” ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｉｎ ｇｒｏｗｔｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔꎬ “＋” ａｎｄ “－” ｒｅｐｒｅ￣
ｓｅｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｎｏ ｇｒｏｗｔｈꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. “∗”: Ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｇａｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ.
９２４
　
植物病理学报 ４５卷
２.２.３　 Ｂｉｏｌｏｇ系统鉴定　 Ｂｉｏｌｏｇ 系统鉴定结果表
明ꎬ与菌株 Ｚ２ 亲缘关系最近的为枯草芽胞杆菌
(Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ)ꎬ但与枯草芽胞杆菌的相似性指数较
小仅为 ０.５８９ꎮ
２.２.４　 菌株 Ｚ２的 １６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析　 用 ｐｒｉｍｅｒ
Ｆ２７和 ｐｒｉｍｅｒ Ｒ１４９２ 进行单菌落直接 ＰＣＲ 扩增ꎬ
得到了菌株 Ｚ２ 约 １.４ ｋｂ 的 ＤＮＡ 片段ꎬ通过凝胶
回收纯化后直接测序ꎬ共测得菌株 Ｚ２ 的 １６Ｓ ｒＤ￣
ＮＡ 序 列 １ ３９８ 个 碱 基 ( ＧｅｎＢａｎｋ 登 录 号:
ＪＱ９９６４１４)ꎮ 采用 ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｌｈ. ｇｏｖ 网站中
的 ＢＬＡＳＴ 程序进行比较分析ꎬ发现菌株 Ｚ２ 与解
淀粉芽胞杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ)、莫海威
芽胞杆菌 (Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ)和枯草芽胞杆菌
(Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ)均有 ９９％的同源性ꎮ 从构建的基于
１６Ｓ ｒＤＮＡ序列的系统发育树中可以看出菌株 Ｚ２
和 Ｂ. ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ( ＡＢ１９９３１７、 ＧＵ０８５１００、
ＫＣ２５０２２０、ＮＲ＿０７５００５)及 Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ(ＡＭ５０１５４９、
ＦＪ５９８００９)聚为一族(图 ３)ꎮ
Ｆｉｇ. ３　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ＧｅｎＢａｎｋ ｄａｔａｂａｓｅ
Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｎ ｂｒａｎｃｈｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｖａｌｕｅｓ. Ｔｈｅ ｔｒｅｅ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ Ｋｉｍｕｒａ￣２￣Ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｍｏｄｅｌ ａｎｄ Ｎ￣Ｊ ｍｅｔｈｏｄ
ｗｉｔｈ ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｖａｌｕｅｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ １０００ ｒｅｓａｍｐｌｉｎｇ. Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ａｔ ｅａｃｈ ｎｏｄｅ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ
ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｂｏｏｔｓｔｒａｐ(ｖａｌｕｅｓ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ５０％ ａｒｅ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ) .Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｉｎ ｐａｒｅｎｔｈｅｓｅｓ ａｒｅ ｔｈｅ
ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ.Ｔｈｅ ｓｃａｌｅ ｂａｒｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ０.０５ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｐｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ.
０３４
　
　 ４期 马耀华ꎬ等:石榴干腐病生防菌株 Ｚ２的鉴定及其培养条件的优化
　 　 用 ｐｒｉｍｅｒ ｇｙｒＡ￣ｆ 和 ｐｒｉｍｅｒ ｇｙｒＡ￣ｒ 进行 ＰＣＲ 扩
增ꎬ通过测序获得了菌株 Ｚ２ 的 ｇｙｒＡ 基因序列
１ ０２５个 碱 基 ( ＧｅｎＢａｎｋ 登 录 号: ＫＪ８３３５８８ )ꎮ
ＢＬＡＳＴ分析结果表明ꎬ菌株 Ｚ２ 与 ２ 株解淀粉芽胞
杆菌 Ｂ. ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ (ＡＢ６７４７５１和 ＦＮ６６２８３７)
的相似性达 １００％ꎮ 在构建的基于 ｇｙｒＡ基因序列的
系统树中ꎬ菌株 Ｚ２与随机选定的 ７株解淀粉芽胞杆
菌 Ｂ. ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ( ＡＢ６７４７５１、 ＦＮ６６２８３７、
ＪＸ５１３９４３、 ＫＣ０１１３４４、 ＫＣ３１１７２６、 ＫＣ７９７５８４、
ＫＦ６０１５５２)以 １００％自举值相聚一群(图 ４)ꎬ并能与
相近种枯草芽胞杆菌 Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ ( ＤＱ００１１３１、
ＪＸ９７７１２７、 ＪＸ９７７１２８、 ＪＸ９７７１２９、 ＪＸ９７７１３０、
ＪＸ９７７１３１) 和 莫 海 威 芽 胞 杆 菌 Ｂ. ｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ
(ＥＵ１３８６４４、ＦＪ５４６３２７、ＦＪ５４６３３１)等区分开ꎮ 同时ꎬ
通过 ｇｙｒＡ基因的系统发育分析ꎬ还可以得到比较详
细的种内个体分化信息ꎬ７株 Ｂ. ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ被
分为 ２个大的亚群ꎬ揭示了亚种 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ￣
ｆａｃｉｅｎｓ ｓｕｂｓｐ. ｐｌａｎｔａｒｕｍ 以及 Ｂ. ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ
不同菌株间的亲缘关系ꎮ
２.２.５　 菌株 Ｚ２ 与枯草芽胞杆菌特定基因的选择
性扩增　 在 Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ中ꎬ基因 ｙｙａＲ位于转运蛋白
基因 ｔｅｔＢ￣ｔｅｔＬ的下游 ２ ００３ ｂｐ 处ꎬ基因 ｙｙａＯ 位于
ｔｅｔＢ (Ｌ)的上游并与之相邻ꎻ而在 Ｂ. ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａ￣
ｃｉｅｎｓ中ꎬｔｅｔＢ￣ｔｅｔＬ的上游基因是 ｙｙａＲꎮ 据此设计 ２
对引物 ＹｙａＯ￣Ｆ / ＴｅｔＢ￣Ｒ 和 ＹｙａＲ￣ＦＬ / ＴｅｔＢ￣Ｒ 用于
ＰＣＲ 扩增ꎬ其中正向引物 ＹｙａＯ￣Ｆ和 ＹｙａＲ￣ＦＬ分别
源自 ２ 个基因( ｙｙａＯ、ｙｙａＲ)的 ３′末端ꎬ反向引物
ＴｅｔＢ￣Ｒ源自基因 ｔｅｔＢ的 ５′末端[１８ꎬ１９]ꎮ 分别用上述
２ 对引物对待测菌株 Ｚ２和 Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株 ＮＳ０３进
行 ＰＣＲ扩增ꎬ结果表明当以 ＹｙａＯ￣Ｆ / ＴｅｔＢ￣Ｒ 作为
引物时ꎬＢ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株 ＮＳ０３ 有目标扩增产物ꎬ而
菌株 Ｚ２ 无目标扩增产物ꎻ以 ＹｙａＲ￣ＦＬ / ＴｅｔＢ￣Ｒ 作
为引物时ꎬＢ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ 菌株 ＮＳ０３ 无目标扩增产物ꎬ
而菌株 Ｚ２有目标扩增产物(图 ５)ꎬ因此可确定菌
株 Ｚ２ 属于解淀粉芽胞杆菌 ( Ｂ. ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａ￣
ｃｉｅｎｓ)ꎮ
Ｆｉｇ. ４　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｙｒＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ
ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ＧｅｎＢａｎｋ ｄａｔａｂａｓｅ
Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｎ ｂｒａｎｃｈｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｖａｌｕｅｓ. Ｔｈｅ ｔｒｅｅ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ Ｋｉｍｕｒａ￣２￣Ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｍｏｄｅｌ ａｎｄ Ｎ￣Ｊ ｍｅｔｈｏｄ
ｗｉｔｈ ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｖａｌｕｅｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ １０００ ｒｅｓａｍｐｌｉｎｇ. Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ａｔ ｅａｃｈ ｎｏｄｅ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈｅ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ
ｂｏｏｔｓｔｒａｐ (ｖａｌｕｅｓ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ５０％ ａｒｅ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ) .Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｉｎ ｐａｒｅｎｔｈｅｓｅｓ ａｒｅ ｔｈｅ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ
ｒｅｌａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ.Ｔｈｅ ｓｃａｌｅ ｂａｒｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ０.０５ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｐｅｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ.
１３４
　
植物病理学报 ４５卷
Ｆｉｇ. ５ 　 Ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏ￣
ｄｕｃｔｓ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２ ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ＹｙａＲ￣ＦＬ / ＴｅｔＢ￣Ｒ ａｎｄ
ＹｙａＯ￣Ｆ / ＴｅｔＢ￣Ｒ
Ｍ: Ｍａｒｋｅｒ Ш ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒꎻＬａｎｅ １ ａｎｄ Ｌａｎｅ ３: Ｓｔｒａｉｎ Ｚ２ꎻＬａｎｅ
２ ａｎｄ Ｌａｎｅ ４: Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｔｒａｉｎ ＮＳ０３. Ｌａｎｅ １ ａｎｄ Ｌａｎｅ ２: Ａｍ￣
ｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒ ｏｆ ＹｙａＲ￣ＦＬ ａｎｄ ＴｅｔＢ￣Ｒꎻ Ｌａｎｅ ３ ａｎｄ
Ｌａｎｅ ４: Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒ ｏｆ ＹｙａＯ￣Ｆ ａｎｄ ＴｅｔＢ￣Ｒ.
　 　 综合上述试验结果ꎬ查阅相关资料[１４ꎬ１５ꎬ１９~２４]ꎬ
根据 １６Ｓ ｒＤＮＡ、ｇｙｒＡ基因序列分析及特定基因的
选择性 ＰＣＲ扩增结果ꎬ结合菌株的形态学特征、生
理生化反应特性和 Ｂｉｏｌｏｇ测定结果ꎬ将菌株 Ｚ２ 鉴
定为解淀粉芽胞杆菌(Ｂ. ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ)ꎮ
２.３　 菌株 Ｚ２培养条件的优化
２.３.１　 不同温度和 ｐＨ对菌株 Ｚ２生物量和抑菌活
性的影响 　 研究结果表明温度对菌株 Ｚ２ 的抑菌
活性有显著影响ꎬ在 ４℃ ~３０℃之间ꎬ其抑菌圈直径
随着温度的增高呈现增大的趋势ꎬ在 ２４℃ ~ ３０ ℃
之间抑菌效果最好ꎬ抑菌圈直径为 ４.０５ ｃｍ ~ ４.１７
ｃｍꎬ在 ３０℃ ~ ３９℃之间随着温度的增加抑菌圈直
径逐渐减小ꎬ后期基本保持稳定ꎮ 从反应菌体生物
量的 ＯＤ值测定结果可以看出ꎬ菌株 Ｚ２ 有较广的
温度生长范围ꎬ在 ７℃ ~４８℃间均能生长ꎬ最适生长
温度为 ３０℃ꎮ 在适宜的生长温度范围内ꎬＯＤ值大
小和抑菌圈直径大小的变化趋势基本一致ꎬ可以认
为菌株 Ｚ２ 的菌体生物量与其抑菌活性呈正相关
(图 ６)ꎮ ｐＨ对菌株 Ｚ２ 的抑菌活性和生物量有显
著的影响ꎬ抑菌圈直径和 ＯＤ值的变化趋势基本一
致ꎬ当 ｐＨ为 ７ 时菌体生物量和抑菌活性达到最
大ꎬｐＨ为 ４~１１时该菌株均能生长(图 ７)ꎮ
Ｆｉｇ. ６　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ
ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２
Ｆｉｇ. ７　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐＨ ｏｎ ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ａｎｔｉｆｕｎ￣
ｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２
２.３.２　 不同培养时间对菌株 Ｚ２ 生物量和抑菌活
性的影响 　 培养时间对菌株 Ｚ２ 的抑菌活性和生
物量有一定影响ꎬ培养到第 ３ ｄ 时抑菌活性和菌体
生物量均达到最大ꎬ随后随着时间的推移ꎬ菌体生
物量变化不大ꎬ但抑菌活性逐渐下降(图 ８)ꎮ 菌株
Ｚ２的最佳培养时间为 ３~５ ｄꎮ
Ｆｉｇ. ８　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｂｉｏｍａｓｓ
ａｎｄ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２
２.３.３　 不同培养基对菌株 Ｚ２生物量和抑菌活性的
影响　 测定结果显示ꎬ供试 ６种培养基对菌株 Ｚ２的
抑菌活性有极显著影响ꎬ其中在 ＬＢ、ＰＤＢ 及 ＮＢ 培
养基中菌株 Ｚ２生物量和抑菌活性最大ꎬ且三者间的
２３４
　
　 ４期 马耀华ꎬ等:石榴干腐病生防菌株 Ｚ２的鉴定及其培养条件的优化
抑菌活性在 ０.０５和 ０.０１水平上差异不显著(表 ３)ꎮ
２.３.４　 菌株 Ｚ２ 培养条件的优化　 根据单因素试
验结果选取每个因素的 ３ 个水平制作出因素水平
表(表 ４)ꎬ采用 Ｌ９３４进行正交试验设计优化菌株
Ｚ２的培养条件(表 ５)ꎮ 正交试验方差分析结果表
明ꎬ４种主效应因素对菌株 Ｚ２ 的抑菌作用影响极
显著(表 ６)ꎮ 通过 ＬＳＤ 法多重比较表明ꎬＢ 因素
第 １水平和第 ３水平之间差异不显著ꎬ其余因素各
水平之间差异极显著(表 ７)ꎬ因此确定其最优水平
组合为 Ａ２Ｂ３Ｃ３Ｄ１ 或 Ａ２Ｂ１Ｃ３Ｄ１ꎮ 得到菌株 Ｚ２
的优化培养条件:发酵温度为 ２７ ℃ꎬｐＨ 为 ６ 或 ８ꎬ
培养基为 ＬＢꎬ培养时间为 ３ ｄꎮ
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｎ ｂｉｏｍａｓｓ (ＯＤ６２５ ｎｍ) ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ
ｄｉａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２ ａｇａｉｎｓｔ Ｚｙｔｈｉａ ｖｅｒｓｏｎｉａｎａ
Ｍｅｄｉｕｍ ＯＤ ｖａｌｕｅｓ(６２５ ｎｍ) Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ / ｃｍ
ＬＢ ２.９５７ ３ ４.５３ ａＡ
ＰＤＢ ２.５６７ ６ ４.３０ ａＡ
ＮＢ ２.７０３ ２ ４.２１ ａＡＢ
Ｓｐｒｏｕｔｓ ｊｕｉｃｅ ｓｕｃｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ ２.０８９ ９ ３.５７ ｂＢ
Ｓｔａｒｃｈ ｂｒｏｔｈ ２.０８５ ４ ３.５０ ｂＢ
Ｃｏｒｎ ｆｌｏｕｒ ｓｕｃｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ １.９８７ ６ ３.１７ ｂＢ
　 Ｖａｌｕｅｓ ａｒｅ ｔｈｅ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ. Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ ｄｉａｍｅｔｅｒｓ ｓｈａｒｉｎｇ ｓａｍｅ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ( ｓ) ａｎｄ ｃａｐｉｔａｌ( ｓ) ｗｉｔｈ ｅａｃｈ
ｏｔｈｅｒ ａｒｅ ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｔ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｐ＝ ０.０５ ａｎｄ Ｐ＝ ０.０１ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２
Ｌｅｖｅｌ
Ｆａｃｔｏｒｓ
Ａ Ｂ Ｃ Ｄ
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ / ℃ ｐＨ Ｍｅｄｉｕｍ Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ / ｄ
１ ２４ ６ ＰＤＢ ３
２ ２７ ７ ＮＢ ４
３ ３０ ８ ＬＢ ５
　
Ｔａｂｌｅ ５　 Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２
Ｔｒｉａｌ
Ｆａｃｔｏｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ / ｃｍ
Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｕｎｉｔ ｇｒｏｕｐⅠ Ｕｎｉｔ ｇｒｏｕｐⅡ Ｕｎｉｔ ｇｒｏｕｐⅢ Ａｖｅｒａｇｅ
１ １ １ １ １ ２.５０ ２.６０ ２.５５ ２.５５
２ １ ２ ２ ２ ２.５０ ２.５０ ２.６５ ２.５５
３ １ ３ ３ ３ ３.６５ ３.７０ ３.６０ ３.６５
４ ２ １ ２ ３ ４.００ ４.０５ ４.００ ４.０１
５ ２ ２ ３ １ ４.４０ ４.５５ ４.５０ ４.４８
６ ２ ３ １ ２ ２.６５ ２.７０ ２.８５ ２.７３
７ ３ １ ３ ２ ３.３０ ３.４５ ３.４０ ３.３８
８ ３ ２ １ ３ ２.４０ ２.４５ ２.３５ ２.４０
９ ３ ３ ２ １ ３.７５ ３.５５ ３.６５ ３.６５
Ｋ１ ８.７５ ９.９４ ７.６８ １０.６８
Ｋ２ １１.２２ ９.４３ １０.２１ ８.６６
Ｋ３ ９.４３ １０.０３ １１.５１ １０.０６
Ｘ１ ２.９２ ３.３１ ２.５６ ３.５６
Ｘ２ ３.７４ ３.１４ ３.４０ ２.８９
Ｘ３ ３.１４ ３.３４ ３.８４ ３.３５
　 Ｋ１ꎬ Ｋ２ ａｎｄ Ｋ３ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ ｓｕｍ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｅｓｔ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ａｓ ｖａｒｉｏｕｓ ｆａｃｔｏｒｓꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｘ１ꎬ Ｘ２ ａｎｄ Ｘ３ ａｒｅ
ｓｈｏｗｎ ａｓ ｔｈｅ ｍｅａｎｓ ｏｆ Ｋ１ꎬ Ｋ２ ａｎｄ Ｋ３ ｌｅｖｅｌｓꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
３３４
　
植物病理学报 ４５卷
Ｔａｂｌｅ ６　 Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｃｕｌｔｕｒａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２
Ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ＳＳ ｄｆ ＭＳ Ｆ Ｆ０.０５ Ｆ０.０１
Ａ ３.２９１ ２ １.６４６ ３０６.４３１∗∗ ３.５６８６ ６.０５３
Ｂ ０.２１１ ２ ０.１０６ １９.６７２∗∗
Ｃ ７.６０１ ２ ３.８００ ７０７.６５５∗∗
Ｄ ２.１３６ ２ １.０６８ １９８.８４５∗∗
Ｅｒｒｏｒ ０.０９７ １８ ０.００５
Ｔｏｔａｌ １３.３３６ ２６
Ｖａｌｕｅｓ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ “∗∗” ａｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｔ Ｐ＝ ０.０１.
Ｔａｂｌｅ ７　 Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｍｏｎｇ ｖａｒｉｏｕｓ
ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄ ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２ (ＬＳＤ)
Ｌｅｖｅｌ
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ ｄｉａｍｅｔｅｒ / ｃｍ
Ａ Ｂ Ｃ Ｄ
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ / ℃ ｐＨ Ｍｅｄｉｕｍ Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ / ｄ
１ ２.９２ ｃＣ ３.３１ ａＡ ２.５６ ｃＣ ３.５６ ａＡ
２ ３.７４ ａＡ ３.１４ ｂＢ ３.４０ ｂＢ ２.８９ ｃＣ
３ ３.１４ ｂＢ ３.３４ ａＡ ３.８４ ａＡ ３.３５ ｂＢ
Ｖａｌｕｅｓ ａｒｅ ｔｈｅ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ. Ｍｅａｎｓ ｉｎ ａ ｃｏｌｕｍｎ ｓｈａｒｉｎｇ ｓａｍｅ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ( ｓ) ａｎｄ ｃａｐｉｔａｌ( ｓ) ｗｉｔｈ ｅａｃｈ ｏｔｈｅｒ ａｒｅ ｎｏｔ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｔ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｐ＝ ０.０５ ａｎｄ Ｐ＝ ０.０１ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
Ｔａｂｌｅ ８　 Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ ｆｒｕｉｔ ｄｒｙ ｒｏｔ ｂｙ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｌｅｓｉｏｎｓ Ｔｏｔａｌ ｌｅｓｉｏｎ ａｒｅａ / ｍｍ２ Ｌｅｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ / ％
１ ２８ ８８２.６ ３１.２７ ｃＣ
２ ２４ ３８０.４ ７０.３８ ｂＢ
３ ２３ ２３２.６ ８１.８９ ａＡ
ＣＫ ３０ １ ２８４.２
　 Ｖａｌｕｅｓ ａｒｅ ｔｈｅ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ. Ｔｈｅ ｌｅｓｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ ｓｈａｒｉｎｇ ｓａｍｅ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ(ｓ) ａｎｄ ｃａｐｉｔａｌ(ｓ) ｗｉｔｈ ｅａｃｈ ｏｔｈｅｒ
ａｒｅ ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｔ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｐ＝ ０.０５ ａｎｄ Ｐ＝ ０.０１ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
２.４　 室内离体防治试验
　 　 生防菌株 Ｚ２ 的不同接种处理对石榴干腐病
的抑制作用有显著影响(表 ８、图 ９)ꎬ处理 １(先接
病原菌 １ ｄ 后接生防菌)的病斑抑制率最小为
３１.２７％ꎻ处理 ２(先接生防菌 １ ｄ后接病原菌)的病
斑抑制率居中为 ７０.３８ ％ꎻ处理 ３(同时接病原菌和
生防菌)的病斑抑制率最大达 ８１.８９％ꎮ 处理 ３ 的
病斑抑制率与处理 ２和处理 １ 相比在 ０.０１ 水平上
差异极显著ꎬ效果最好ꎬ因此可推断生防菌株 Ｚ２
对石榴干腐病菌的抑制主要是预防和治疗的作用ꎮ
３　 讨论
　 　 目前ꎬ石榴干腐病的防治主要采用以化学防治
为主导、农业防治为辅助的综合防治体系ꎮ 生物防
治技术因其与环境兼容性好而受到植物保护工作
者的重视ꎮ 获取更多的拮抗微生物资源是开展石
榴干腐病生物防治的重要基础ꎮ 作者从石榴根际
土壤中分离筛选得到了 １ 株对石榴干腐病有较强
抑制作用的生防菌株 Ｚ２ꎬ鉴定结果表明菌株 Ｚ２为
４３４
　
　 ４期 马耀华ꎬ等:石榴干腐病生防菌株 Ｚ２的鉴定及其培养条件的优化
Ｆｉｇ. ９　 Ｅｆｆｉｃａｃｉｅｓ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ ｆｒｕｉｔ ｄｒｙ ｒｏｔ
Ａ:ＣＫꎬＴｈｅ ｆｒｕｉｔ ｗｅｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｓｔｒａｉｎ Ｚｙ０６ ａｌｏｎｅꎻ
Ｂ:Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ １ꎬ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｆｒｕｉｔ ｏｎｅ ｄａｙ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｔｒａｉｎ Ｚｙ０６ꎻ
Ｃ:Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ２ꎬ ｓｔｒａｉｎ Ｚ２ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｆｒｕｉｔ ｏｎｅ ｄａｙ ｂｅｆｏｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｔｒａｉｎ Ｚｙ０６ꎻ
Ｄ:Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ３ꎬ ｂｏｔｈ ｓｔｒａｉｎｓ Ｚｙ０６ ａｎｄ Ｚ２ ｗｅｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｆｒｕｉｔ ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓｌｙ.
解淀粉芽胞杆菌(Ｂ. ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ)ꎮ 解淀粉
芽胞杆菌(Ｂ. ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ)和枯草芽胞杆菌
(Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ)的同源性极高ꎬ仅从表型特征很难区
分ꎬ虽然 １６Ｓ ｒＤＮＡ基因序列广泛应用于细菌鉴定
或构建细菌的系统进化关系ꎬ但在亲缘关系很近的
种间(如解淀粉芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌)ꎬ由于
序列间的相似度太高而不能有效地将它们区分开
来[１６]ꎮ 近年来研究者发现以编码蛋白的基因作为
系统发育鉴定标记可以弥补 １６Ｓ ｒＤＮＡ 基因的不
足ꎬ如 ｇｙｒＡ 基因、ｇｙｒＢ 基因、ｒｏｐＤ 基因等[１７]ꎮ 另
外ꎬ由于解淀粉芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌同源性极
高ꎬ因此它们含有很多相同或相似的基因ꎬ但这 ２
个菌种某些相同或相似基因的排列顺序不同ꎬ因而
可以利用这一差别通过同时鉴定多个基因来区分
这 ２个菌种[１９]ꎮ 本研究通过分析菌株 Ｚ２ 的 ｇｙｒＡ
基因序列(图 ４)和特定基因的选择性 ＰＣＲ 扩增
(图 ５)ꎬ结合 １６Ｓ ｒＤＮＡ(图 ３)和表型特征(表 ２)
及 Ｂｉｏｌｏｇ检测ꎬ准确地将菌株 Ｚ２ 鉴定为解淀粉芽
胞杆菌(Ｂ. ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ)ꎮ
　 　 解淀粉芽胞杆菌作为生防因子具有很大的应
用潜力ꎬ对多种植物病害都有抑制作用ꎮ Ｒａｍａｒ￣
ａｔｈｎａｍ等[２０]研究发现ꎬＢ. ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＤＦＥ１６
对加拿大油菜黑胫病有显著的抑制作用ꎬ且能诱导
植株产生系统抗性ꎮ Ａｌｖｉｎｄｉａ[２１]通过 Ｂ. ａｍｙｌｏｌｉｑ￣
ｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＤＧＡ１４和热水处理联合作用防治香蕉冠
腐病试验发现ꎬ该方法对病原菌菌丝有 ８２.６１％的
抑制率ꎬ可防止 ９０％ 的果实发生腐烂ꎮ Ｗａｎｇ
等[２２]从枯萎病重病田中的健康香蕉植株根围分离
得到了一株解淀粉芽胞杆菌Ｗ１９可显著降低香蕉
枯萎病的发生率ꎬ且该菌株和有机肥联合使用对香
蕉植株有促生作用ꎮ Ｈｕ 等[２３]从健康大豆根系内
分离出一株对香蕉枯萎病菌有强拮抗效果的内生
解淀粉芽胞杆菌 ＡＦ１１ꎬ盆栽试验防效达 ７１.５％ꎮ
Ｚｈａｎｇ等[２４]筛选到 １株对水稻细菌性条斑病具有
良好防效的解淀粉芽胞杆菌 Ｌｘ－１１ꎬ田间示范试验
防效在 ６０％以上ꎬ显著高于噻枯唑类杀菌剂ꎬ并对
其抗菌成分进行了研究ꎮ 目前解淀粉芽胞杆菌在
植物病害生物防治中的利用多局限在草本植物或
一年生植物上ꎬ在多年生木本植物上的利用鲜有报
道ꎮ 本文从石榴根际土壤中分离筛选到的解淀粉
芽胞杆菌 Ｚ２ 对石榴干腐病菌有较强的抑菌活性
(图 １)ꎬ对所测试的 １８ 种植物病原真菌都有不同
程度的抑制活性(表 １)ꎬ对采后石榴果实干腐病也
有显著的抑制效果(表 ８)ꎬ因此ꎬ菌株 Ｚ２在石榴干
５３４
　
植物病理学报 ４５卷
腐病等植物真菌性病害的防治上具有潜在的应用
前景ꎮ 本研究结果进一步拓宽了解淀粉芽胞杆菌
对植物病害的防治范围ꎮ
　 　 生防菌在大田能否发挥防治作用ꎬ关键看其能
否适应大田复杂的环境ꎬ在靶植物表面定殖[２５ꎬ２６]ꎮ
生理生化测定表明ꎬ菌株 Ｚ２ 产生芽胞ꎬ具有较宽
的生长温度范围和生长 ｐＨ 范围ꎬ能耐 ７％的
ＮａＣｌꎬ４８℃也具抑菌活性ꎬ因此具有较强的抗逆
性ꎬ在石榴干腐病病菌的最适生长温度范围内该菌
生长迅速ꎬ平板测试中对石榴干腐病菌具有强且稳
定的拮抗作用ꎬ因此菌株 Ｚ２ 作为石榴干腐病的生
防菌具有开发潜力ꎮ 后续对该生防菌的应用探讨
中ꎬ除了考虑直接应用活菌体ꎬ对菌株 Ｚ２ 产生的
抗菌活性成分的纯化、鉴定和利用及其调控基因的
克隆与应用有待深入研究ꎮ
　 　 菌株的摇瓶发酵条件优化试验是走向中试及
工业生产的必要步骤ꎬ培养条件获得的难易程度直
接影响生防菌株产业化生产的成本ꎮ 菌株 Ｚ２ 的
摇瓶培养条件经单因素试验和正交设计表明ꎬ其发
酵条件较为简单:在温度 ２７℃ꎬｐＨ 为 ６ 或 ８ 的 ＬＢ
培养基培养 ３ ｄ 即可对石榴干腐病产生较强的抑
制效果(８１.８９ ％)ꎮ 有关解淀粉芽胞杆菌的培养
条件有不少文献报道[１９ꎬ２７]ꎬ本研究中生防菌株 Ｚ２
的培养条件与前人研究的结果有些不同ꎬ原因是生
防菌株不同ꎬ抑菌物质产生的条件和产生的抑菌活
性成分可能不同ꎮ 抑菌谱研究结果表明ꎬ虽然菌株
Ｚ２对多种植物病原真菌都有抑制作用ꎬ但对石榴
干腐病菌的抑制效果最好ꎬ抑制率达 ６９.２８％ꎬ极显
著高于其他 １７ 种测试的植物病原真菌(表 １)ꎬ这
点与已报道的解淀粉芽胞杆菌不同ꎬ已报道的解淀
粉芽胞杆菌对多种植物病原真菌的抑制率都在
６０％以上[１９ꎬ２７~３０]ꎬ可见石榴干腐病菌对生防菌株
Ｚ２产生的抑菌活性物质特别敏感ꎬ因此ꎬ本研究中
的菌株 Ｚ２ 和已报道的解淀粉芽胞杆菌可能是属
于种内的不同株系ꎬ且菌株 Ｚ２ 的来源和生境与其
它解淀粉芽胞杆菌菌株不同ꎬ导致同种细菌不同菌
株(系)间的最优培养条件存在差异ꎮ 菌株 Ｚ２ 培
养条件的研究为该菌株的产业化和大田应用奠定
了基础ꎮ 另外ꎬ后续小试、中试生产中通过采用廉
价的培养基和相对较为简单的培养条件生产生防
菌产品ꎬ有望为石榴干腐病的生物防治提供高效、
安全、价廉的生物农药ꎮ
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６３４
　
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[１６] Ｙｕ Ｇ Ｈꎬ Ｎｉｕ Ｃ Ｙꎬ ＣｈｅｎＹ Ｆꎬ ｅｔ ａｌ. Ｕｓｅ ｏｆ １６Ｓ
ｒＤＮＡꎬ ｇｙｒＡ ａｎｄ ｇｙｒＢ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ａ
ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. ｓｔｒａｉｎ Ｒ３１ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] .
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[１７] Ｃｈｕｎ Ｊꎬ Ｂａｅ Ｋ Ｓ. Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｔａｘａ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｐａｒｔｉａｌ ｇｙｒＡ ｇｅｎｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ[ Ｊ] . Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋꎬ ２０００ꎬ ７８:
１２３－１２７.
[１８] Ｒｅｖａ Ｏ Ｎꎬ Ｄｉｘｅｌｉｕｓ Ｃꎬ Ｍｅｉｊｅｒ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｃｏｌｏｎｉｚｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓｏｍｅ
ｂａｃｔｅｒｉａ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ａｎｄ Ｂａｃｉｌ￣
ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ [ Ｊ] . ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｃｏｌｏｇｙꎬ ２００４ꎬ
４８(２): ２４９－２５９.
[１９] Ｑｕａｎ Ｃ Ｓꎬ Ｗａｎｇ Ｊ Ｈꎬ Ｘｕ Ｈ Ｔꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｗｉｔｈ
ｈｉｇｈ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ (ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｊ] . Ａｃｔａ Ｍｉｃｒｏ￣
ｂｉｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ(微生物学报)ꎬ ２００６ꎬ４６(１): ７－１２.
[２０] Ｒａｍａｒａｔｈｎａｍ Ｒꎬ Ｆｅｒｎａｎｄｏ Ｗ Ｇ Ｄꎬ ｄｅ Ｋｉｅｖｉｔ Ｔ. Ｔｈｅ
ｒｏｌｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅꎬ
ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓꎬＢａ￣
ｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ ａｎｄ Ｂ. ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓꎬ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ
ｂｌａｃｋｌｅｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｃａｎｏｌａ[ Ｊ] . ＢｉｏＣｏｎｔｒｏｌꎬ２０１１ꎬ５６:
２２５－２３５.
[２１] Ａｌｖｉｎｄｉａ Ｄ Ｇ. Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｒｏｗｎ ｒｏｔ ｄｉｓｅａｓｅ
ａｎｄ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ￣ｆｒｅｅ ｂａｎａｎａ ｆｒｕｉｔ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＤＧＡ１４ ａｎｄ ｈｏｔ ｗａｔｅｒ ｔｒｅａｔ￣
ｍｅｎｔ [Ｊ] . Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ２０１３ꎬ
１３６:１８３－１９１.
[２２] Ｗａｎｇ ＢꎬＹｕａｎ ＪꎬＺｈａｎｇ Ｊꎬｅｔ ａｌ. Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｂｉｏｏｒ￣
ｇａｎｉｃ ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ
Ｗ１９ ｏｎ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｗｉｌｔ ｏｆ ｂａｎａｎａ [ Ｊ] .
Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｓｏｉｌｓꎬ２０１３ꎬ４９:４３５－４４６.
[２３] Ｈｕ ＷꎬＺｈａｏ Ｌ ＦꎬＺｈａｎｇ Ｌꎬｅｔ ａｌ. 　 Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ＡＦ１１ ａｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｇａｉｎｓｔ Ｆｕｓａｒ￣
ｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｕｂｅｎｓｅ ｒａｃｅ ４ꎬ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｏｆ
ｂａｎａｎａ ｗｉｌｔ ｄｉｓｅａｓｅ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ(中国生物防治学报)ꎬ２０１２ꎬ２８:
３８７－３９３.
[２４] Ｚｈａｎｇ Ｒ ＳꎬＷａｎｇ Ｘ ＹꎬＬｕｏ Ｃ Ｐꎬｅｔ ａｌ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｌｘ￣１１
ａｎｄ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｔｉｎ ａｇａｉｎｓｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｌｅａｆ ｓｔｒｅａｋ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｊ] . Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ Ｓｉｎｉ￣
ｃａ(中国农业科学)ꎬ２０１３ꎬ４６:２０１４ －２０２１.
[２５] Ｃｏｍｐａｎｔ ＳꎬＤｕｆｆｙ ＢꎬＮｏｗａｋ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｕｓｅ ｏｆ ｐｌａｎｔ
ｇｒｏｗｔｈ￣ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｌａｎｔ
ｄｉｓｅａｓｅｓ:ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓꎬｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｃｔｉｏｎꎬ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ
ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ[Ｊ] . Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ￣
ｇｙꎬ２００５ꎬ７１(９):４９５１－４９５９.
[２６] Ｃｏｍｐａｎｔ ＳꎬＭｉｔｔｅｒ ＢꎬＣｏｌｌｉ￣Ｍｕｌｌ Ｊ Ｇꎬｅｔ ａｌ. Ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ
ｏｆ ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｆｌｏｗｅｒｓꎬ ｂｅｒｒｉｅｓꎬ ａｎｄ ｓｅｅｄｓ: ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ ｃｕｌｔｉｖａｂｌｅ ｂａｃｔｅｒｉａꎬ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｐｌａｎｔ
ｐａｒｔｓꎬａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｃｈｅｓ ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ [ Ｊ] .
Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙꎬ２０１１ꎬ６２(１):１８８－１９７.
[２７] Ｗａｎｇ Ｄ ＰꎬＭｅｎｇ ＨꎬＧｕａｎ Ｘ Ｌꎬｅｔ ａｌ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＢＩ２ ａｎｄ ｉｔｓ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃ￣
ｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] .
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｉａｎｊｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
(天津科技大学学报)ꎬ ２０１０ꎬ ２５(６): ５－９.
[２８] Ｘｕ Ｌ Ｌꎬ Ｗａｎｇ Ｌꎬ Ｃｈｅｎ Ｌ Ｎꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｒａｉｎ ＨＮＡ３ ａｎｄ ｉｔｓ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｗｉｔｈ
ａ ｂｒｏａｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)
[Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ(华
中农业大学学报)ꎬ ２０１３ꎬ ３２(３):２１－２７.
[２９] Ｋｕａｎｇ Ｆ Ｙꎬ Ｗｕ Ｘ Ｌꎬ Ｌｖ Ｆ Ｑꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ. ａｇａｉｎｓｔ
Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｊ] . Ｍｉｃｒｏ￣
ｂｉｏｌｏｇｙ(微生物学通报)ꎬ ２００９ꎬ ３６(９): １３５０－１３５５.
[３０] Ｈａｏ Ｗ Ｎꎬ Ｌｉ Ｈꎬ Ｈｕ Ｍ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔａｇｏ￣
ｎｉｓｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｇａｉｎｓｔ ｃｉｔｒｕｓ ｇｒｅｅｎ ｍｏｌｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｎｈｉｂｉ￣
ｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ Ｓｈａｔａｎｇ ｍａｎｄａｒｉｎ ｆｒｕｉｔ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)
[Ｊ] .Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ(中国生物
防治学报)ꎬ ２０１１ꎬ ２７(２): ２８４－２８８.
责任编辑:于金枝
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