全 文 ：第 36卷　第 3期 西 南 师 范 大 学 学 报(自然科学版) 2011年 6月
Vol.36　N o.3 　　Journal of Southwest China Normal University (Natural Science Edition) Jun. 2011
文章编号:1000-5471(2011)03-0132-06
EMS诱变南高丛越橘及抗旱突变体的筛选①
张　敏 , 　杨　艳 , 　康兆茹 , 　李　凌
西南大学 园艺园林学院 , 重庆 400716
摘要:以南高丛越橘品种 V5 试管苗为试验材料 , 用甲基磺酸乙酯对其茎尖分别以 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%,
0.5%的浓度进行诱变处理 , 统计试管苗的平均增殖率 , 待其出瓶生根 , 长至 15 cm 高时筛选形态变异植株 , 统计
变异率 , 并对 M 0 代植株进行干旱胁迫 , 测定其抗性指标 , 从生理方面对抗旱突变体进行筛选.结果表明:从形
态上 , 存在 4 种变异类型:叶片明显变大 、 花叶类型 、 分枝能力明显增强 、 叶片皱缩;综合各个生理指标 , 0.4%
和 0.5%的甲基磺酸乙酯处理苗可能存在抗旱性较强的突变体.
关　键　词:越橘;甲基磺酸乙酯;干旱胁迫;抗旱突变体
中图分类号:Q949.772.3 文献标志码:A
越橘(Vaccinium)属于杜鹃花科(Ericaceae)越橘属[ 1] , 为多年生落叶 、常绿的灌木或小灌木.全世界越
橘属的植物约有 400多种 , 在我国约有 91个种 、28个变种 , 分布于我国的东北和西南地区[ 1-3] .越橘果实
颜色美观 , 含有丰富的营养成分 , 除含有一般水果中的有机酸 、维生素和矿物之外 , 还含有丰富的不饱和
脂肪酸及微量元素 , 具有广阔的开发利用价值.越橘在酸性土壤中生长良好 , 根系分布浅 , 土壤的水分状
况是越橘生长的一个重要制约因素 , 因此获得抗旱突变体在我国干旱地区具有十分重要的意义.
利用理化因素诱变处理是改良植物的一种行之有效的方法 , 在农作物 、园艺 、花卉等的改良中已广泛
应用 , 并育成大量优良品种.化学诱变是人工获取突变体常用的手段之一 , 化学诱变与物理诱变相比 , 具
有相对的专一性 , 它的作用对象是碱基 , 例如碱基的替换 、颠倒.利用化学诱变和细胞培养技术相结合筛
选抗性突变体越来越受到人们的重视 , 已在烟草 、苜蓿 、油菜等物种中筛选出耐受高浓度 PEG 的突变
体[ 4-6] .甲基磺酸乙酯(EMS)是较为常用的化学诱变剂 , 在植物诱变育种中已得到广泛的应用 , 目前已成为
作物诱变育种中应用最广泛 、应用效果最好的一种诱变剂[ 7] .
本研究用化学诱变剂 EMS对越橘茎尖进行处理 , 并对 M 0 代植株进行干旱处理 , 测定部分生理指标 ,
旨在为越橘的抗旱育种提供基础研究数据.
1　材料和方法
1.1　试验材料
本试验材料是南高丛“V 5”越橘试管苗 , 取自本实验室.
化学诱变剂甲基磺酸乙酯(Ethy l methane sulfonate 简称 EMS)为美国 SIGMA 公司生产.
1.2　试验方法
配制 pH =4.8 ,0.01 mol/L 磷酸缓冲液 , 高压灭菌 , 在无菌条件下 , 将 EMS 溶液(上述磷酸缓冲液作
溶剂)经 0.22μm 的微过滤器抽滤灭菌 , 然后用无菌的磷酸缓冲液和 EMS 溶液分别配制成浓度为 1%,
2%, 3%, 4%,5%的处理液 , 以 A ,B ,C ,D , E表示 , 以磷酸缓冲液处理作对照 , CK 表示.剪取长度约 5 mm
的试管苗茎尖分别浸入 A ,B ,C ,D , E , CK处理液中 , 震荡处理 1 h , 用无菌水冲洗 4次 , 接种于预先准备的
培养基上 , 经过 2 ～ 3个月生长 , 期间记录分枝数量和变异芽的情况 , 然后转接到生根培养基上 , 待其生根
① 收稿日期:2010-11-05
作者简介:张　敏(1986-), 女, 山东德州人 , 硕士研究生 , 主要从事园林植物遗传育种与生理研究.
通信作者:李　凌 , 教授 , 硕士生导师.
DOI :10.13718/j.cnki.xsxb.2011.03.041
后 , 经过驯化 , 移栽于 8 cm×8 cm 规格的小塑料钵中 , 放置在温室中进行水分和养分管理 , 经过一次换
盆 , 植株长到 12 ～ 16片真叶时 , 对植株中间部位的叶片(生长已稳定)进行形态测量 , 然后进行干旱胁迫处
理 , 以根际水分胁迫为主 , 于开始测定的前天傍晚浇透水 , 然后停止浇水 5 d(≥80%的植株顶部叶片失水
卷曲 , 并有干黄现象), 每天进行各生理指标的测定.
1.2.1　指标测定
叶长 、叶宽的测定采用直尺测量法;土壤含水量的测定采用烘干法[ 8] ;超氧化物歧化酶的测定采用氮
蓝四唑法[ 9] ;丙二醛的测定采用硫代巴比妥酸显色法[ 9] ;脯氨酸的测定采用茚三酮比色法[ 9] ;可溶性糖的
测定采用蒽酮比色法[ 9] ;叶绿素的测定采用分光光度法[ 9] .
1.2.2　数据的处理与统计分析
本试验所有数据采用 Excel和 SPSS 13.0统计软件进行数据处理.
2　结果与分析
2.1　EMS处理对越橘茎尖生长情况的影响
在诱变剂处理材料的过程中 , 随 EMS浓度的增加 , 越橘茎尖出现萎蔫现象.材料转入培养基以后 , 由
于浓度差异 , 各处理萌发状态不一 , 但是差异不大.出瓶生根后 , 移栽至人工基质上长到 12 ～ 16片真叶
(15 cm)时 , 与对照相比各处理均观察到明显的形态变异株 , 表现为 4种变异类型:花叶类型(图 1)、分枝
能力明显增强(图 2)、叶片明显变大(图 3)、叶片皱缩(图 4).花叶类型:叶片的叶肉发黄 , 叶脉保持绿色 ,
类似典型的缺铁症状.基于栽培条件一致 , 可能是经过EMS处理出现了铁吸收能力降低的突变类型;分枝
能力明显增强:V 5 为基部萌生分枝 , 此变异类型表现为新枝在萌发的过程中 , 同时萌发 2 次枝甚至 3次
枝;叶片明显变大:对照植株的平均叶长 、叶宽为 30.84 cm , 25.15 cm , 变异植株的平均叶长 、叶宽为
41.23 cm ,31.56 cm , 相对于对照分别增加了 33.69%,25.49%, 在 0.05水平上差异显著;叶片皱缩:对照
植株的叶片平整 , 有少许的凹陷 , 此变异类型叶片极皱缩 , 并且长势差 , 植株细弱.
图 1　花叶类型 图 2　分枝能力增强的变异类型
图 3　叶片变大的变异类型 图 4　叶片皱缩的变异类型
2.2　EMS处理对越橘茎尖增殖率和变异率的影响
在相同处理时间下 , EMS 对越橘茎尖的生长影响很大.由表 1可见 , 经诱变处理的越橘茎尖的平均增
殖率都明显低于对照 , 并且在 0.05水平上 , A 处理和 D处理与对照差异显著;各处理都存在形态变异植
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株 , C处理和 E 处理的形态变异率较高.
表 1　EMS处理对平均增殖率和形态变异率的影响
浓　度 处理芽个数 材料 V5平均增殖率/ % 形态变异率/ %
A 120 40 a 1
B 120 70 abc 1
C 120 80 abcd 2
D 120 60 abcd 1
E 120 70 bcd 3
CK 120 98 bcd 0
　　注:平均增殖率中有相同字母者差异不显著 , 反之显著.
图 5　土壤含水量变化趋势
2.3　土壤含水量的变化
随胁迫天数的增加 , 各个处理的植株土壤含水量
呈明显下降的趋势 , 从 39.30%下降到 9.63%(图 5)
左右 , 并且下降趋势基本一致 , 无明显差异 , 说明各
个处理的植株所遭受的干旱胁迫程度基本一致 , 排除
了多余因素 , 使生理指标的变化与各处理的植株自身
直接相关 , 保证了各处理植株生理指标差异分析的可
靠性.
2.4　干旱胁迫对处理植株超氧化物歧化酶(SOD)活
性的影响
SOD是植物体内消除氧自由基的重要保护酶 , 其活性是植物抗旱性的重要指标.一般认为 , 在干旱胁
迫下植物体 SOD的活性与植物抗氧化胁迫能力呈正相关.
随着水分胁迫的加剧 , 各个处理植株的 SOD活性在总体上都有不同程度的升高(图 6), 从胁迫的第
3 d开始往后 , 变化趋势较明显 , 说明前 3 d的水分胁迫程度不足以引起 SOD活性的变化 , 各处理在胁迫第
4 d均达到峰值 , 第 5 d均有不同程度的降低.有研究表明 , 植物在水分胁迫的情况下 , SOD的活性呈先上
升后下降的趋势 , 抗旱性越强的品种活性的下降量越少.以 SOD活性的下降程度作为衡量标准 , 各处理植
株抗旱能力从大到小依次为:E ,D , C ,B ,CK ,A(表 2).
2.5　干旱胁迫对处理植株丙二醛(MDA)含量的影响
当植物处于逆境时 , 细胞内的氧自由基产生和消除的平衡遭到破坏 , 膜质不饱和脂肪酸的双键受自由
基攻击而被氧化分解 , 造成细胞膜系统的破坏 , MDA 表示生物膜过氧化强度和膜系统受伤害的程度 , 是逆
境生理研究的一项重要指标[ 10-11] .
各处理植株的 MDA 含量随水分胁迫程度的加重而逐渐增加(图 7).C , A 处理增长幅度较快 , 在干旱
胁迫第 5 d 时 , 分别比第 1 d 增加了 312.68%和 297.72%, 其次是 D , CK , B , E , 分别为 269.96%,
210.71%,181.08%,145.11%.有研究指出 , 抗旱性的强弱与 MDA 的含量在干旱胁迫胁迫下的增量有关 ,
增量越大 , 抗旱性越弱 , 反之则强.以MDA 含量在水分胁迫下的增加幅度作为衡量指标 , 各处理植株的抗
旱能力从大到小依次为:E ,B ,CK ,D , A ,C(表 3).
表 2　干旱胁迫下 SOD含量的差异显著性
处理 水分胁迫时间/d
1 2 3 4 5
CK a a a a a
A a b a b b
B b b b c c
C c c c d d
D d c d e e
E c d e f f
　　注:各处理有相同字母者差异不显著, 反之显著 , 下同.
表 3　干旱胁迫下MDA的差异显著性
处理 水分胁迫时间/ d
1 2 3 4 5
CK a a a a a
A b b b b b
B c c c c c
C d d d d d
D e e e e e
E f f f f f
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图 6　干旱胁迫下 SOD含量的变化趋势 图 7　干旱胁迫下 MDA 的变化趋势
2.6　干旱胁迫对处理植株可溶性糖含量的影响
可溶性糖是植物体内一种重要的渗透调节物质 , 在水分胁迫下 , 通过其含量的增加 , 从而增加细胞液
的浓度 , 提高植物的吸水能力 , 有利于植物适应干旱缺水的环境[ 12] .伴随水分胁迫程度的加重 , 各处理植
株的可溶性糖的含量不断增加(图 8).在干旱处理的第 1 d , CK ,A , B , C ,D , E各处理植株的的可溶性糖的
含量分别为 0.068%,0.065%,0.063%,0.072%,0.046%,0.068%.胁迫第 5 d与第 1 d相比 , 各处理植株
的可溶性糖含量都有不同程度的增加 , 其中 D处理的植株增量最大 , 增加了 93.50%, 说明 D处理植株在
干旱胁迫下能更快地调整其可溶性糖含量 , 增强渗透能力 , 所以 D处理较其他各处理具有更强地干旱适应
能力.其次为 A , CK , B ,C , E , 分别增加了 78.46%,47.06%,39.68%,33.33%, 32.35%(表 4).
图 8　干旱胁迫下可溶性糖含量的变化趋势 图 9　干旱胁迫下叶绿素含量的变化趋势
表 4　干旱胁迫下可溶性糖的差异显著性
处理 水分胁迫时间/d
1 2 3 4 5
CK a a a a a
A b b b b b
B b c c c c
C c c c d d
D d d d d e
E e e e e f
表 5　干旱胁迫下叶绿素含量的差异显著性
处理 水分胁迫时间/ d
1 2 3 4 5
CK a a a a a
A a b a b b
B b c b c c
C c d a d a
D d d d a d
E e e e e e
2.7　干旱胁迫对处理植株叶绿素含量的影响
各处理植株随水分胁迫的加深 , 叶绿素含量呈持续下降趋势(图 9).在胁迫处理后期 , CK ,A ,B , C ,D ,
E各处理植株的叶绿素含量与第 1 d 相比 , 分别降低了 8.18%, 44.67%, 32.07%, 22.36%, 18.86%,
12.85%.聂华堂等认为 , 植物在干旱胁迫下 , 叶绿素含量的变化幅度与植株的抗旱性呈负相关 , 由此可以
确定 , 各处理植株抗旱能力从大到小依次为:CK , E ,D ,C ,B ,A(表 5).
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图 10　干旱胁迫下脯氨酸含量的变化趋势
2.8　干旱胁迫对处理植株脯氨酸含量的影响
脯氨酸作为渗透调节物质 , 在干旱逆境中可以降低
渗透势从而降低水势 , 有助于细胞和组织吸水 , 对植物
进行正常生理活动起到重要的渗透调节作用 , 提高抗旱
能力[ 13-15] .随着干旱胁迫程度的加强 , 各处理植株的脯
氨酸含量均呈现不同程度的增长(图 10).CK , A , B , C ,
D ,E 各处理在水分胁迫的第 3 d都达到峰值 , 分别为
0.005 1%,0.005 4%,0.001 5%,0.003 3%, 0.004 1%,
0.003 1%.这说明植株在干旱胁迫的初期能够产生一定
量的游离脯氨酸 , 用以维持植物各器官的渗透能力 , 维
持细胞和组织吸水 , 提高植株对干旱逆境的适应能力.
但伴随着干旱胁迫时间的延长 , 各处理的植株在第 4 d
和第 5 d出现严重萎蔫的现象 , 使植物体内的正常生理活动受到抑制 , 从而导致游离氨基酸的含量减少.
如果以游离脯氨酸含量的峰值出现的时间以及峰值的大小作为衡量标准 , 能较好地说明各处理植株抗旱能
力的大小.试验表明 , 抗旱能力从大到小依次为:D ,CK ,B ,E ,C ,A(表 6).
表 6　干旱胁迫下脯氨酸含量的方差分析
处理 水分胁迫时间/d
1 2 3 4 5
CK a a a a a
A b b b b b
B c c c c c
C d d d d a
D e e e e a
E f f f f a
3　讨　　论
植物抵御干旱的机制是复杂多样的 , 同一植物可能有几种抗旱方式 , 在不同的生长期或不同的生长状
态下 , 其抗旱能力是可以变化的 , 抗旱方式也可能不同.因此 , 许多研究抗旱生理生化反应的学者都认为 ,
不能只单一地以某种生理生化指标作为抗旱性评定的标准 , 而应以多种生理生化的综合效应来判定植物种
类的抗旱性强弱[ 16-17] .
本试验通过对 M 0代植株进行干旱胁迫 , 初步筛选出了抗旱突变体可能存在的诱变浓度 , 但是植物的
生理变化很复杂 , 所以初步筛选的变数很大 , 应在接下来的 2 ～ 3年内对其进行持续的干旱胁迫 , 进一步筛
选抗旱性较稳定的变异植株 , 并且通过分子水平标记技术 , 最终确定抗旱突变体.
4　结　　论
1)经 EMS 处理的茎尖长成的植株 , 在形态上存在变异 , 表现为 4种变异类型:叶片明显变大 、花叶类
型 、分枝能力明显增强 、叶片皱缩.
2)从SOD活性方面分析 , 抗旱能力从大到小依次为:E ,D , C , B ,CK ,A;从MDA 含量方面分析 , 抗旱
能力从大到小依次为:E ,B ,CK , D ,A ,C;从可溶性糖含量方面分析 , 抗旱能力从大到小依次为:D ,A , CK ,
B ,C ,E;从叶绿素含量方面分析 , 抗旱能力从大到小依次为:CK , E , D , C , B , A;从脯氨酸含量方面分析 ,
抗旱能力从大到小依次为:D ,CK ,B ,E ,C ,A.综合各指标 , 从生理角度可以看出 , EMS 各个处理与对照的
抗旱能力从大到小依次为:D ,E ,CK ,B ,C , A.所以 0.4%和 0.5%的 EMS 处理可能存在抗旱性较强的突
变体.
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A Preliminary Study on Drought-Resistant Mutant Induction
in Southern Highbush Blueberry Plants with EMS Mutagenesis
ZHANG　Min , 　YANG 　Yan , 　KANG Zhao-ru , 　LI　Ling
School of Hort iculture and Landscape Architecture , Southwest University , Chongqing 400716 , China
Abstract:The test tube plant lets o f the southe rn highbush bluebe rry variety V5 were used as the experi-
ment materials , their shoot tips w ere t reated in vit ro w ith EM S(ethy l methy l sulfonate)at 0.1%, 0.2%,
0.3%, 0.4% and 0.5%EMS and the average mult iplication rate w as calcula ted.Afte r the plantlets ro oted
and g rew to 15 cm in height , the individuals w ith mo rpholog ical v ariat ions w ere identif ied and thei r varia-
tion rates we re recorded.T hen the M 0 plants were subjected to drought stress , and drought resistant mu-
tants w ere identif ied based on the phy siological indicator s o f SOD act ivity and MDA , soluble sugar , chlo-
rophy ll and pro line contents.A s a result , four types of v aria tion were detected , i.e.large-leaved mutants ,
mosaic-leaved mutants , mutants wi th g reat bifurcation capaci ty and w rinkle-leaved mutants.Based on the
above-stated phy siolo gical indicato rs , drought resistant mutants might exist in the 0.4% and 0.5% EMS
treatments.
Key words:blueberry;EMS;drought stress;drought resistant mutant
责任编辑　欧　宾　　　　
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