全 文 ：书西北植物学报!
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!!
文章编号$
#""")("!*
"
!"#$
#
"%)#&$%)"+
收稿日期$
!"#$)"*)#&
%修改稿收到日期$
!"#$)"&)$"
基金项目$河南省科技攻关项目"
%!#"!##"#!,
#%郑州市科技计划项目"
##!--./0!*")$
#%校级资助项目"
!"#!",#
#
作者简介$崔
!
波"
#%+!
#!男!博士!研究员!主要从事花卉分子生物学研究&
1)2345
$
53678496
!
#+$:762
萼脊兰
!1!"#$%&
基因的克隆与表达分析
崔
!
波#!蒋素华#!刘
!
佳!!田云芳#!袁秀云#!马
!
杰#
"
#
郑州师范学院 生物工程研究所!郑州
(*""((
%
!
河南农业大学 生命科学学院!郑州
(*"""!
#
摘
!
要$采用
;.)-<;
和
;=<1
技术从萼脊兰"
!"#$%"&

&
(
)*$+&
#花瓣中分离到
#
个
>=?@)96A=
类基因!该基因
命名为
,-#)54BC
"登录号
DE&&++$+
#&
,-#)54BC
基因的
7?F=
全长
#!!#9
G
!包含
#
个
&*$9
G
的开放阅读框
"
H;I
#!共编码
!*"
个氨基酸&蛋白序列比对和进化树分析表明!
=-#)54BC
蛋白与蝴蝶兰
H;=-##
蛋白的一致性
为
%+J
!进化距离最近&二级结构分析表明!该蛋白分子属于亲水性蛋白!其中有
*$:+"J
的
"
螺旋
&:!"J
的延伸
链
$%:!"J
的不规则折叠&实时荧光定量
-<;
分析表明!萼脊兰
,-#)54BC
基因在盛花期的根和叶中表达量最高%
在生殖器官中花蕾期花葶的表达量最高!其次是花蕾%盛花期中花葶的表达量最高!子房和合蕊柱的表达量次之!
萼片花瓣唇瓣均有微量表达&研究认为!
,-#)54BC
可能在调控植物由营养生长向生殖生长过渡阶段及子房的建
成中起重要作用&
关键词$萼脊兰%
>=?@)96A
基因%实时荧光定量
-<;
%克隆和表达分析
中图分类号$
E&,*
%
E&,%
文献标志码$
=
#()$)
*
+),-.
/
0&11$()2)+#
3
1$1(4!1!"#$%&5&)&40(60).-()$
2
$
3
&/-"$
#
!
DL=F/@8N83
#
!
OLKD43
!
!
.L=F08PQ3P
R
#
!
0K=FS48
T
8P
#
!
>=D4C
#
"
#LPUV4V8VC6QM46CP
R
4PCCW4P
R
!
XNCP
R
YN68F6W235KP4ZCWU4V
T
!
XNCP
R
YN68(*""((
!
%
!<65C
R
C6QO4QC@74CP7C
!
[CP3P=
R
W4785)
V8W35KP4ZCWU4V
T
!
XNCP
R
YN68(*"""!
!
#
27180+98
$
=>=?@)96A
R
CPC\3U4U653VC]QW62VNC
G
CV356Q!"#$%"&

&
(
)*$+&9
T
8U4P
R
;.)-<;3P];=<1
3
GG
W637NCU3P]VNC
R
CPC\3UP32C],-#)54BC
"
.NC377CUU46PP829CW4P/CPM3PB
$
DE&&++$+
#
:.NCQ85
5CP
R
VN7?F=6Q,-#)54BC4U#!!#9
G
!
\4VN3PH;I6Q&*$9
G
CP76]4P
R
!*"
G
8V3V4ZC324P6374]WCU4]8CU:
>85V4
G
5CUC
^
8CP7C354
R
P2CPV3P]
G
N
T
56
R
CPCV47VWCC3P35
T
UCUUN6\C]VN3V,-#)54BC4U756UCV6./,-##QW62
-0&1&"*)
(
2$2&3&4$1$2\4VN3P%+JUC
^
8CP7CU42453W4V
T
:.N4U
G
W6VC4P4UN
T
]W6
G
N45473P]76PV34PU*$:+"J
"
)NC54735]6234PU
!
&:!"JCAVCP]C]UVW3P]
!
$%:!"JW3P]627645:.NCCA
G
WCUU46P\3U3P35
T
YC]9
T
WC35)V42C
Q586WCU7CPV
^
83PV4V3V4ZC-<;3P]VN4U
R
CPC\3UCA
G
WCUUC]4P]4QQCWCPV
G
3WVU4P]4QQCWCPV
G
CW46]U
!
98VCA
G
WCU)
U46P398P]3P7C\3U]4QQCWCPV:LPW66VU3P]5C3ZCU
!
VNCN4
R
NCUV3268PV6QCA
G
WCUU46P\3U69UCWZC]]8W4P
R
Q85)95662UV3
R
C
!
LPVNCWC
G
W6]87V4ZC6W
R
3PU
!
VNCN4
R
NCUVCA
G
WCUU46P5CZC56Q,-#)54BC\3U]CVC7VC]4P
U73
G
CU
!
Q656\C]9
T
4P98]U]8W4P
R
VNC98]
G
CW46]:.NCCA
G
WCUU46P5CZC56Q,-#)54BC4PU73
G
CUUN6\C]N4
R
N)
CWVN3PVN3V4P6Z3W4CU3P]76582PU]8W4P
R
Q85)95662
G
CW46]:.NCCA
G
WCUU46P6Q,-#)54BC4PUC
G
35U3P]
G
CV)
35U3P]54
G
UUN6\C]VNC56\CUV5CZC5:.NCWCU85VUUN6\C]VN3VVN4U
R
CPC23
TG
53
T
3P42
G
6WV3PVW65C4PWC
R
8)
53V4P
R
VNCVW3PU4V46PQW62ZC
R
CV3V4ZC
R
W6\VNV6WC
G
W6]87V4ZC
R
W6\VN3P]VNC6Z3W
T
]CZC56
G
2CPV:
:&
3
;(0,1
$
!"#$%"&

&
(
)*$+&
%
>=?@)96A
R
CPC
%
WC35)V42CQ586WCU7CPV
^
83PV4V3V4ZC-<;
%
756PC3P]CA
G
WCUU46P
3P35
T
U4U
!!
了解植物由营养生长向生殖生长转变的调节过
程!对于控制有花植物的生长发育是很有意义的&
>=?@)96A
基因是发育过程的主要调控基因(#)!
,-#
基因属于
>=?@)96A
基因
=
类基因(!)$)!
,-#
基因又是花器官形态特征基因!在花发育的
=M<)
?1
模型中!是萼片和花瓣正常发育所必需的()*)!
同时也能激活
M
类基因(+)&
,-#
基因和
=-!
基因
相互作用使萼片和花瓣特异化&
,-#
基因突变使
一些花变成花序!导致萼片和花瓣发育异常(&)&以
上表明!
,-#
基因在花器官发育上起关键作用&近
来的研究表明!
>=?@)96A
基因家族并不只在花器
官的发育中起调控作用!
>=?@)96A
基因在控制开
花时间决定分生组织的分化(,)控制胚胎发育(%)
促进根的形成(#")以及调控种子和果实的发育(##)#!)
等方面都起着重要的作用&
萼脊兰"
!"#$%"&

&
(
)*$+&
#为兰科"
HW7N4]37C)
3C
#萼脊兰属"
!"#$%"&
#植物&其花小而素雅!花色
清丽!且具有奇妙的幽香!观赏期长!养护简单且耐
寒!是一种观赏价值很高的附生兰&其花具有典型
的轮状结构!基本与双子叶植物花的结构组成一致!
但又具有高度特化的唇瓣和合蕊柱!为研究花发育
基因在单子叶植物中的功能提供了较为理想的实验
材料&目前!对兰科植物花发育相关基因的研究多
集中在蝴蝶兰"
-0&1&"*)
(
2$2UU
G
:
#石斛兰"
5"*6
#%)4$73UU
G
:
#及文心兰"
.*+$#$73UU
G
:
#等兰花种
类上(#$)#*)&近年来随着分子生物学在花卉上的相关
研究及其在育种过程中的应用!兰科植物开花相关
基因及其表达也成为当今研究热点!但是对萼脊兰
开花相关基因的研究还很少&本研究以萼脊兰花瓣
为材料!采用
;.)-<;
和
;=<1
技术等方法!克隆
出了萼脊兰与开花相关的
>=?@)96A
基因
,-#)
54BC
的保守序列及其全长序列!并对该序列进行生
物信息学分析!利用实时荧光定量
-<;
技术分析该
基因在生长发育过程中不同时期不同部位的表达
特性!为下一步萼脊兰基因工程育种奠定基础&
#
!
材料和方法
!:!
!
植物材料
试验材料萼脊兰"
!"#$%"&

&
(
)*$+&
#取自郑州
师范学院的温室&取萼脊兰的花瓣!进行基因片段
克隆&分别取苗期根和叶!花蕾期根叶花葶花蕾
和盛花期根叶花葶萼片花瓣唇瓣子房合蕊
柱提取总
;F=
!进行时空表达分析&所有材料均用
液氮速冻!
,"_
保存备用&
!:<
!
方
!
法
!=<=!
!
!1!"#$%&
基因的克隆
!
采用
;F=
G
WC
GG
8WC
植物总
;F=
提取试剂盒"天根生物技术有限公
司#!参照说明书提取
;F=
&采用
;CZCWV=4]I4WUV
@VW3P]7?F=@
T
PVNCU4U 4`V
"
.3` 3;3
#!按照说明书
进行
7?F=
的第一链的合成&
根据已登录的其他物种
>=?@)96A
基因序列!
经
?F=>=F
序列比对!找出其中保守序列!设计
特异简并引物
=-I#
和
=-;#
!
-<;
扩增目的片段&
根据克隆的萼脊兰
,-#)54BC
基因目的片段!采用巢
式
-<;
方法!设计
$a);=<1
和
*a);=<1
扩增引
物!用
$a);=<1
和
*a);=<1
试剂盒"
.3` 3;3
#分别
进行
$a)7?F=
末端扩增和
*a
端扩增&将已克隆并
测序正确的萼脊兰
,-#)54BC
基因目的片段
$a)7?)
F=
末端扩增和
*a
端扩增进行拼接!获得
,-#)54BC
全长序列"表
#
#&
已有序列的检索使用
/CPM3PB
的
M53UV
!引物设
计采用
-W42CW-WC24CW*:"
!序列拼接及分析采用
?F=>=F
软件&蛋白质亲疏水性采用
-W6V@735C
程
序分析%蛋白质二级结构预测采用
1A-=@
T
网站上的
/H;-W6VC4PUC76P]3W
T
UVW87V8WC
G
WC]47V46P
%系统进化
树使用
>1/=(:"
软件中的
FD
法建树&
表
!
!
引物序列
.395C#
!
@C
^
8CP7CU6Q
G
W42CWU
目的条带扩增
=2
G
54Q473V46P6QQW3
R
2CPV
引物
-W42CW
退火温度
.2
*
_
,-#)54BC
保守区
,-#)54BC76PUCWZC]WC
R
46P
=-I#
$
<./==/>//=.=
*
=-;#
$
<==/<./<./<.<=
*
<
*
.==
*
//./../
*+
$a);=<1
第一轮
.NCQ4WUVW68P]
=-#)#
$
/=..<../=<$a;=<168VCW
$
.=<**
第二轮
.NCUC76P]W68P]
=-#)!
$
.<.<=.///./=/<=/<.=/=<=/.<
$a);=<14PPCW
$
*,
*a);=<1
第一轮
.NCQ4WUVW68P]
=-#)$
$
/<..*a;=<168VCW
$
==/<=/.//.=.<==+,
第二轮
.NCUC76P]W68P]
=-#)(
$
//.<==/==.<<.=.<<=./<=//=/
*a);=<14PPCW
$
==/<=/.//.=.<==+!
"(&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$$
卷
表
<
!
>&+#"8$6&?>
反应的引物参数
.395C!
!
-3W32CVCWUQ6WWC35V42C-<;
G
W42CWU
特异引物
/CPCU
G
C74Q47
G
W42CWUC
^
8CP7C
退火温度
.C2
G
CW3V8WC
*
_
产物大小
-W6]87V
U4YC
*
9
G
E;.),-#
I
$
<==/=.===.=//<=//./=;
$
<<<.../*, ##&
E;.)#,@
I
$
/==;
$
<=.<=*, ##&
!=<=<
!
!1!"#$%&
基因表达分析
!
以
,-#)54BC
全长
序列的
H;I
区设计实时荧光定量
-<;
引物!以萼
脊兰
#,@W;F=
作为内参基因!并设计引物"表
!
#进
行
,-#)54BC
基因在萼脊兰中的表达分析&分别提
取萼脊兰不同发育阶段不同组织部位的总
;F=
!
使用
-W42C@7W4
G
V;.WC3
R
CPV 4`Vb4VN
R
?F=1)
W3UCW
试剂盒"
.3` 3;3
#!反转录合成
7?F=
第一
链&采用三步法
^
;.)-<;
!
"
#
O
反应体系包括
#"
#
O!c@0M;
$
-WC24A1A8&
9
.>
%
"
.3` 3;3
#
":,
#
O
的上下游基因特异性引物及各个样本的
7?F=
!:"
#
O
!并补
][
!
H
至
!"
#
O
&
^
;.)-<;
所用仪器
为
1
GG
CP]6WQ>3UVCW7
T
75CWC
G
WC35
G
5CA!
!反应程序
为$预变性
%*_$"U
%
*_
变性
#*U
%退火
#*U
%
&!
_
延伸
$"U
!
("
个循环&每个样品重复
$
次!并做
阴性对照&目的基因相对表达量
;C5:1A
G
d!

&&
!
其中
&
:Vd:V
"
,-#)54BC
#
:V
"
#,UW;F=
#!
&&
:Vd
"各植物组织
&
:V
#

"苗期根
&
:V
#&
!
!
结果与分析
<=!
!
!1!"#$%&
基因的全长
9@A2
的克隆
基因保守区扩增结果与预期目标片段相符!约
(""9
G
的
?F=
片段!产物直接测序确认片段大小
为
$&+9
G
&该序列的核苷酸和氨基酸序列分别在
/CPM3PB
经
M53UV
分析!
$&+9
G
的片段与数据库中
已有的
,-#)54BC
核苷酸和氨基酸序列高度一致&
$a);=<1
巢式
-<;
电泳结果与预期目标片段
相符!约
,""9
G
的清晰条带经克隆测序以及结合保
守区序列分析!约
,""9
G
的片段与萼脊兰
,-#)54BC
保守区序列有
+*9
G
的重叠区!确认此片段大小为
,!$9
G
!是
2;F=$a
端序列&
*a);=<1
巢式
-<;
模板电泳结果显示约为
$""9
G
的单一
?F=
片段&经过测序软件分析!
!%$9
G
的片段与
,-#)54BC
保守区序列有
#,(9
G
的
重叠区!表明此片段为萼脊兰
,-#)54BC
的
2;F=
*a
端序列&
经
$a
端序列
*a
端序列和保守序列拼接获得萼
脊兰
,-#)54BC
的
7?F=
全长!命名为
,-#)54BC
!全
长
#!!#9
G
"
/CPM3PB
登录号
DE&&++$+
#!
*a
非编码
区
++9
G
!
$a
非编码区
("!9
G
!
H;I&*$9
G
&
<=<
!
!1!"#$%&
基因序列分析
通过对萼脊兰
,-#)54BC
基因的氨基酸列进行
分析"图
#
#!该氨基酸序列属于植物特有的
>L` <
型
>=?@)96A
基因!包含典型的
>=?@
盒
L
区
`
盒和
<
末端!其中
>=?@
盒包含
+#
个氨基酸组成
的高度保守的结构域!其编码的
>=?@
蛋白结构域
可以结合靶
?F=
%中度保守的
`
盒包含
%#
个氨基
酸!主要调节蛋白质与蛋白质间的相互作用!是转录
因子的结构特征序列&
将萼脊兰
,-#)54BC
基因编码的氨基酸进行同源
性分析"图
!
#!结果显示!与蝴蝶兰
./,-##
一致性
为"
?E#"($!,
#
%+J
!与建兰
,-#)54BC
"
DS!**&$*
#的一
致性为
%"J
!与文心兰
;,5!#"
"
[>#(",(+
#的一致
性为
,,J
!反映出该基因在进化上较为保守&
为了进一步研究萼脊兰
,-#)54BC
基因与其他
>=?@)96A
基因的关系!选取
>=?@)96A
基因的
(
个亚家族"即
=

M

<
*
?

1
类基因家族#中的
>=?@)96A
基因!利用
>1/=(:"
软件!构建系统
进化树"图
(
#&分析结果表明!该
,-#)54BC
基因属
于
=
类
>=?@)96A
基因!在
=
类基因里单双子叶
植物区分明显!与单子叶植物进化距离较近!与双子
叶植物的进化距离远&其中!萼脊兰
,-#)54BC
与兰
科植物蝴蝶兰
./,-##
亲缘关系最近!其次是建兰
,-#)54BC
文心 兰
;,5!#"
和 石 斛 兰
86
<=??)54BC
!与蕙兰的亲缘关系最远&
经蛋白质亲疏水性分析!该蛋白属于亲水性蛋
白!蛋白质二级结构预测结果"图
$
#表明!萼脊兰
图
#
!
萼脊兰
,-#)54BC
蛋白保守结构域
I4
R
:#
!
!@

&
(
)*$+&,-#)54BC76PUCWZ3V4ZC
G
W6VC4P]6234PUVW87V8WC
#(&#
%
期
!!!!!!!!!!!!!!
崔
!
波!等$萼脊兰
,-#)54BC
基因的克隆与表达分析
=-#)54BC
蛋白的二级结构由
*$:+"J
的
"
螺旋
&:!"J
的延伸链和
$%:!"J
的不规则折叠组成&
<=B
!
萼脊兰
!1!"#$%&
基因表达分析
表达分析结果表明!选取的萼脊兰的
#(
个样品
材料中!在苗期花蕾期盛花期不同部位都有表达!
但表达丰度不同!说明
,-#)54BC
基因的表达没有组
织特异性&在营养器官中!盛花期的根和叶中的表
达量最高%在生殖器官中!花蕾期的花葶表达量最
图
!
!
,-#)54BC
氨基酸序列比对
#

+#
为
>=?@)96A
区域!
,,

#&,
为
)`96A
区域
I4
R
:!
!
<62
G
3W4U6P6QVNC324P6374]UC
^
8CP7CU6Q,-#)54BC
.NC324P6374]U6QVNCUC
^
8CP7CQW62#V6+#3WC>=?@)96A3P]VNCUC
^
8CP7CQW62,,)#&,3WC )`96A
图
$
!
萼脊兰
,-#)54BC
基因蛋白序列的二级结构预测
紫色
:
无规则卷曲%蓝色
:
"
螺旋%红色
:
延伸链
I4
R
:$
!
-WC]47V46P6QUC76P]UVW87V8WCQ6W
G
W6VC4P6Q,-#)54BCQW62!@

&
(
)*$+&
-8W
G
5C7656W:;3P]627645
%
M58C7656W:=5
G
N3NC54A
%
;C]7656W:1AVCP]C]UVW3P]
!(&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$$
卷
图
(
!
,-#)54BC
系统进化树
接点部位的值代表
#"""
次重复的靴带值
I4
R
:(
!
-N
T
56
R
CPCV47VWCCQ6W,-#)54BC
e358CU3VP6]CU4P]473VC966VUVW3
GG
CW7CPV3
R
CU
图
*
!
,-#)54BC
的时空表达分析
;"

O"
为幼苗期的根叶%
;#

O#

@7#

M
分别为花蕾期的根叶
花葶花蕾%
;!

O!

@7!

@C!

-!

O4!


H!
分别为
盛花期的根叶花葶萼片花瓣唇瓣合蕊柱子房
I4
R
:*
!
,-#)54BCCA
G
WCUU46P3P35
T
U4U\4VN
]4QQCWCPV
G
CW46]U3P]V4UU8CU
;"3P]O"WC
G
WCUCPVW66V3P]5C3Q]8W4P
R
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高!其次是花蕾%盛花期花葶的表达量也最高!子房
和合蕊柱的表达量次之!而萼片花瓣唇瓣的表达
水平均很低"图
*
#&在营养器官中!盛花期的根和
叶的表达量较高!分别是苗期和花蕾期根和叶的表
达量的
$
倍%在生殖器官中!花蕾期不同部位的总的
表达量低于盛花期不同部位的总的表达量!花蕾期
花葶的表达量约是盛花期花葶表达量的
!
倍&
$
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讨
!
论
本试验依据
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和
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技术快速分离出一个与花发育相关
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基因
,-#)54BC
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基因的氨基酸
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区
和
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区!表明它们是典型
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基因&在植物
中!一般拥有
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是转录因子的结构特征序列(#+)&同源分析的结果
表明!
,-#)54BC
基因与兰科的
,-#
同源基因有较
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期
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!
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,-#)54BC
基因的克隆与表达分析
高的一致性&
在不同物种中
,-#
同源基因的表达存在一定
差异!在拟南芥中!
,-#
基因首先在花原基中表达!
随着花原基的增大!
,-#
的表达增强!在花器官发
育过程中仅在萼片和花瓣的表达(#&)&在其他物种
中!
,-#
同源基因的表达模式因物种的不同而存在
差异!如
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等在木兰中分离的
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在苞
片雄蕊心皮及叶片中高度表达(#,)%水稻中的
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在根叶片花序及所有的花器官中表
达(#%)!")&本实验结果表明!在苗期花蕾期盛花期
不同部位都有表达!但表达丰度不一致!说明
,-#)
54BC
的表达没有器官特异性&花蕾期花葶的表达量
约是盛花期花葶表达量的
!
倍!暗示其可能是开花
的一个早期信号&在整个生长期中!子房的表达量
也很高!说明
,-#)54BC
基因在子房形成的过程中也
起到了重要的作用!在合蕊柱萼片花瓣唇瓣中均
有表达!说明该基因参与了花器官的形态建成&
,-#)54BC
基因在苗期花蕾期盛花期的根和叶中
均有表达!盛花期的根和叶的总表达量较高!分别是
苗期和花蕾期根和叶总表达量的
$
倍!说明
,-#)
54BC
基因还可能在营养生长后期中起作用&总之!
该实验结果为阐明
,-#)54BC
在花发育分子机制中
的作用提供了新的证据&
为进一步确定
,-#)54BC
在萼脊兰花发育过程
中的作用!正在构建
,-#)54BC
基因的超表达载体进
行遗传转化!期望通过分析转基因植株的表型最终
确定
,-#)54BC
基因的功能&
参考文献!
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