全 文 ：书西北植物学报!
"#$
!
%$
"
$
#$
"&"("&)
!"#$%&#%&()$*+,""-.)/#0-/
!!
文章编号$
#"""*+"!$
"
!"#$
#
"$*"&"*"&
!!!!!!!!!!!!!!!
!"#
$
#",)-"-
%
.
,/001,#"""*+"!$,!"#$,"$,"&"
收稿日期$
!"#$*"#*"
&修改稿收到日期$
!"#$*"%*!$
基金项目$国家自然科学基金"
%#!"#-#+
!
%#!)!#+
#
作者简介$张冬敏"
#&(
#!女!硕士!主要从事果树生物技术研究
"
通信作者$赖钟雄!博士!研究员!博士生导师!主要从事园艺植物生物技术与遗传资源研究
2*34/5
$
64/78"#
!
#-%,9:3
龙眼体细胞胚胎发生过程中
1*230
的
克隆与表达分析
张冬敏!田奇琳!杨曼曼!林玉玲!赖钟雄"
"福建农林大学 园艺植物生物工程研究所!福州
%$"""!
#
摘
!
要$以龙眼(红核子)
6;
!
悬浮细胞系诱导的胚性愈伤组织为基本材料!按照龙眼体细胞胚胎同步化方法诱导
获得龙眼体胚不同阶段材料!并以龙眼体细胞胚胎发生不同阶段混合材料作为试验材料!采用
<=*>;<
结合
技术分离并克隆龙眼中编码同源异型结构域蛋白的转录因子
!"#$%&
"简称
()!"#
#的
9@A?
全长及
@A?
序列!并进行序列分析与表达分析结果表明$
()!"#
的
9@A?
全长
###"B
C
!开放阅读框"
D#
&$&B
C
!共
编码
!&$
个氨基酸"
FG1H41I
登录号为
JK"#)$"-
#!
()!"#
的
@A?
包含
!
个内含子序列分析表明!
@5LMN
是
一个不稳定的亲水蛋白!不含信号肽!亚细胞定位于细胞核!具跨膜结构和
O:3G:P:34/1
超级家族的保守结构域
以及
LMN
转录因子家族特有的
LMNB:8
和
2?<*5/IG
结构域!推测该目的基因确实为
!"#
转录因子系统进化
分析显示!龙眼
@5LMN
与脐橙
LMN
归为一个分支!亲缘关系较近实时荧光定量
>;<
分析结果表明!在龙眼体
细胞胚胎发生整个过程中!
()!"#
均有表达!但仅在球形胚时期表达量较高!说明
()!"#
可能主要在球形胚阶
段发挥作用!并且在一定浓度范围内!外源施加
Q??
和
F?
%
能够促进
()!"#
基因的表达!而外源施加
N?
则抑制
()!"#
基因的表达
关键词$龙眼&体细胞胚胎发生&
!"#$%&
&实时荧光定量
>;<
中图分类号$
R)&-
&
R)&
文献标志码$
?
$%"&#&

"(1*230()"*+*,)
-
"

.&#/$0%120&!342+5
6
).22#"&
7&0%
-
2#2!1)#&

8"*04#/+*,)
-
"

.&.2#2#&1-4&"$(
5
67*&/
8
$/9"1):
SO?AF@:1
T
3/1
!
=Q?AR/5/1
!
U?AFK41341
!
6QAUV5/1
T
!
6?QSW:1
T
8/:1
T
"
"
Q10X/XVXG:YO:ZX/9V5XVZ45H/:XG9W1:5:
T[
!
EV
.
/41?
T
Z/9V5XVZG41PE:ZG0XZ
[
M1/\GZ0/X
[
!
EV7W:V%$"""!
!
;W/14
#
7,24)0/4
$
@/YYGZG1X0X4
T
G0:Y0:34X/9G3BZ
[
:0]GZG:BX4/1GP/1G3BZ
[
:
T
G1/9945V0YZ:3G3BZ
[
:
T
G1/99G5
0V0
C
G10/:19V5XVZG:Y5:1
T
41
!
41PV0GPXWG0G0:34X/9G3BZ
[
:040XWGXG0X34XGZ/45,=WG<=*>;<9:3B/1GP
]/XWC
5GXG9@A?0G
^
VG19G041P@A?0G
^
VG19G0:YW:3G:P:34/1
XZ4109Z/
C
X/:1Y49X:Z!"#$%&
"
()!"#
#
YZ:3G3BZ
[
:
T
G1/9945V0:Y(*+,-./
0
12),3
4
.3 6:VZ,,=WG
9:3
C
5GXG9@A?0G
^
VG19G:Y()!"#]40###"B
C
!
G19:P/1
T
!&$43/1:49/P0@A?0G
^
VG19G4145
[
0/0/1P/94*
XGPXW4X/X9:1X4/10!/1XZ:10,()!"#5:94XGP/11V95GV0
&
/XW4P1:0/
T
145
C
G
C
X/PG
!
W4PXZ4103G3BZ41G0XZV9*
XVZG
!
W:3G:B:8P:34/1
!
LMNB:841P2?<*5/IGP:34/1,?1
T
5/9/7/1
TC
W
[
5:
T
G1GX/9XZGG:Y!"#/1
C
541X0
/1P/94XGPXW4X()!"#41P;0LMNBG5:1
T
GPX:XWG043GBZ419W
!
XWGZGY:ZG
!
()!"#BG5:1
T
GPX:LMNY43/*
5
[
,^
V41X/X4X/\G>;C
ZG00/:14X450X4
T
G0
!
BVX/XG8
C
ZG00GP
4XXWGW/
T
WG0X5G\G50/1XWG
T
5:BV54ZG3BZ
[
:0
!
0V
TT
G0X/1
T
XW4X()!"#
C
54
[
434
.
:ZZ:5G4X5:1
T
410:34X/9
G3BZ
[
:
T
G1G0/0,Q149GZX4/19:19G1XZ4X/:1Z41
T
G
!
()!"#0W:]GPV
C
*ZG
T
V54XGPG8
C
ZG00/:1
C
4XXGZ10V1PGZ
G8:
T
G1:V0Q??41PF?
%
41PP:]1*ZG
T
V54XGPG8
C
ZG00/:1
C
4XXGZ10V1PGZG8:
T
G1:V0N?,
;.
-
<")!2
$
5:1
T
41
&
0:34X/9G3BZ
[
:
T
G1G0/0
&
!"#$%&
&
ZG45*X/3G
^
V41X/X4X/\G>;<
!!
体细胞胚胎发生是植物体外再生的一种有效方
法!目前已经有许多经济作物利用体细胞胚胎发生
来获得体外再生植株!并且因为体细胞胚胎发生的
生长发育过程类似于合子胚!所以也常常作为研究
高等植物合子胚生长发育的模式材料外植体诱导
体细胞胚胎发生无论是直接从胚性细胞诱导还是经
愈伤组织形成的胚性愈伤组织最后形成!都需经过
一个胚性细胞阶段*#+早年的研究多集中于外源激
素对植物体细胞胚胎发生的影响!近年越来越多与
体细胞胚胎发生相关的基因被鉴定出来!其中包括
编码同源异型结构域蛋白新亚基的转录因子
!"#5
$%&
"简称
!"#
#
!"#
是
!"#%67&65869
"
!69
#家族成员!具有典型的
OD_
,
LMNB:8
和
2?<*5/IG
位点*!*$+主要在茎端分生组织的干细胞
组织中心和花分生组织中表达!被认为是决定干细
胞命运的基因在干细胞形成前开始表达!诱导周
围细胞形成并维持干细胞特性!加速周边干细胞的
分裂速度!与
$:;:<:%
"
$;%
#形成一个负反馈
调节环!共同维护分生组织中干细胞团数量的稳定!
促进体细胞胚胎的形成*-*)+
!"#
的表达可以诱导植物的体细胞向胚性细
胞转变!进而提高植物体细胞胚胎发生能力*&*+一
般认为!植物体细胞胚胎发生是由于外源施加的生
长素促发信号级联反应进而诱导体细胞胚胎发生!
因此植物体细胞胚胎发生需依赖于较高浓度的外源
生长素!而研究发现
!"#
的超表达可使拟南芥
"
:/.=*>,
0
2*2
#体细胞在无外源激素诱导下形成体
细胞胚*#"+
SWG1
T
等*##+将拟南芥
:?!"#
转入陆
地棉中!异位表达的
:?!"#
使得陆地棉"
@,22
A0
*5
1+B*/21?1+
#
;品种的愈伤分化率从原先的
",-#`
上升到
+),)$`
!可见
!"#
转录因子参与调
控植物体细胞胚胎的形成
虽然植物体细胞胚胎发生是植物体外再生的有
效方法!但存在体细胞胚诱导率及转换率的问题!目
前还有许多植物较难诱导体细胞胚胎发生!如拟南
芥以及一些多年生木本植物因为
!"#
转录因子
在体细胞胚胎发生过程中发挥了重要作用!所以研
究其在植物体细胞胚胎发生过程中的表达规律对改
善难体胚发生植物的体胚发生能力意义深远龙眼
"
(*+,-./
0
12),3
4
.36:VZ,
#作为重要的南方经济
果树!是较早建立体胚高频再生系统的木本植物!早
在
#)
年赖钟雄等*#!*#%+就利用龙眼(红核子)
6;
!
悬浮细胞系诱导的胚性愈伤组织诱导并建立龙眼体
细胞胚胎发生系统!之后由陈春玲等*#++进一步研
究!目前已经可以同步化培养获得龙眼不同发育阶
段的体细胞胚胎因此!本研究以现有的龙眼体细
胞胚胎发生系统为材料!分离和克隆龙眼
!"#
基
因!并通过实时荧光定量
>;<
研究其在龙眼体细胞
胚胎发生过程中的表达规律以及外源激素处理对其
表达的影响!期望为解决多年生木本植物体细胞胚
胎发生困难的问题提供解决方向
#
!
材料和方法
=,=
!
供试材料
以赖钟雄等*#%+建立的龙眼(红核子)
6;
!
悬浮
细胞系诱导并由福建农林大学植物工程研究所继代
保存的胚性愈伤组织为试验材料按照龙眼体细胞
胚胎发生同步化调控的方法*#+*#$+诱导获得龙眼不同
体细胞胚胎发生阶段的材料!包括$球形胚,不完全
胚性紧实结构,心形胚,鱼雷形胚和子叶胚!以及不
同激素处理的龙眼胚性愈伤组织用于实时荧光定量
>;<
材料激素处理参照曾丽兰*#-+的方法!取继代
培养
!"P
,生长良好的龙眼胚性愈伤组织!分别接种
于添加吲哚乙酸
Q??
"
,"
,
",$
,
#,"
和
#,$3
T
%
6
#,
赤霉素
F?
%
"
","
,
%,"
,
-,"
,
#","
,
#!,"
和
!$,"
3
T
%
6
#及水杨酸
N?
"
","
,
$","
,
)$,"
和
#"","
"
3:5
%
6
#的
KN
液体培养基中!
$a
!
#$"Z
%
3/1
震
荡培养
!+W

=,>
!
方
!
法
=:>:=
!
1*230
基因克隆
!
采用
=Z/>VZGQ0:54X/:1
T
G1X
"
<:9WG
#提取龙眼各个体细胞胚胎发生阶
段"胚性愈伤组织,球形胚,鱼雷形胚和子叶胚#混合
材料的总
!具体步骤参见试剂说明书&按照
FG1G<49GZJ/X
"
Q1\/XZ:
T
G1
#的使用说明逆转录合成
9@A?
第一链!用于
()!"#
基因
9@A?
序列的扩
增龙眼胚性愈伤组织
@A?
的提取参照王凤华
等*#)+的方法
采用同源克隆与
法!以
FG1G<49GZJ/X
"
Q1\/XZ:
T
G1
#逆转录合成的龙眼混合体胚材料
9@A?
第一链为模板!根据
A;HQ
上已登录的其他植
#&
$
期
!!!!!!!!!!!
张冬敏!等$龙眼体细胞胚胎发生过程中
()!"#
的克隆与表达分析
表
=
!
1*230
基因克隆与表达分析引物信息
=4B5G#
!
>Z/3GZ0V0GP/1()!"#
T
G1G95:1/1
T
41P^
V41X/X4X/\G>;<
用途
@G09Z/
C
X/:1
引物名称
>Z/3GZ143G
引物序列
>Z/3GZ0G
^
VG19G
"
$b*%b
#
退火温度
=3
%
a
扩增片段大小
>Z:PV9X0/7G
%
B
C
D扩增
?3
C
5/Y/94X/:1:YD!"#*E#
!"#*<#
;?;F;=FF?;=;;=?;??;=F?
==F;;==;??=;==F;;F=?;=
$# #%-
%b*!"#*%>
%>
;=F;;F??;?F?==;?F??F?=;=;
F;=F=;??;F?=?;F;=?;F=??;F
$)
))+
!"#*%A>
%A>
F?;?F=?;FF;??F?==F??FF;
;F;=?;F=??;FF;?=F?;?F=F
-"
$b*!"#*$>
$>
;;=?F;=F?F?=;==;=F??=;=
;F?;=FF?F;?;F?FF?;?;=F?
$$ !$%
!"#*$A>
$A>
;;?;=?==F=?F=???F?=;===F?F
FF?;?;=F?;?=FF?;=F??FF?F=?
$-
拼接验证
N
C
5/9G\GZ/Y/94X/:1
!"#*E!
!"#*=?=;?=?=FF??;;=;?=;?;;
=F==;?;?=?FF?;;=F?FF?;
$- &-)
荧光定量
>;<
^
V41X/X4X/\G>;<
!"#*
^
E
!"#*
^
<
F??F?FF?=F?=F?FF?=F?FF
=F==;?;?=?FF?;;=F?FF?;
$ !!&
物
!"#
基因的核苷酸序列!在其保守区域设计引
物
!"#*E#
和
!"#*<#
!进行保守区的扩增!利用
获得的保守区序列设计
%b*引物对
!"#*%>
和
!"#*%A>
!
$b*引物对
!"#*$>
和
!"#*
$A>
!分别进行巢式
>;<
!扩增
()!"#
的
%b
和
$b
端
序列&依据拼接获得的
()!"#
全长序列!在该序列
的
$b
和
%b
端分别设计引物
!"#*E!
和
!"#*!进
行该基因序列的全长
9@A?
扩增!同时以龙眼胚性
愈伤组织
@A?
为模板!全长
9@A?
扩增引物进行
>;<
反应!获得龙眼
!"#
的
@A?
序列!引物具体
信息列于表
#
反应程序$
+a
预变性
%3/1
!
+a
变性
%"0
!退火
%"0
"退火温度见表
#
#!
)!a
延伸按
#IB
%
3/1
设置!共
%$
个循环!
)!a
终延伸
#"3/1

=:>:>
!
龙眼
230
基因的生物信息学分析
!
以
@A?K?A-,"
对扩增获得的序列进行拼接&利用
D在线软件寻找序列开放阅读框并推导
编码的氨基酸序列&采用
28>?N
[
>Z:X
C
4Z4
在线软
件分析
()!"#
编码的氨基酸序列的理化性质&利
用
N/
T
145>+,#NGZ\GZ
预测
()!"#
编码蛋白质的
信号肽&采用
L:6E>ND<=
在线软件预测
()!"#
的亚细胞定位情况&使用
=K
C
ZGPNGZ\GZ
预测
()5
!"#
的跨膜区&用
AGX>W:0!,"NGZ\GZ
预测
()5
!"#
基因翻译后修饰的磷酸化位点&采用
A;HQ
H540X
C
预测
()!"#
的保守结构域&利用
;DQ6N
NGZ\GZ
预测
()!"#
形成的卷曲螺旋的倾向性&利
用
ND>K?
在线软件预测
()!"#
的二级结构&利
用
K2F?$,!
软件的
AG/
T
WB:Z*c:/1/1
T
"邻位相接
法!
Ac
法#进行
!"#
的系统进化树构建!并用
H::X0XZ4
C
法"重复
#"""
次#对构建的进化树进行
评估
=:>:?
!
1*230
基因的实时荧光定量
@$A
分析
!
胚性愈伤组织,不完全胚性紧实结构,球形胚,心形
胚,鱼雷形胚,子叶胚及经激素处理的胚性愈伤组织
的总
的提取方法同
#,!,#
&采用
NUH<28*
N9Z/
C
X
=K试剂盒"
=?J?公司#反转录合成
9@*
A?
第一链!用于
()!"#
基因的荧光定量分析!具
体步骤参见试剂盒使用说明以
&CD5+.
,
&D5#.
和
D#(
基因作为内参基因!以引物
!"#*
^
E
,
!"#*
^
<
"表
#
#进行实时荧光定量
>;<
!采用三步法!将
不同发育阶段的龙眼体胚
9@A?
模板混样进行
$
倍梯度系列稀释制作标曲!处理样品
9@A?
模板稀
释
#$
倍后进行荧光定量
>;<
!
%
次重复!具体的反
应体系及扩增程序参照
6/1
等*#&+最终获得的数
据利用公式
!
(
#$及
289G5
,
T
GAD"
\GZ0/:1%,
$
#
*
#
+软件进行分析
!
!
结果与分析
>:=
!
1*230
基因
/BC7
全长与
BC7
序列的克隆
以合成的龙眼混合样的全长
9@A?
第一链为
模板!以引物
!"#*E#
%
!"#*<#
进行
>;<
扩增获
得了预期的
#%-B
C
保守序列&以引物
!"#*%>
%
%>
!
!"#*%A>
%
%A>
进行巢式
>;<
!扩增获得
))+B
C
%b
端序列!包括
#$"B
C
%b*M=<
"含
C
:5
[
?
#&以引物
!"#*$>
%
$>
!
!"#*$A>
%
$A>
进行巢式
>;<
!扩增
获得
!$%B
C
的
$b
端序列!包括
#"!B
C
的
$b*M=<

利用
@A?K?A-,"
将获得的
%
段序列进行拼接!
龙眼
!"#
基因
9@A?
序列全长
###"B
C
!经
A;HQ
的
FG1H41I
数据库在线
H540X1
!结果显示与其他物
种的
!"#
基因一致性较高!初步推断扩增得到的
三段序列为龙眼
!"#
基因的序列以设计的全长
!&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
扩增引物
!"#*E!
和
!"#*进行
>;<
扩增!获
得
&-)B
C
的目的序列!与拼接结果相同!均包含完
整的开放阅读框&将该转录本的核苷酸序列在
A;*
HQ
的
FG1H41I
数据库中进行在线
H540X1
分析!结
果显示该序列与其他物种的
!"#
基因同源性较
高!其中与脐橙"
$*?/122*3E32*2
!
2M"%!$%%
#,蓖麻
"
F*-*312-,++13*2
!
_K""!$%"-&
#和葡萄"
;*?*2
G*3*
H
E/.
!
_K""!!--!&)
#的一致性分别为
)"`
,
)"`
和
&%`
!由此认为扩增得到龙眼
!"#
基因的
9@A?
全长序列!将其命名为
()!"#
"
FG1H41I
登
录号为
JK"#)$"-
#以龙眼胚性愈伤组织
@A?
为模板!以全长引物扩增获得
#&"$B
C
的
@A?
序
列!与
9@A?
序列比对表明!其包含
!
个内含子和
%
个外显子
>:>
!
1*230
基因的生物信息学分析
利用
@A?K?A-,"
和
D分析!龙眼
()!"#
基因
9@A?
全长
###"B
C
!包括
#"!B
C
的
$b*M=<
,
#$"B
C
的
%b*M=<
"含
C
:5
[
?
#和
&$&B
C
的
开放阅读框!共编码
!&$
个氨基酸!起始密码子为
?=F
!终止密码子为
=?F
利用
28>?N
[
>Z:X*
C
4Z4
,
N/
T
145>+,#NGZ\GZ
和
=K
C
ZGPNGZ\GZ
在线软
件对
()!"#
编码的氨基酸序列进行分析!结果显
示$该蛋白分子式为
;
#%-&
O
!"-
A
%#
D
+$%
N
##
!分子量为
%#$%,+@4
!理论等电点
$,-&
!不稳定系数为
+,-"
!总平均疏水性为
(",&)%
!不具有信号肽!在
#-
%
##
位置间存在一个长度
!%B
C
,由内向外的
跨膜螺旋!分值为
--"
!由此推测该蛋白为不稳定亲
水酸性跨膜蛋白!且不属于分泌型蛋白使用
L:6E>ND<=
在线软件预测
@5LMN
的亚细胞定
位!结果显示$
@5LMN
定位于细胞核的可能性最
大用
AGX>W:0!,"NGZ\GZ
对
()!"#
基因翻译后
修饰预测!结果显示$该蛋白具有
!%
个磷酸化位点
"
NGZ#-
!
=WZ%
!
=
[
Z+
#
LMN
属于同源异型结构域"
W:3G:P:34/1
#蛋
白超级家族!通过
A;HQH540X
C
预测龙眼
@5LMN
的保守结构域!结果表明!龙眼
@5LMN
具有
O:3G*
:P:34/1
结构域!在肽链的第
!-
%
!
位氨基酸间
"图
#
#利用
;DQ6NNGZ\GZ
对
@5LMN
形成的卷曲
螺旋的倾向性进行预测!结果表明
@5LMN
在
!""
%
!$"
位氨基酸间极易形成卷曲螺旋利用
ND>K?
在线软件对
@5LMN
进行二级结构预测!结果表明$
@5LMN
的二级结构由
!"`
$
*
螺旋,
%,#-`
&
*
转角,
#",#&`
延伸链和
--,-)`
无规则卷曲组成为了
更全面的了解
()!"#
编码的蛋白的特性!利用
@A?K?A-,"
将其与其他物种该蛋白进行多重比
对!发现
()!"#
具有
LMN
转录因子的保守序列$
LMNB:8
和
2?<*5/IG
位点"图
!
#!进一步表明
()5
!"#
属于典型的
!"#
转录因子
>:?
!
1*230
基因编码的蛋白同源性及进化分析
将龙眼
()!"#
基因推导的氨基酸序列经
A;*
HQH540X
C
比对分析发现!
@5LMN
与大豆"
@)
A
-*3E
+.I
#,蓖麻"
F*-*312-,++13*26,
#,脐橙"
$*?/12
2*3E32*2
#的同源性相对较高!分别在
$&`
,
-#`
和
$-`
为了进一步了解龙眼
@5LMN
的进化关系!
本研究选择经
A;HQH540X
C
比对!与
@5LMN
同源
性较高的
#%
种植物!采用
K2F?$,!
中的
A*c
法
构建系统进化树"图
%
#结果表明!根据种属关系!
LMN
可分为两大类!单子叶植物聚为一类!双子叶
植物聚为一类!而龙眼与脐橙的亲缘关系最近!聚在
一个分支内
>:D
!
龙眼
1*230
在不同体胚阶段中的表达分析
采用实时荧光定量
>;<
分析
()!"#
在龙眼
胚性愈伤组织,不完全胚性紧实结构,球形胚,心形
胚,鱼雷形胚和子叶胚共
-
个阶段的相对表达结
果"图
+
!
?
#表明!虽然
()!"#
在这
-
个阶段均有
响应!但是
()!"#
在胚胎发育早期"胚性愈伤组织
和不完全胚性紧实结构#的相对表达量很低!而在球
形胚时期的表达量达到最高!说明龙眼体细胞胚胎
图
#
!
()!"#
的保守结构域
E/
T
,#
!
=WG9:10GZ\GPP:34/1:Y()!"#
%&
$
期
!!!!!!!!!!!
张冬敏!等$龙眼体细胞胚胎发生过程中
()!"#
的克隆与表达分析
图
!
!
()!"#
与其他物种
!"#
基因编码的氨基酸的多重比对
图中物种名称按顺序分别为$龙眼!大豆!脐橙!梅!烟草!葡萄!苜蓿!莲!毛白杨&
O:3G:P:34/1
,
LMNB:8
与
2?<*5/IG
是
LMN
的保守结构域
E/
T
,!
!
?5/
T
13G1X:Y43/1:49/P0G
^
VG19G0:Y()!"#]/XW!"#YZ:3:XWGZ0
C
G9/G0
?B:\GXWG0
C
G9/G0143G499:ZP/1
T
X:XWG:ZPGZ
$
(*+,-./
0
12),3
4
.3
!
@)
A
-*3E+.I
!
$*?/122*3E32*2
!
J/1312+1+E
!
K*-,?*.3.2
A
)GE2?/*2
!
;*?*2G*3*
H
E/.
!
7E>*-.
4
,?/13-.?1).
!
KE)1+=,31-*
H
E/.
!
J,
0
1)12?,+E3?,2.
&!
ZG0
C
G9X/\G5
[
&
O:3G:P:34/1
!
LMNB:841P2?<*5/IG4ZGXWG9:10GZ\4X/\GP:34/1:YLMN
发生过程中!
()!"#
主要在球形胚时期表达
>:E
!
龙眼
1*230
在不同激素"
377
%
F7
?
%
87
#浓度
处理下的表达分析
植物激素在植物生长发育过程中扮演了重要角
色!参与调节植物生命活动的许多环节!为了了解
Q??
,
N?
和
F?
%
对龙眼
()!"#
表达的影响!利用
实时荧光定量
>;<
技术分析了不同激素浓度处理
后
()!"#
表达的变化结果表明$在设置的
+
个
Q??
浓度梯度内!与对照相比!
()!"#
基因的表达
均有所提高!并且当外源施加
Q??
浓度达到
#,"
3
T
%
6
时!
()!"#
的相对表达量增加显著"图
+
!
H
#经不同
F?
%
浓度处理后!当
F?
%
浓度小于等
于
#!3
T
%
6
时!
F?
%
可促进
()!"#
的表达!并且
在
#!3
T
%
6
时!促进效果最明显&而当外源施加的
F?
%
浓度达到
!$3
T
%
6
时!对
()!"#
表达的促进
作用消失"图
+
!
;
#经不同
N?
浓度处理后!与对
照相比!低浓度"
#
$"
"
3:5
%
6
#
N?
处理的龙眼胚性
愈伤组织中
()!"#
的表达量明显下降!而当
N?
浓度达到
#""
"
3:5
%
6
时!相对于对照组!
()!"#
的表达量略高"图
+
!
@
#
图
%
!
LMN
系统进化树
图中分支点的数字表示
H::X0XZ4
C
验证中基于
#"""
次重复该节点可信度
E/
T
,%
!
>W
[
5:
T
G1GX/9XZGG:YLMN
=WG1V3BGZ4XXWG1:PG0ZG
C
ZG0G1X0XWGZG5/4B/5/X
[
C
GZ9G1X:YB::X0XZ4
C
\45VG0B40GP:1#"""ZG
C
5/94X/:10
+&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
+
!
()!"#
在龙眼体细胞胚胎发生过程及不同激素"
Q??
,
F?
%
,
N?
#处理下的相对表达
?,
龙眼体细胞胚胎发生过程
()!"#3的相对表达$
#,
胚性愈伤组织&
!,
不完全胚性紧实结构&
%,
球形胚&
+,
心形胚&
$,
鱼雷形胚&
-,
子叶胚&
H,
外源
Q??
处理&
;,
外源
F?
%
处理&
@,
外源
N?
处理
E/
T
,+
!
C
ZG00/:10:Y()!"#4XP/YYGZG1X0X4
T
G0:Y5:1
T
41N241PP/YYGZG1X9:19G1XZ4X/:10:YQ??
%
F?
%
%
N?
?,C
ZG00/:10:Y()!"#4XP/YYGZG1X0X4
T
G0:Y5:1
T
41N2
"
#,=WGYZ/4B5G*G3BZ
[
:
T
G1/9945V0
&
!,Q19:3
C
5GZG9:3
C
49X
C
Z:*G3BZ
[
:
T
G1/99V5XVZG0
&
%,F5:BV54ZG3BZ
[
:0
&
+,OG4ZXG3BZ
[
:0
&
$,=:Z
C
GP:G3BZ
[
:0
&
-,;:X
[
5GP:14Z
[
G3BZ
[
:0
#&
H,@/YYGZG1X9:19G1XZ4X/:10:YQ??
&
;,@/YYGZG1X9:19G1XZ4X/:10:YF?
%
&
@,@/YYGZG1X9:19G1XZ4X/:10:YN?
%
!
讨
!
论
?:=
!
1*230
参与龙眼体细胞胚胎发生并调控体细
胞胚胎发育后期的形态建成
生物信息学分析表明$
()!"#
编码的蛋白具
有
!"#
转录因子特有的保守序列
LMNB:8
和
2?<*5/IG
位点!其都属于抑制型结构域!在
!"#
基
因中
LMNB:8
发挥主要作用!缺失
LMNB:8
的突
变体植株丧失了异位表达
!"#
形成体细胞胚胎的
功能*!"+另外
SW41
T
等*!#+在拟南芥,水稻等植物
!69
家族基因的研究中发现!
LMNB:8
是
!69
家族中对植物分生组织具有调控作用的成员特有的
序列!由此推断龙眼
()!"#
基因可能在诱导植物
形成体细胞胚中发挥作用!并且参与植物分生组织
的调控
在拟南芥的研究中发现!
!"#
最早在
#-*
细胞
早期球形胚时期开始表达*#"!!*!%+!而
$;%
的表达
则稍晚于
!"#
!在心形胚时期才开始表达*!+*!-+本
研究对
()!"#
进行实时荧光定量
>;<
分析结果
表明!在龙眼体细胞胚胎发生过程中!虽然
()!"#
在体细胞胚胎发生
-
个阶段中均有反应!但除了在
球形胚时期其转录水平较高外!其他
$
个阶段其转
录水平都较低!说明在体细胞胚胎发生过程中
()5
!"#
主要在球形胚时期发挥作用!并影响后期体胚
的形态建成陈春玲等*!)+研究发现!在龙眼体细胞
胚胎发生过程中!
!
源
Q??
主要在胚性愈伤组织和
球形胚时期累积!但由于
>QA#
蛋白在球形胚时期
才开始表达促发生长素的极性运输*#!&+!而
!"#
的表达受生长素浓度梯度的调控!因此推测在球形
胚时期!
>QA#
蛋白的极性定位促使
Q??
极性运输
并呈梯度分布进而诱导了
!"#
的表达!而
!"#
基
因的表达又启动了
$;%
基因的表达!由于
$;%
与
!"#
间的负反馈调节作用!使得体胚发育后期
()!"#
的表达维持在一个相对稳定的状态!并且
推测在龙眼心形胚时期很可能有干细胞的形成!即
开始形成胚根,胚芽原基
?:>
!
外源激素影响龙眼
1*230
的表达
?:>:=
!
外源
377
改变
1*230
的表达
!
生长素是
植物生长发育所必须的
!
源激素!也是目前已知的
可以调控植物干细胞的外源信号*!+生长素浓度
梯度与
>QA#
蛋白对生长素极性运输的调控对诱导
!"#
表达和体细胞胚胎发生至关重要*%"+
>QA0
蛋白的极性定位影响生长素的区域分布!同时区域
性的施加生长素也能诱导
>QA0
蛋白的表达!改变
>QA0
蛋白的极性定位*%"*%%+在
>QA#
蛋白介导下!
植物体内的生长素进行极性运输!形成生长素浓度
$&
$
期
!!!!!!!!!!!
张冬敏!等$龙眼体细胞胚胎发生过程中
()!"#
的克隆与表达分析
梯度!在生长素浓度梯度的特定区域!诱导
!"#
的
表达!进而诱导形成体细胞胚*#!%+*%$+
!"#
的表达
需要特定的生长素浓度!在这个临界值范围内!外源
生长素诱导了
!"#
的表达!因而确定外源生长素
施加的浓度范围显得尤其重要在本试验中!不同
浓度的外源
Q??
处理后!相较于对照!龙眼胚性愈
伤组织中
()!"#
的表达量明显有所提高!并且在
外源施加
Q??
浓度为
#,"3
T
%
6
时表达量达到峰
值!是对照的
%$
倍左右由此推测!在龙眼体细胞
胚胎发生过程中!外源
Q??
诱导
>QA#
蛋白极性重
建!生长素浓度梯度重新分配!从而促进了
()!"#
的表达!并且很有可能外源施加
Q??
的浓度在
#,"
3
T
%
6
左右是诱导
()!"#
表达的一个临界点
?:>:>
!
外源施加低浓度
F7
?
促进
1*230
的表达
!
赤霉素是植物生长发育过程中的一种重要激素!
参与植物生命周期中的多个生物过程!包括种子萌
发!茎的生长等*%-+在本试验中!经不同浓度的外
源
F?
%
处理后!
()!"#
的表达相较于对照有所提
高!并且在外源施加
F?
%
浓度达到
#!3
T
%
6
时达
到峰值!是对照的
!,$
倍左右!说明
()!"#
对外源
施加赤霉素有积极的响应!并且
()!"#@A?
的内
含子中含有赤霉素应答元件
>*B:8
!由此初步推断
外源施加低浓度的
F?
%
可以促进
()!"#
的表达!
进而在植物体细胞胚胎发生过程中发挥作用
?:>:?
!
外源施加低浓度
87
抑制
1*230
的表达
!
水杨酸作为一种广泛存在于植物体内的一种
!
源信
号分子!是提高植物抗逆性的重要激素之一!在外源
施加一定浓度范围内对诱导植物体细胞胚也有促进
作用!但是不同的植物需要的诱导浓度不同
O:0*
0G/1/
等*%)+的研究认为外源施加低浓度的
N?
可促
进胡萝卜体细胞胚的形成!而高浓度的
N?
则抑制
体细胞胚的形成&在
6V:
等*%&+对沙打旺进行研究时
发现!当外源施加
N?#$"
"
3:5
%
6
时!其体细胞胚
胎发生频率最高本试验结果表明!在外源施加
N?
浓度低于
#""
"
3:5
%
6
时!
()!"#
的表达量都
受到不同程度的抑制!并且在
$"
"
3:5
%
6
时抑制效
果最明显!这与匡华琴*%+的研究认为外源水杨酸抑
制
!"#
表达的结论基本相符!而当外源施加
N?
浓
度达到
#""
"
3:5
%
6
时!
()!"#
的表达量相对于对
照略有提高初步推测!在龙眼体细胞胚胎发生过
程中!外源施加低浓度的
N?
抑制了
()!"#
的表
达!进而对龙眼体胚的生长发育进行调控!而外源施
加较高浓度的
N?
对
()!"#
是否有促进作用还有
待进一步的试验证明
参考文献!
*
#
+
!
刘玉博
,
细胞分裂素和生长素调控拟南芥体细胞胚根端分生组织建立的分子基础*
@
+
,
山东安泰$山东农业大学!
"##,
*
!
+
!
JQ2EE2!
N=2!
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