全 文 ： 8 海洋科学 / 2015年 / 第 39卷 / 第 1期
甲基磺酸乙酯对小新月菱形藻的生物学效应
杨茂纯, 赵耕毛, 王长海
(南京农业大学 资源与环境科学学院, 江苏省海洋生物学重点实验室, 江苏 南京 210095)
摘要: 为提高小新月菱形藻(Nitzschia closterium)的产油脂能力、获得油脂含量高的突变株, 利用甲基
磺酸乙酯(EMS)对该藻株进行了化学诱变处理, 并对其生物学作用进行了考察。结果显示, EMS对小新
月菱形藻具有较好的诱变作用, 经 0.1 mol/L 和 0.05 mol/L EMS处理后分别得到油脂生产能力较强的
突变藻株 YA和 YB, 在同等培养条件下两株突变藻单位体积细胞的内叶绿素 a、类胡萝卜素、蛋白质、
可溶性糖和油脂相对含量分别比对照组提高了 30.05%和 25.77%、22.15%和 19.26%、9.06%和 8.27%、
48.25%和 45.48%、44.06%和 12.86%。
关键词: 微藻; 小新月菱形藻(Nitzschia closterium); 诱变; 甲基磺酸乙酯; 油脂
中图分类号: S963 文献标识码: A 文章编号: 1000-3096(2015)01-0008-05
doi: 10.11759/hykx20140109001
随着地球上化石能源资源的不可逆性减少和石
化燃料燃烧带来的环境问题日趋严重, 新型生物能
源的开发备受关注。许多微藻细胞内富含脂肪酸, 与
其他生物柴油原料相比具有生长周期短、生产能力
高、不与农业竞争用地、繁殖快与油脂提取容易实
现工业化等优点[1-2] , 是开发生物能源的良好生产原
料。但到目前为止, 微藻尚很难被用于生产生物柴油,
其最主要限制性的原因之一就是缺乏含油量高、生
长快的优良藻株[3-4]。
小新月菱形藻(Nitzschia closterium)是一种海洋
真核单细胞藻类, 属硅藻门、羽蚊纲、双菱形目、菱
形藻科、菱形藻属, 是海洋生态系统中最常见的微藻
之一, 其繁殖速度快而且对环境有很好的适应能力,
细胞内含丰富的蛋白质、碳水化合物和脂肪酸, 可以
作为甲壳类、双壳类和仔鱼的饵料, 在海水养殖业中
占有重要地位[5-8]; 同时, 小新月菱形藻细胞在生长
过程中可以积累较高含量的脂肪酸, 是开发生物质
能源的潜在材料。
甲基磺酸乙酯(Ethyl Methanesulphonate, EMS)
是一种烷化剂类化学诱变剂, 其诱变机理是引起碱
基置换和移码突变[9], 与其他诱变剂相比, EMS 诱
变后产生的突变频率高 , 且多为显性突变体 , 易于
突变体的筛选[10], 是作物诱变育种中应用最广泛、
诱变效果最好的一种化学诱变剂[11]。目前有关微藻
诱变育种方面的报道多集中在螺旋藻 , 如 Riccardi
等[12]利用 EMS 诱变螺旋藻获得了抗氨基酸类似物
的突变株; 张学成等[13]利用 EMS 处理螺旋藻筛选
出了 2 株耐低温的突变株; 崔海瑞等 [14]研究发现,
经过 EMS 处理的钝顶螺旋藻在生长和形态等方面
受到了很大影响; 汪志平等[15]采用 0.6%的 EMS 和
2.4 kGy 的 60 Coγ 射线处理钝顶螺旋藻, 得到了 4
株多糖含量高的突变株。但是, 利用 EMS处理小新
月菱形藻筛选优质突变株, 尚未见报道。本研究的
目的是探索 EMS 对于小新月菱形藻细胞内各种生
化成分的影响 , 特别是对油脂含量的影响 , 探索获
得生长速度快、油脂含量高、适于生物能源开发的
优良藻株新途径。 
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 藻种
小新月菱形藻为江苏省海洋重点实验室保存藻
种 , 经本实验室分离纯化后 , 在低温光照培养箱中
保存备用。
1.1.2 培养基
采用 f/2 营养盐配方[16]配制海水培养液, 经高
温灭菌并冷却后备用。固体培养基为 f/2液体培养基
中加入 1%的琼脂。

收稿日期: 2014-01-09; 修回日期: 2014-05-23
基金项目: 国家 863计划项目(2012AA021706)
作者简介: 杨茂纯(1989-), 女 , 江苏徐州人 , 硕士研究生 , 主要从事
微藻生物技术研究, E-mail: hysfymch @126.com; 王长海, 通信作者,
博士生导师、教授 , 主要从事海洋生化工程、微藻生物技术研究 ,
E-mail: chwang@njau.edu.cn
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1.2 方法
1.2.1 EMS处理及培养条件
取对数生长期藻液 2 mL 于 5 mL 离心管内 ,
5000 r/min下离心 10 min收集藻细胞。利用不同浓
度(0.05、0.1、0.2 mol/L)的 EMS溶液分别悬浮藻细
胞, 处理 20 min, 期间, 轻轻晃动离心管使藻细胞均
匀接触 EMS。诱变后的细胞用 f/2 培养基清洗 3 次,
涂于固体培养基上, 暗适应 12 h, 待其长出藻落, 挑
选生长快, 颜色深的藻落转移到液体培养基中培养
15天。调整各组藻细胞密度使其一样, 然后放入恒
温培养箱中培养 , 温度为 (22±1)℃ , 光照强度为
3000 lx, 光暗周期为 12: 12, 每天摇瓶 3次。每隔 3
天测一次细胞数, 22 d后收集藻细胞, 测量其各代谢
物质含量, 挑选出油脂含量高的优质突变株。整个过
程设置空白对照组, 各处理组均设 3个平行样。
1.2.2 生长速率测定
每隔 3 天定时取藻液, 用“血球计数板”统计细
胞数目。
1.2.3 色素含量测定
准确吸取藻液 5 mL, 5000 r/min转速下离心 15 min,
将藻泥用 5 mL 90% (v/v)丙酮在 0~4℃下避光抽提
24 h, 将抽提液 4 000 r/min离心 15 min, 取上清液测
量 665、645、630 nm 下的吸光度。按照 Parsons[17]
所建立的方程计算叶绿素 a的含量, 公式为: 叶绿素
a(mg/L)=11.6A665 nm −0.14A630 nm −1.31A645 nm
取上清液测量 663.5、646.6、440.5 nm条件下的
吸光度。类胡萝卜素含量按照 Porra[18]所建立的公式来
计算 : 类胡萝卜素 (mg/L)=4.69A440.5 nm−4.74A646.6nm−
1.96A663.6 nm
1.2.4 可溶性糖含量测定
采用蒽酮比色法, 以烘干至恒质量的葡萄糖作标
准物。取一定体积的藻液, 5000 r/min下离心 10 min, 弃
上清液, 加入同样体积的蒸馏水, 沸水中提取 30 min,
后于 5000 r/min下离心 10 min, 吸取上清液 0.5 mL
于 20mL刻度试管中, 加 1.5 mL蒸馏水、0.5 mL蒽
酮乙酸乙酯试剂和 5 mL浓硫酸, 充分振荡, 立即将
试管放入沸水浴中, 逐管准确保 1 min, 取出后自然
冷却至室温, 以空白作对照, 在 630 nm下测吸光值,
由标准线性方程 y=0.0206x+0.0005 , R2=0.9977, 可
查出可溶性糖的含量, 再计算 1 mL藻液中可溶性糖
含量[19]。
1.2.5 蛋白质含量测定
蛋白含量试剂盒(BCA 法)购自南京建成生物工
程研究所, 蛋白质含量测定步骤按照其说明书进行。
1.2.6 油脂相对含量测定
采用尼罗红荧光标记法, 取 1 mL 藻液, 加入
250 µL DMSO(二甲基亚砜), 使其体积分数为 20%,
将混合液于超声波细胞粉碎机中破碎 20 s。向破碎混
合液中加入 15 µL尼罗红染料, 然后于 40 ℃水浴中
孵化 10 min。取 200 µL混合液用于酶标仪检测, 激
发光为 475 nm, 检测光为 570 nm[20]。
1.2.7 数据处理
结果分析取各相应数据的平均值, 用 SPSS统计
软件进行数据分析, 采用 Excel软件绘图。
2 结果与讨论
2.1 突变藻株的筛选与培养
分别利用 3 种不同浓度(0.05、0.1、0.2 mol/L)
的 EMS对小新月菱形藻进行处理, 结果发现在 EMS
为 0.2 mol/L 时小新月菱形藻细胞被 100%致死; 在
0.1 mol/L和 0.05 mol/L条件下, EMS对小新月菱形
藻细胞的致死率分别为 76%和 53%。分别利用平
板培养与小瓶培养的方法对获得的 72 株突变株
(0.05 mol/L诱变后得到 43株; 0.1 mol/L诱变后得到
29株)进行了培养, 以油脂含量为筛选目标, 从 43株
突变株中筛选得到了产油脂能力较强的 YB 突变株,
从 29 株突变株中筛选得到了产油脂能力较强的 YA
突变株。为了进一步探讨这两个突变藻株的生长情
况 , 以出发藻株为对照 , 在培养条件一致的情况下
对 YA和 YB突变株进行了培养, 结果如图 1所示。

图 1 突变藻株的培养
Fig.1 The culture of mutant YA and YB

从图 1可见, 经过 22 d的培养, 突变藻株的生长
速度和培养密度均与对照组无明显差异。赵爱娟 [21]
和张学成[13]分别利用浓度为 0.1 mol/L 的 EMS对海
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水小球藻和螺旋藻进行诱变处理, 获得的突变藻株
中 , 部分藻株生长速度加快 , 而本研究中获得的小
新月菱形藻突变藻株的生长速度并没有显著提高 ,
这可能是由于诱变的不定向引起的。可见, 当 EMS
浓度小于 0.1 mol/L时, 适合用于小新月菱形藻的诱
变育种。
2.2 突变藻株细胞中叶绿素 a 与类胡萝卜
素含量
为探讨两个突变株细胞内色素含量情况, 以出
发藻株为对照, 在培养条件一致的情况下对突变株
YA和 YB细胞内叶绿素 a和类胡萝卜素的含量进行
了测定, 结果如图 2所示。

图 2 突变藻株细胞中叶绿素 a含量与类胡萝卜素含量
Fig.2 The contents of chlorophyll a and carotenoids in
mutant cells

从图 2可见, 经过 22天的培养, 突变藻株YA和
YB 细胞中的叶绿素 a 含量分别比对照组提高了
30.05%和 25.77%, YA 与 YB 之间没有显著性差
异(P>0.05); 突变藻株 YA 和 YB 细胞中的类胡萝
卜素含量分别比对照组提高了 22.15%和 19.26%,
YA 与 YB 之间没有显著性差异(P>0.05)。上述结果
与相关研究结果类似 , 如刘晓娟等 [22]用半导体激
光辐照拟微绿球藻 , 其叶绿素积累量比对照组提
高了 86.59%; 孙延红 [23]使用浓度为 0.4%和 0.8%
的 EMS 处理雨生红球藻 , 使单细胞内类胡萝卜素
含量比对照组细胞分别提高了 76%和 90%。上述
研究结果显示 , 当微藻在受到外来条件刺激时 ,
其体内色素含量会大幅度提高 , 这很可能与微藻
自身保护机制有关 , 研究表明类胡萝卜素可以保
护植物组织因强光导致的细胞光氧化破坏 , 当微
藻处于不利条件时 , 类胡萝卜素会增加从而保护
光合系统正常工作 [18, 24]。
2.3 突变藻株细胞中蛋白质含量
为了探讨两个突变株细胞内蛋白质含量情况 ,
以出发藻株为对照, 在培养条件一致的情况下对突
变株 YA和 YB细胞内总蛋白含量进行了测定, 结果
如图 3所示。

图 3 突变藻株细胞中蛋白质含量
Fig.3 The content of proteins in mutant cells

从图 3可见, 突变株 YA和 YB细胞中的蛋白质
含量分别比对照组提高了 9.06%和 8.27%, 但 YA 与
YB 细胞中的蛋白质含量没有显著差异(P>0.05)。刘
晓娟等[22]用半导体激光辐照拟微绿球藻, 结果蛋白
质含量比对照提高了 19. 16%, 该结果与本研究类似;
但与我们研究结果相反, 俞泓伶[25]用 UV-B 辐射杜
氏盐藻和小角毛藻后, 两种微藻细胞内蛋白质含量
均下降; 作者认为 , 这种差异很大程度上与选择的
诱变方法和藻种生理状态的不同有关。
2.4 突变藻株细胞中可溶性糖含量
为了探讨两个突变株细胞内可溶性糖含量情况,
以出发藻株为对照, 在培养条件一致的情况下对突
变株 YA和 YB细胞内可溶性糖含量进行了测定, 结
果如图 4所示。
与色素和蛋白含量变化相似, 突变株 YA 和 YB
细胞中的可溶性糖含量分别比对照组提高了 48.25%
和 45.48%, 但突变株 YA和YB之间没有显著性差异
(P>0.05)。赵萌萌[26]利用 He-Ne激光(波长 632.8 nm,
功率 10 mW)诱变钝顶螺旋藻, 处理后其蛋白质和多
糖含量均有较大增加, 该结果与本研究结果类似。关
于突变株细胞内多糖含量增加的机理王明兹等[27]认
为细胞可能通过多糖含量的增加来防止或降低自身
所受伤害, 这很可能是一种细胞自我保护的途径。
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图 4 突变藻株细胞中可溶性糖含量
Fig.4 The content of soluble sugars in mutant cells

2.5 突变藻株细胞中油脂相对含量
为筛选油脂含量比较高的突变藻株, 以出发藻株
为对照, 在培养条件一致的情况下对突变株YA和YB
细胞内油脂相对含量进行了测定(图 5)。从图 5 可见,
突变藻株 YA 和 YB细胞中油脂相对含量分别比对照
组提高了 44.06%和 12.86%, 突变藻株 YA和 YB之间
存在显著性差异(P>0.05)。在许多研究中, 利用物理
方法提高油脂含量都得到了不错的效果, Ma 等[28]通
过离子束诱变方法使微拟球藻细胞中脂肪含量提高
了 29%, 卢丽娜[29]使用半导体激光对聚球藻进行诱变,
得到一株突变株 LD5, 其油脂含量比出发藻增加了
12.91%, 但利用化学方法诱变手段提高油脂含量的研
究尚不多见。参与脂肪酸合成的酶主要是乙酰辅酶 A
羧化酶(acetyl-CoA carboxylase, ACCase)和脂肪酸合
酶, 脂肪酸生物合成途径中限制速率的关键调节步
骤是 Acetyl-CoA 经 ACCase 催化形成丙二酰辅酶 A
的这一酶促反应, 因此ACCase是脂肪酸生物合成途
径的关键限速酶。本研究中突变藻株油脂含量

图 5 突变藻株中油脂相对含量
Fig.5 The content of lipids in mutant
增加可能是由于突变后的藻细胞中 ACCase 活性增
强, 从而使得脂肪酸合成速度加快, 积累量增多[30]。
小新月菱形藻细胞主要以纵分裂繁殖为主 [4],
由于对小新月菱形藻的生物学背景尚不十分清楚 ,
从本实验获得的结果还很难判断突变性状及其生化
途径是受细胞核还是细胞质基因控制, 尤其是有关
该藻的生物学, 如细胞核倍性等方面的问题有待于
做进一步的分析和讨论。
3 结论
利用 EMS诱变获得两株优质藻株 YA与 YB, 其
代谢产物含量包括色素含量、可溶性糖含量、蛋白含
量、油脂相对含量均比对照组多, 其中, 突变藻株 YA
细胞中油脂相对含量比出发藻提高了 44.06%, 突变
藻株YB细胞中油脂相对含量比出发藻提高了 12.86%,
突变藻株内代谢物质含量增多特别是油脂含量的增
加有利于其作为潜在生物柴油资源的开发和利用。
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The biological effect of the Ethyl Methanesulphonate on
Nitzschia closterium
YANG Mao-chun , ZHAO Geng-mao, WANG Chang-hai
(College of Resources And Environmental Science, Nanjing Agricultural University, Jiangsu Key Laboratory
of Marine Biology , Nanjing 210095, China)
Received: Jan., 9, 2014
Key words: Microalgae; Nitzschia closterium; Mutagenesis; Ethyl Methanesulphonate; lipid

Abstract: In order to obtain the high-lipid producing strains of Nitzschia closterium, the method of chemical muta-
tion with Ethyl Methanesulphonate (EMS) was used, and the biological effects of EMS on the cells of N. closterium
were studied. The results showed that the EMS has good mutagenesis effect on the cells of N. closterium, and two
different mutant strains of N. closterium YA and YB were obtained after treatment with 0.1 mol/L and 0.05 mol/L dos-
ages of EMS, respectively, which both had stronger oil production capacity. Under the same cultivation condition,
the chlorophyll a, carotenoids, protein, soluble sugar contents and lipid relative contents of YA and YB have in-
creased by 30.05% and 25.77%, 22.15% and 19.26%, 9.06% and 8.27%, 48.25% and 45.48%, and 44.06% and
12.86% compared with the CK, respectively.

(本文编辑: 梁德海)