全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
!"#$)"$)!
作者简介$马晓菲"
#011(
#!女!在读硕士研究生!主要从事植物遗传与生物技术方面的研究
2)34-5
$
6
7
,
-/
6
5-/
6
*11
!
#&%*893
"
通信作者$于元杰!硕士!教授!硕士生导师!主要从事植物生物技术及其在育种上的应用研究
2)34-5
$
:
74/
,:!
.;47*<;7*8/
高皂苷轮叶党参
$%&
诱变突变体研究
马晓菲!唐玉倩!于元杰"
"作物生物学国家重点实验室!山东农业大学 农学院!山东泰安
!+#"#1
#
摘
!
要$以轮叶党参为材料!采用甲基磺酸乙酯"
2=>
#处理离体叶片和愈伤组织对轮叶党参进行诱变!选择最佳诱
变组合!并对诱变再生群体进行遗传分析结果表明$"
#
#轮叶党参叶片和愈伤组织经
2=>
处理的存活率和分化
率均低于对照!并且随
2=>
浓度的升高和处理时间的延长而下降"
!
#叶片和愈伤组织的致死处理组合分别是
"*$?2=>
处理
$@
和
"*%?2=>
处理
$@
!半致死组合分别为
"*%?2=>
处理
!@
和
"*!?2=>
处理
!@
!愈伤
组织是
2=>
诱变轮叶党参的的最佳材料"
%
#筛选出的
&
号变异株皂苷含量为
*"
6
%
6
!较对照平均值提高了
*$1?
"
$
#对诱变再生苗进行遗传分析!
1
个特异引物对
#"
个供试材料共扩增出
0
条带!具有多态性的谱带数
为
$$
条!占
+$*&?
材料间的相似系数变化范围
"*$%
"
"*0#!
!其中
%
号(
+
号株与其他
1
株达到了品种间遗传差
异研究认为!
2=>
处理可应用于轮叶党参无性变异系的诱变!
%
号(
&
号(
+
号植株为诱变产生的具有较高皂苷含
量的初选植株
关键词$轮叶党参&甲基磺酸乙酯&突变体&皂苷
中图分类号$
A1#%*
&
A+10
文献标志码$
B
#
(
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+
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2
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6
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Q
9/-/
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轮叶党参*
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&&()$*+"(),)
"
>-#
EO47S*
+又名山海螺(四叶参(山胡萝卜等!是桔梗科
多年生草本植物!珍贵的山野菜种中药材以根入
药!有清热解毒(补虚通乳(养阴润肺及祛痰之功
效*#+轮叶党参含黄酮类(生物碱(挥发油等多种药
用有效成分!研究表明!轮叶党参皂苷对二乙基亚硝
胺致小鼠肝细胞
YFB
损伤有一定的保护作用*!+!
对人肝癌
Z<
Q
G)!
细胞的生长具有抑制作用*%+此
外!轮叶党参还具有延缓衰老!降血脂!提高机体免
疫力等作用*$)&+!又因其富含维生素(氨基酸(微量元
素等营养成分!药食同源!可加工成果脯!低盐制品!
保健饮料等!风味鲜美独特!是中国出口韩国(日本(
美国的山菜之王
近年来!生态环境恶化导致野生党参产量和质量
下降明显!利用体细胞无性系变异与组织培养相结合
的方法来增加党参植物有效成分含量!提高党参品质
日益引起人们的重视甲基磺酸乙酯"
2=>
#!是目前
运用范围最广也是最为有效的诱变剂!与其它诱变
剂相比!
2=>
诱变产生的突变频率高!且多为显性
突变体!易于筛选赵天祥等*++利用
2=>
诱变构
建出小麦
2=>
突变体库!变异类型丰富!特别是发
现了自然突变中少见的变异类型由继红等*1+用
2=>
处理紫花苜蓿愈伤组织!获得抗寒性突变体
张秀省等*0+报道利用
2=>
处理长春花愈伤组织发
现愈伤组织发生了变异!不仅生长快!且吲哚总碱含
量高本研究结合前人工作!在获得轮叶党参组织
培养体系的基础上!对其外植体和愈伤组织分别进
行
2=>
诱变!探索遗传改良的有效方法!以期获得
皂苷含量较高的优良变异植株!为党参植物的品种
改良及开发利用提供参考和技术支持
#
!
材料和方法
;*;
!
试材及取样
试验用轮叶党参材料采自山东农业大学中药
园!取同一单株上的叶片!于
$
"

月份采集材料
;*<
!
试验方法
;=<=;
!
$%&
处理离体叶片
!
取
"*#395
%
M
(
Q
Z
+*"
的磷酸缓冲液!高压灭菌!与
2=>
原液配成的
不同浓度的
2=>
处理液 "
"?
(
"*#?
(
"*!?
(
"*%?
(
"*$?
#叶片切成约
"*83
!
!消毒后置
2=>
处理液中分别浸泡
"*
(
#*"
(
!*"
和
$*"@
!无
菌水冲洗
%
"

遍!接种于诱导培养基"
=>W"*
3
6
%
M!
!
$)YW"*3
6
%
M&)RBW#*"3
6
%
MLE
#
共
!"
个处理!每处理

瓶!每瓶
#"
个外植体暗培
养
#;
后移至光下培养每
%;
继代
#
次!培养基
"
=>W"*3
6
%
M&)RBW"*+3
6
%
MFBB
#
!;
后转至分化培养基"
#
%
!=>W"*3
6
%
M&)RBW"*!
3
6
%
MFBB
#
";
后统计存活率和分化率
存活率"
?
#
[
存活块数%接种总块数
\#""?
分化率"
?
#
[
分化出芽愈伤块数%接种愈伤总
块数
\#""?
;=<=<
!
$%&
处理愈伤组织
!
用轮叶党参叶片诱导
愈伤组织!选取继代培养
#
"
!";
的愈伤组织!于
不同浓度的
2=>
处理液 "
"?
(
"*#?
(
"*!?
(
"*%?
(
"*$?
#中分别浸泡
"*
(
#*"
(
#*
和
!*"@
"期
间置于摇床上以
&"O
%
3-/
不停摇动#!无菌水冲洗!
接种于分化培养基"
#
%
!=>W"*3
6
%
M&)RBW"*!
3
6
%
MFBB
#每处理

瓶!每瓶
#"
块愈伤组织
接种
";
后统计愈伤组织的存活率和分化率
;*<*>
!
根的诱导
!
不定芽继代
%
次后进行生根诱
导!根诱导培养基
#
%
!=>W"*!3
6
%
M]BBW"*!
3
6
%
MFBB

%";
后统计生根率
生根率"
?
#
[
生根苗数%接种数
\#""?
;*<*?
!
炼苗移栽
!
试管苗根系长达
%
"
83
!并且
长出侧根!苗高达
$83
时!进行炼苗移栽移栽基
质为腐殖土
^
蛭石
^
河沙"
#^ #^ #
#取最佳诱变
条件下所得生长健壮的处理苗
!"
株与健康对照苗
!"
株炼苗移栽!
%";
后统计移栽成活率
;*<*@
!
皂苷含量的测定
!
!
#
"轮叶党参皂苷的提取
!
用筛选出的
2=>
适宜浓度和时间组合再分别对
各离体组织进行批量处理!将再生植株转入生根培
养基中扩繁
!
代并培养
&";
!选取扩繁后长势良好(
生根粗壮的再生苗和对照的根各

个!测定根中皂
苷的含量
将鲜根洗净!烘干!用研钵磨碎成粉末取粉末
"过
%
号筛#约
!
6
!精密称定!精密加入甲醇
#""
3M
!称重!放置过夜!加热回流
!@
!放冷!用甲醇补
失重!过滤!精密量取续滤液
"3M
!蒸干!残渣加甲
醇溶解!转移至
3M
量瓶中!并稀释至刻度!摇匀!
"*$
#
3
微孔滤膜滤过!取续滤液!即得到轮叶党参
供试品溶液
!"皂苷含量的测定
!$
标准品溶液的配制
精密称取轮叶党参皂苷标准品适量!加甲醇溶解制
成每
#3M
含轮叶党参皂苷
"*10&3
6
的标准品溶
液
%
采用
_`)Z` MP
法色谱条件$色谱柱
Y-4)
39/.-5)P#
"
1!"33\$*&33
!

#
3
#&流动相为乙
腈
)"*#?
甲酸"
%%^ &+
#&流速
#*"3M
,
3-/
(#
&检测
波长
!"+/3
&柱温
%"a
&进样量
#"
#
M

&
标准曲
线的绘制分别精密吸取标准品溶液
!*"
(
*"
(
#"*"
(
#*"
(
!"*"
#
M
!注入
Z` MP
仪中!按上述色谱
条件测定峰面积以峰面积积分值"
.
#为纵坐标!
进样量"
/
!
#
6
#为横坐标!制备标准曲线!得回归方
程为
.
[1-$\#"

/(*01\#"
%
"
0["*0&++
#结
果表明!轮叶党参皂苷进样量在
#*+0!
"
#+*0!
#
6
&!##
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系
;=<=A
!
诱变再生群体的
B7CD
分析
!
采用
PEBR
法提取基因组
YFB
总反应液以
!
#
M
为基本单
位!模板
YFB
浓度稀释
#"
倍
反应体系为
#"\N7DD#
M
!
=
6
!W
"
!*
3395
%
M
#
*!
#
M
!
;FE`
"
!*3395
%
M
#
#
M
!
1)
2
酶
"*!
#
M
!
O`-3"
!"/
6
%
#
M
#
!
#
M
!
YFB
"
%"/
6
%
#
M
#
!
#
M
!
;;Z
!
b#&*#
#
M
反应程序为
0$a
预变性

3-/
!
0$a
变性
#3-/
!
$"a
退火
#3-/
!
+!a
延伸
#
3-/
!
$"
个循环后
+!a
延伸
#"3-/

试验采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物制备
#?
琼脂凝胶!电泳缓冲液为
#\ER2
!电泳电压为
#""c
!电泳约
#3-/
采用
2R
染色!由凝胶成像
系统拍照保存
;*<*E
!
数据分析
!
采用
Y` >!"""
数据处理软件对
统计数据进行方差分析!比较差异显著性
根据电泳图谱!将观测到的每一条带视为一个
性状!把有带的量化为
#
!无带的量化为
"
!数据输入
计算机标准化处理利用
FE>H>` P!#)!
软件进行
数据的遗传分析!计算各株间的遗传相似系数"
3
>
#
和遗传距离指数"
4
#
!
!
结果与分析
<=;
!
$%&
处理对轮叶党参离体叶片和愈伤组织的
影响
经
2=>
处理过的叶片和愈伤较对照颜色变
褐(质地变软(失去光泽"图
#
!
B
(
R
#!存活率和再生
率均低于对照"表
#
#
在
"*#? 2=>W"*@
处理的所有组合中!叶
片的存活率达到
#""?
!但当处理组合达到
"*%?
2=>W!@
时!叶片的存活率仅为
$&*+?
因此!
"*$?2=>W$@
是离体叶片的致死处理组合!
"*%?2=>W!@
是离体叶片的半致死处理组合
同理!愈伤组织的致死剂量是
"*%?W$@
!半致死
处理组合为
"*!?W!@
与叶片相比!愈伤组织对
2=>
处理更敏感
随着
2=>
浓度的增大!
2=>
对存活率的影响
较对分化率的影响大以叶片为例!在
2=>
浓度
从
"*#?
上升到
"*$?
的过程中!叶片的分化率降低
为
$"?
左右!而存活率降低了约
&"?

2=>
处理时间对存活率的影响也比对分化率
的影响大在
2=>
处理时间从
"*@
增至
$@
的
过程中!愈伤存活率从
+"*"?
减至
#+*?
!降低率
为
!*?
!而分化率降低约
%*0?
可见相对于分
化率!
2=>
抑制离体叶片和愈伤的存活作用更强
<*<
!
不同处理对再生苗生根的影响
再生苗接种到生根培养基
#;
后!芽基部开始
产生白色小突起!然后长成具有浓密根毛的白色根
"图
#
!
P
#!
$;
后生根趋于稳定
2=>
处理会显著降低丛生芽的生根率"表
!
#!
轮叶党参离体叶片和愈伤组织在半致死浓度下均成
功生根!说明本实验中
2=>
的半致死浓度可以作
为诱变浓度同时在
2=>
处理离体叶片和愈伤组
织的半致死组合下!愈伤组织的生根率为
#!*%?
!
高于叶片生根率"
0*1?
#!因此!轮叶党参愈伤组织
更适宜用做
2=>
的诱变处理材料!
"*!?2=>
处理
愈伤组织
!@
是
2=>
诱导轮叶党参的上限处理
组合
<*>
!
炼苗移栽
2=>
处理获得的大部分处理苗较对照生长缓
慢但是部分处理苗表现出较好的形态特征!主要
表现在叶片颜色深!茎叶较为粗壮"图
#
!
Y
#
分别对
!"
株处理苗和对照苗统计移栽成活率
在适宜移栽条件下对照的移栽成活率可达到
1?
!
而经过
2=>
处理所得幼苗成活率只有
$?
"表
%
#!
可见
2=>
处理降低了幼苗移栽成活率
<*?
!
变异体获得及皂苷含量的测定
2=>
处理获得的材料中存在长势较对照苗旺
图
#
!
轮叶党参离体叶片和愈伤组织的诱变与组织培养
B*
正常叶片愈伤组织&
R*2=>
处理后的叶片形成愈伤组织&
P*
再生苗生根&
Y*
诱变苗"左#与正常苗"右#
T-
6
*#
!
P457.-/;78K-9/DO935<4S<.4/;O<
6
B*F9O3458457.9D5<4S<.
&
R*P457.9D5<4S<.-/;78<;N
:
2=>
&
P*_99K<;
Q
54/K5&
Y*E@Q
54/K
"
5#
4/;K@Q
54/K
"
O-
6
@K
#
+!##
&
期
!!!!!!!!!!!!!!
马晓菲!等$高皂苷轮叶党参
2=>
诱变突变体研究
表
;
!
$%&
对轮叶党参离体叶片和愈伤组织再生的影响
E4N5<#
!
2DD<8K.9D2=>9/O<
6
外植体
2d
Q
54/K
项目
]K<3
2=>
浓度
2=>89/8%
?
2=>
处理时间
EO<4K3%
@
"* #*" !*" $*"
平均
BS6
<
离体叶片
M<4D
存活率
>7OS-S45O4K<
%
?
"
"
PL
#
#""*" #""*" #""*" #""*" #""*"
"*# #""*" #""*" #""*" #""*" #""*"4
"*! #""*" #""*" 1%*% +"*" 11*%N
"*% #""*" +"*" $&*+ #"*" &*+8
"*$ #""*" &"*" #%*% "*" $%*%;
平均
BS6
< #""*"4 1!*N &"*18 $*";
分化率
Y-DD%
?
"
"
PL
#
1%*% 1"*" +&*+ &&*+ +&*+
"*# &"*" %*% "*" $"*" "*14
"*! %*% $&*+ %!*" #$*% %&*&N
"*% $"*" !1*& #$*% "*" !"*+8
"*$ %+*% "*" "*" "*" 0*%;
平均
BS6
< $+*+4 %!*!N !"*#8 #%*&;
愈伤组织
P457.
存活率
>7OS-S45O4K<
%
?
"
"
PL
#
#""*" #""*" #""*" #""*" #""*"
"*# 0"*" 1&*+ &+*+ "*" +%*&4
"*! 1&*+ +"*" "*" !"*" &*+N
"*% &&*+ $&*+ !&*+ "*" %*"8
"*$ %&*+ #$*% #"*" "*" #*%;
平均
BS6
< +"*"4 $*$N %1*&8 #+*;
分化率
Y-DD%
?
"
"
PL
#
1&* 1%*% 1"*" +%*% 1"*1
"*# *+ $!*% !*" &*+ %!*$4
"*! $&*! !1*& #%*% "*" !!*"N
"*% #*" &*+ "*" "*" *$8
"*$ %*% "*" "*" "*" "*1;
平均
BS6
< %+*&4 #0*$N 0*&8 #*+;
!!
注$数值后的小写字母表示不同处理间
"*"
水平下差异显著&下同
F9K<
$
Y-DD6
/-D-84/K;-DD表
<
!
不同
$%&
浓度(不同时间处理的再生芽生根率
E4N5!
_99K-/
6
O4K<9DO<
6
4/;KO<4K3处理时间
EO<4K3K-3<
%
@
离体叶片再生芽生根率
_99K-/
6
O4K<9D5<4S<.
%
?
PL "*# "*! "*% "*$
愈伤组织再生芽生根率
_99K-/
6
O4K<9D8457.
%
?
PL "*# "*! "*% "*$
"* 11*" +!*! &*% !*" 0*# 11* &&*+ $#*& #&*+ "*"
#*" 1%*% &!* %*+ #$*+ "*" 1$*" %&*$ !*" 1*+ "*"
!*" +1*% $&*+ !&*0 0*1 "*" +0*! !*" #!*% "*" "*"
$*" +"*" !*" #!*% "*" "*" &1*! "*" "*" "*" "*"
盛的再生植株!主要表现在生根多且主根粗壮&茎叶
长势旺盛!而且常伴随着茎叶肥厚(颜色偏重对其
中表现较为突出的
#"
株"包括离体叶片诱导形成的

株及愈伤组织诱导形成的

株#和
!
组对照测定
根中皂苷的含量
组培过程对轮叶党参皂苷含量影响不明显!对
照组皂苷含量平均值为
$*+013
6
%
6
"表
$
#经
2=>
处理后获得的轮叶党参再生植株!皂苷含量变
化差异显著!变化幅度为
"*""#
"
"*%+!3
6
%
6

%
号!
&
号!
+
号的皂苷含量均高于对照平均值!其中
&
表
>
!
$%&
处理苗与对照苗移栽成活率的比较
E4N5<%
!
>7OS-S45O4K<89/KO4.KNQ
O98<..<;
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6
.N
:
2=>4/;89/KO95
项目
]K<3
对照
P9/KO95
诱变处理
=7K4
6
移栽株数
F9*9D
Q
54/K5成活数
F9*9D.7OS-S<;
Q
54/K5成活率
_4K<9D.7OS-S<;
Q
54/K5号植株皂苷含量为
*"
6
%
6
!较对照平均值提高
了
*$1?
!说明
2=>
处理离体叶片和愈伤组织是
诱导轮叶党参产生皂苷含量变异的有效途径
1!##
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
<=@
!
诱变再生苗
B7CD
分析
用
!""
个随机引物对上述
#"
株组培苗进行
P`_
扩增!筛选出
1
条带纹清晰(具有多态性的引
物"表

#
1
个特异引物对
#"
个供试材料扩增出
表
?
!
$%&
处理组的皂苷含量
E4N5<$
!
P9/KQ
9/-/9DKO<4K36
O97
Q
.
外植体
2d
Q
54/K
变异株号
F9*9DS4O-4/K
Q
54/K.
皂苷含量
P9/KQ
9/-/
%"
3
6
%
6
#
对照
P9/KO95 2=>
离体叶片
M<4D
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愈伤组织
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0 $*+0% $*1"%8;
#" $*1"# $*1"!8;
变异系数
P9表
@
!
B7CD
分析所用的引物序列及扩增谱带
E4N5<
!
O`-3:
.-.4/;-K.
Q
4KK引物
O`-3序列
><
I
7每个引物扩增谱带数
R4/;.
Q
Q
O-3具多态性的谱带数
9`5
:
39O
Q
@-8N4/;.
>"#! BGGPBGPPEG + +
>"!% GEEPEPGGBP & %
>"10 GGGBBGBPGG +
>#!& GGBEPGEPGG 1 &
>#$+ GGGEPGGPEE %
>#+ PPBPPBPGBP #" 1
>#+0 GGPGPGEEBG + &
>#0& BPBPPEGPPB 0 &
总计
E9K45 0 $$
0
条带!平均每个引物可获得扩增带
+*$
条!最少
的可扩增

条带!最多的达
#"
条其中具有多态性
的谱带数为
$$
条!占
+$*&?
由引物
>"#!
的扩增
结果"图
!
#可见!除
1
号与
#"
号株谱带大致相近
外!其他所有植株的扩增结果都不相同!说明
2=>
处理获得了很高的突变率
<*A
!
遗传相似性分析
根据扩增多态性统计!分别计算出遗传相似系
数"
3
>
#和遗传距离指数"
4
#不同材料间的遗传相
似系数在
"*$%
"
"*0#!
之间"表
&
#其中
0
号株
与
#"
号株之间相似程度最高!
#
号与
&
号相似程度
最低皂苷含量较高的
%
号(
&
号和
+
号株均表现
出与其它植株间遗传距离较大的特征!说明较高皂
苷含量和较大遗传差异之间存在必然关系
&
号株与其它
+
组间的遗传距离为
"*$%$
!而
%
号(
+
号与其它所有植株间的遗传距离达到了
"*
!
相当于品种间的遗传差异皂苷含量提高的
%
组"
%
号(
&
号(
+
号#相互间的遗传差异也较大!说明
2=>
诱变不仅可以用于选育皂苷含量高的轮叶党参新品
图
!
!
引物
>"#!
的
_B` Y
扩增结果
=*YFB34Oe&
#
"
#"*2=>
诱导的变异株
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表
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注$左下方数据为遗传相似系数!右上方数据为遗传距离指数
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期
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马晓菲!等$高皂苷轮叶党参
2=>
诱变突变体研究
种!还能产生多样的变异类型!丰富育种基础材料
综上!判断
%
号(
&
号和
+
号植株为有较高皂苷含量
的初选植株
%
!
讨
!
论
本试验中!以轮叶党参的叶片(茎段诱导愈伤组
织时!出现了愈伤褐化现象!且在
2=>
处理组培材
料后!由于
2=>
的毒副作用延缓了组培进程更加
大了褐化率!愈伤死亡率明显增加!这使得降低褐化
率成为影响实验成功的重要环节研究发现!酚类
化合物的含量与褐变现象有直接关系*#"+!而植物在
生长旺盛季节大都含有较多的酚类化合物*##+另
外!采集后的外植体接种前无菌水浸泡
!
"
%@
!接
种后
#
"
!;
转接到新鲜培养基也是控制褐变的有
效措施*#!+本试验采取春季
$
"

月份采集的外植
体!消毒过程中在无菌水中切割材料!接种
%;
后将
材料转入新鲜培养基!缩短转瓶周期的措施!对培养
物的挽救作用十分明显!是防止轮叶党参愈伤褐变
的有效手段
诱变材料的选择在诱变育种过程中占有重要地
位!通常情况下!对诱变剂敏感的材料更适用于诱变
育种研究表明!植物生殖器官的敏感性要高于营
养器官!这可能与细胞的分化程度有关不同组织
之间!分生组织的敏感性要大于成熟组织梁国平
等*#%+对红掌的不定芽和愈伤组织进行辐射诱变时!
发现愈伤组织对射线更为敏感本试验分别对轮叶
党参叶片诱导的愈伤组织以及离体叶片进行
2=>
诱变处理!结果表明!愈伤组织对
2=>
诱变剂更为
敏感!与多数研究者所得结论一致
当前!采用物理和化学诱变方法来提高植物皂
苷含量已得到广泛应用!但皂苷含量的提高率受诱
变材料及诱变方式的影响较大李波*#$+用紫外诱
变法处理苜蓿种子!产生的愈伤组织的皂苷含量高
于未处理的种子
"*%?
崔永霞等*#+对辐射诱变的
盾叶薯蓣株系进行皂苷元含量分析!得到的诱变株
皂苷元含量平均比对照株系高出
!*"?
本试验
采用
2=>
化学诱变组培材料的方法!诱导获得的
轮叶党参再生植株皂苷含量较对照提高了
*$1?
!
诱变效果处于前两者之间虽然此方法能否应用于
大规模工厂化生产有待进一步研究!但为利用无性
系变异的方法增产轮叶党参药用成分提供了证据
参考文献!
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