全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４５(４): ３７０￣３７５(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０４￣１３ꎻ 修回日期: ２０１５￣０２￣２２
基金项目: 国家自然科学基金(３１０７１６７０)
通讯作者: 王文明ꎬ研究员ꎬ主要从事植物广谱抗病机理研究ꎻＴｅｌ:０２８－８６２９０９４９ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｊ３１６ｗｅｎｍｉｎｇｗａｎｇ＠ｓｉｃａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
第一作者: 黄衍焱ꎬ男ꎬ湖北宜昌人ꎬ博士研究生ꎬ主要研究方向为拟南芥广谱抗性蛋白 ＲＰＷ８抗性机制ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｈ１９８５ｙｙ＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０４.００５
白粉菌侵染后的拟南芥酵母双杂交
ｃＤＮＡ文库构建及其利用
黄衍焱１ꎬ 杨玲珑２ꎬ 王 莹１ꎬ 李 冉１ꎬ 鲁黎明２ꎬ 王文明１∗
( １四川农业大学水稻研究所ꎬ成都 ６１１１３０ꎻ ２四川农业大学农学院ꎬ成都 ６１１１３０)
摘要:拟南芥广谱抗病基因 ＲＰＷ８对拟南芥白粉病菌、霜霉病菌和烟草花叶病毒等均具有抗性ꎮ 为了深入研究其广谱抗病
机制ꎬ筛选鉴定与 ＲＰＷ８具有直接相互作用的蛋白ꎬ我们以含有 ＲＰＷ８的拟南芥纯合转基因系 Ｓ５为材料ꎬ接种拟南芥白粉
菌系 ＵＣＳＣ１ꎬ３６ ｈ后取样ꎬ构建了白粉菌侵染初期的拟南芥 ｃＤＮＡ文库ꎮ 为了提高文库对长片段基因 ５′端的覆盖率ꎬ分别
使用含有 ｏｌｉｇｏ(ｄＴ)和 ｏｌｉｇｏ(ｄＮ)的接头引物反转录 ｃＤＮＡ第一链ꎬＰＣＲ扩增双链 ｃＤＮＡꎮ 将纯化后的双链 ｃＤＮＡ与线性化
载体 ｐＧＡＤＴ７￣Ｒｅｃ混合ꎬ利用同源重组技术在酵母菌株 Ｙ１８７ 中构建 ｃＤＮＡ 文库ꎮ 经检测ꎬ文库转化效率为 ５.０×１０６ / ３ μｇ
ｐＧＡＤＴ７￣Ｒｅｃꎬ滴度为 ２.５×１０８ ＣＦＵ􀅰ｍＬ－１ꎬ插入片段长度在 ３５０~ ２ ０００ ｂｐ 之间ꎬ平均插入片段大小为 ７５０ ｂｐꎮ 用 ＲＰＷ８.１
和 ＲＰＷ８.２构建诱饵载体ꎬ分别获得 １１和 １２个候选互作蛋白ꎮ 结果表明此 ｃＤＮＡ文库质量较好ꎬ适用于互作蛋白的筛选ꎮ
关键词:ＲＰＷ８ꎻ 白粉菌ꎻ 拟南芥ꎻ ｃＤＮＡ文库ꎻ 酵母双杂交
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ￣ｈｙｂｒｉｄ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ　 ＨＵＡＮＧ Ｙａｎ￣ｙａｎ１ꎬ ＹＡＮＧ Ｌｉｎｇ￣ｌｏｎｇ２ꎬ ＷＡＮＧ Ｙｉｎｇ１ꎬ ＬＩ
Ｒａｎ１ꎬ ＬＵ Ｌｉ￣ｍｉｎｇ２ꎬ ＷＡＮＧ Ｗｅｎ￣ｍｉｎｇ１ 　 ( １Ｒｉｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅꎬ Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１１１３０ꎬ
Ｃｈｉｎａꎻ２Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙꎬ Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１１１３０ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: ＲＰＷ８ꎬ ａ ｂｒｏａｄ￣ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｌｏｃｕｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｃｏｎｆｅｒｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ
Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍꎬ Ｈｙａｌｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａꎬ ａｎｄ Ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ. Ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｉｔｓ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ ｔｈａｔ ｍａｙ ｂｅ ｈｅｌｐｆｕｌ ｆｏｒ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＲＰＷ８￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｒｏａｄ￣ｓｐｅｃｔｒｕｍ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅꎬ ａｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ￣ｈｙｂｒｉｄ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｐｌａｎｔ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ａｔ ａｎ
ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ ｏｆ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ. Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｌｉｎｅ Ｓ５ ｗｉｔｈ ａ ｓｉｎｇｌｅ
ｃｏｐｙ ｏｆ ＲＰＷ８ ａｔ ３６ ｈ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｓｔｒａｉｎ ＵＣＳＣ１. ｍＲＮＡ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ
ｆｉｒｓｔ￣ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｗａｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｂｙ ｏｌｉｇｏ ( ｄＴ) ａｎｄ ｏｌｉｇｏ ( ｄＮ) ｐｒｉｍｅｒｓꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ
ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ５’ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｃｏｖｅｒａｇｅ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ ｌａｒｇｅ ｓｉｚｅ. Ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｄｓ ｃＤＮＡ ａｎｄ ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ ｐＧＡＤＴ７￣Ｒｅｃ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｓｔｒａｉｎ Ｙ１８７. Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆ￣
ｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｗａｓ ５.０×１０６ / ３ μｇ ｐＧＡＤＴ７￣Ｒｅｃ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｗａｓ ２.５×１０８ＣＦＵ􀅰ｍＬ￣１.
Ｔｈｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ３５０ ｂｐ ｔｏ ２ ０００ ｂｐ ｗｉｔｈ ａｎ ａｖｅｒａｇｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ７５０ ｂｐ. Ｔｈｅ
ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｗａｓ ｔｈｅｎ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ ＲＰＷ８.１￣ ａｎｄ ＲＰＷ８.２￣ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓꎬ ａｎｄ １１ ａｎｄ １２ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ
ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅｓｅ ｄａｔａ ｓｕｇｇｅｓｔ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｉｓ ｉｎ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｅｒｅｓｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ￣ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｐａｔｈｏｓｙｓｔｅｍ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ＲＰＷ８ꎻ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗꎻ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａꎻ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙꎻ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ￣ｈｙｂｒｉｄ
中图分类号: Ｓ４３２.４　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０４￣０３７０￣０６
　
　 ４期 黄衍焱ꎬ等:白粉菌侵染后的拟南芥酵母双杂交 ｃＤＮＡ文库构建及其利用
　 　 白粉菌是一种专性寄生的真菌ꎬ能侵染多种农
作物、果树及绿化植物ꎬ给农林业的发展造成了严
重危害ꎮ 通过克隆白粉菌抗性基因ꎬ阐明抗性机制
对白粉菌的防治具有重要的意义ꎮ 白粉菌抗性基
因位点 ＲＰＷ８是 Ｘｉａｏ等[１]从高抗白粉菌的拟南芥
生态型 Ｍｓ￣０ 中克隆得到的ꎬ该基因位点包含
ＲＰＷ８.１ 和 ＲＰＷ８.２ 两个抗性基因(其编码的氨基
酸序列一致性为 ４５％ꎬ相似性为 ６５％)ꎬ对拟南芥
白粉菌、烟草白粉菌、拟南芥霜霉菌和烟草花叶病
毒等均表现抗性[２]ꎬ是一个具有广谱抗性的基因
位点ꎮ 研究发现ꎬ ＲＰＷ８. ２ 由病原菌诱导表达ꎬ
ＲＰＷ８.２特异性地锚定在白粉菌吸器外质膜上ꎬ可
提高胼胝质在吸器周围的积累ꎬ形成吸器复合体
鞘ꎬ也能让过氧化氢在吸器复合体鞘中富集并杀死
吸器从而断绝白粉菌的营养来源以达到抗病的目
的[３]ꎮ ＲＰＷ８.１ 定位于叶绿体周围[２]ꎮ 最新研究
结果表明:ＲＰＷ８.１ 和 ＲＰＷ８.２ 在时空表达特征、引
起的细胞死亡和抗病特性等方面都存在明显差
异[４]ꎮ 尽管已证实 ＲＰＷ８的抗病反应依赖于 ＳＡ信
号途径ꎬ并受 ＳＡ的反馈调节[５]ꎬ但对直接与 ＲＰＷ８
相互作用且参与其广谱抗性途径的基因知之甚少ꎮ
　 　 为了获得在白粉菌侵染过程中直接与 ＲＰＷ８
互作的基因ꎬ我们构建了白粉菌侵染拟南芥的前期
ｃＤＮＡ 文库ꎬ利用酵母双杂交技术ꎬ从中筛选与
ＲＰＷ８.１和 ＲＰＷ８.２互作的蛋白ꎬ为阐明 ＲＰＷ８ 的
广谱抗性机制奠定基础ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 材料
　 　 拟南芥 Ｓ５:含有 ＲＰＷ８ 基因位点的拟南芥生
态型 Ｃｏｌ￣ｇｌ纯合转基因株系ꎻ白粉菌(Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙ￣
ｃｅｓ ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ ＵＣＳＣ１)ꎻＴｈｅ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ
(Ｃａｔ. Ｎｏ. ７４１０４)和 Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ Ａ＋ ＲＮＡ
ｆｒｏｍ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ (Ｃａｔ. Ｎｏｓ. ７００２２)购自 ＱＩＡＧＥＮ
公司ꎻＭａｋｅ Ｙｏｕｒ Ｏｗｎ “Ｍａｔｅ ＆ ＰｌａｔｅＴＭ ” Ｌｉｂｒａｒｙ
Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌ(Ｃａｔ. Ｎｏ. ６３０４９０)购自 Ｃｌｏｎ￣
ｔｅｃｈ公司ꎻＡｄｖａｎｔａｇｅ ２ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ (Ｃａｔ. Ｎｏ.
６３９２０１)购自 Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司ꎮ
１.２　 总 ＲＮＡ提取及ｍＲＮＡ分离
　 　 参照说明书ꎬ使用 ｔｈｅ ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ (ＱＩＡ￣
ＧＥＮ) 提取总 ＲＮＡꎬ然后使用 Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ
Ａ＋ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ (ＱＩＡＧＥＮ) 从中分离
ｍＲＮＡꎮ 分别用 １％的琼脂糖凝胶和 ＮａｎｏＤｒｏｐ
２０００分光光度计检测质量及浓度ꎮ
１.３　 ｃＤＮＡ文库的构建
　 　 以 ２ μｇ ｍＲＮＡ为模板ꎬ参照说明书 ＰＴ４０８５￣１
(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ)ꎬ分别使用引物 ＣＤＳ ＩＩＩ Ｐｒｉｍｅｒ:５′￣ＡＴ￣
ＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧ￣ｄ ( Ｔ ) ３０
ＶＮ￣３′和 ＣＤＳ ＩＩＩ / ６ Ｐｒｉｍｅｒ: ５′￣ＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣ￣
ＣＧＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＣＡＴＧ￣ＮＮＮＮＮＮ￣３′进行反转
录合成 ｃＤＮＡ第一链和双链 ｃＤＮＡ(ｄｓ ｃＤＮＡ)ꎬ将
２ 管 ｄｓ ｃＤＮＡ ＰＣＲ 产物使用 ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮＴＭ
ＴＥ￣４００ Ｃｏｌｕｍｎ 进行纯化后ꎬ收集在同一离心管
中ꎮ 最后取 ２. ３ μｇ ｄｓＤＮＡ 与 ３ μｇ 线性化载体
ｐＧＡＤＴ７￣Ｒｅｃ共转化酵母菌 Ｙ１８７ 感受态细胞ꎬ得
到 ｃＤＮＡ文库ꎮ
１.４　 ｃＤＮＡ文库转化效率及滴度的测定
　 　 用无菌的双蒸水将 ０.９％ ＮａＣｌ 中的酵母菌悬
液稀释 １０ 和 １０２倍ꎬ将 Ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ 收集的菌
体稀释 １０２ꎬ１０３ꎬ１０４和 １０５倍ꎬ分别涂布于 ＳＤ / ￣Ｌｅｕ
固体培养基上ꎬ３０℃培养 ５ ｄꎬ根据培养基上生长的
单菌落数量分别计算 ｃＤＮＡ 文库的转化率及滴
度ꎮ 具体步骤见说明书 ＰＴ４０８５￣１(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ)ꎮ
１.５　 ｃＤＮＡ文库平均插入片段大小及重组率的计算
　 　 从 ＳＤ / ￣Ｌｅｕ培养皿上随机挑取 ３６ 个单菌落ꎬ
用引物 ３ＡＤ ＬＤ￣Ｉｎｓｅｒｔ: ５′￣ＡＣＴＴＧＣＧＧＧＧＴＴＴ
ＴＴＣＡＧＴＡＴＣＴＡ￣３′ 和 ５ＡＤ ＬＤ￣Ｉｎｓｅｒｔ: ５′￣ＧＡＴ￣
ＧＡＴＧＡＡＧＡＴＡＣＣＣＣＡＣＣＡＡＡＣ￣３′进行菌落 ＰＣＲ
扩增ꎬ扩增条件为:９４℃预变性 ３ ｍｉｎꎻ９４℃变性
３０ ｓꎬ５８℃退火 ３０ ｓꎬ７２℃延伸 ４ ｍｉｎꎬ扩增 ３０ 个循
环ꎻ７２℃延伸 ５ ｍｉｎꎻ最后 １２℃保存 ５ ｍｉｎꎮ 使用
１％的琼脂糖凝胶电泳 ＰＣＲ 产物ꎬ统计扩增片段的
大小和数量ꎬ分别计算 ｃＤＮＡ 文库平均插入片段
大小及重组率ꎮ
１.６　 Ｂａｉｔ载体构建及 ｃＤＮＡ文库筛选
　 　 利用多克隆位点中的 ＥｃｏＲ Ｉ和 ＢａｍＨ Ｉ分别将
广谱抗病基因 ＲＰＷ８. １ (ＡＦ２７３０５９. １)和 ＲＰＷ８. ２
(ＡＦ２７３０５９.１)构建在 Ｂａｉｔ 载体上ꎬ并转化到酵母菌
株 Ｙ２Ｈ Ｇｏｌｄ中ꎮ 然后通过文库酵母菌株(Ｙ１８７)和
Ｂａｉｔ酵母菌种(Ｙ２Ｈ Ｇｏｌｄ)之间 ｍａｔｉｎｇ 的方式进行
１７３
　
植物病理学报 ４５卷
文库筛选ꎬ具体步骤见说明书 ＰＴ４０８４￣１(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ)ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 总 ＲＮＡ提取及ｍＲＮＡ的分离
　 　 在拟南芥 Ｓ５ 叶片上接种白粉菌 ＵＣＳＣ１ 菌株
３６ ｈ后ꎬ使用环境扫描电镜(ＦＥＩ Ｑｕａｎｔａ ４５０)发现
ＵＣＳＣ１萌发并长出菌丝(图 １￣Ａ)ꎬ台盼蓝染色后
光学显微镜观察发现吸器已经形成(图 １￣Ｂ)ꎮ 取
此时的叶片提取总 ＲＮＡꎬ经测定 ＯＤ２６０ / ＯＤ２８０ ＝
１.９４ꎬＯＤ２６０ / ＯＤ２３０ ＝ ２.５８ꎬ浓度为 ２.６２ μｇ􀅰μＬ
－１ꎮ
表明总 ＲＮＡ 纯度较高ꎬ蛋白及盐离子去除干净ꎮ
根据 １％琼脂糖凝胶电泳结果分析ꎬ２８Ｓ 和 １８Ｓ 条
带清晰明亮ꎬ且可以看到其它不同大小的 ＲＮＡ 条
带(图 ２￣Ａ)ꎬ表明总 ＲＮＡ 完整性及质量较好ꎮ
ｍＲＮＡ分离后ꎬ在 １％琼脂糖凝胶呈现弥散状(图
２￣Ｂ)ꎬ经测定浓度为 ３１２ ｎｇ􀅰μＬ－１ꎬ回收效率为
２.１％ꎬ可以用于文库构建ꎮ
２.２　 ｄｓ ＤＮＡ合成
　 　 为了提高文库在基因 ５′端的覆盖率ꎬ在反转
录过程中ꎬ以 ＣＤＳ ＩＩＩ Ｐｒｉｍｅｒ 和 ＣＤＳ ＩＩＩ / ６ Ｐｒｉｍｅｒ
为引物分别合成 ｃＤＮＡ 第一条链ꎬ然后以此为模
板ꎬ分别合成 ｄｓ ｃＤＮＡꎮ 以含有 ｐｌｏｙ(ｄＴ)的引物
ＣＤＳ ＩＩＩ Ｐｒｉｍｅｒ扩增得到的 ｄｓ ｃＤＮＡꎬ分布于 １５０~
５ ０００ ｂｐ之间的区域(图 ２￣Ｃ)ꎬ而以含有随机结合
位点 ｐｏｌｙ(ｄＮ)的引物 ＣＤＳ ＩＩＩ / ６ Ｐｒｉｍｅｒ 得到的 ｄｓ
ｃＤＮＡ分布于１５０~１ ５００ ｂｐ之间(图２￣Ｄ) ꎮ原因在
Ｆｉｇ. １　 Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｉｍａｇｅｓ ｏｆ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ＵＣＳＣ１ ｏｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ
Ｓ５ ｌｅａｖｅｓ ａｔ ３６ ｈ ｐｏｓｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
Ａ: Ａ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｉｍａｇｅ ｓｈｏｗｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ＵＣＳＣ１ꎻ
Ｂ: Ａ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｉｍａｇｅ ｏｆ ＵＣＳＣ１ ｓｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ. ｈꎬ ｈａｕｓｔｏｒｉｕｍꎬ Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝ １００ μｍ.
Ｆｉｇ. ２　 Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉｍａｇｅｓ
Ａ: Ｔｏｔａｌ ＲＮＡꎻ Ｂ: ｍＲＮＡ (Ｌａｎｅ １)ꎻ ＣꎬＤ: Ｔｈｅ ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ(ｄＴ)
(Ｌａｎｅ １ ｉｎ Ｃ) ａｎｄ ｏｌｉｇｏ(ｄＮ) (Ｌａｎｅ １ ｉｎ Ｄ) . Ｍ: Ｔｒａｎｓ ２Ｋ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ.
２７３
　
　 ４期 黄衍焱ꎬ等:白粉菌侵染后的拟南芥酵母双杂交 ｃＤＮＡ文库构建及其利用
于随机引物接头 ＣＤＳ ＩＩＩ / ６ Ｐｒｉｍｅｒ 可以随机匹配
于 ｍＲＮＡ序列上ꎬ所以由其合成的 ｄｓ ｃＤＮＡ 片段
较小ꎮ 混合分别纯化的 ｄｓ ｃＤＮＡꎬ浓度为 １１４.４４
ｎｇ􀅰μＬ－１ꎮ
２.３　 ｃＤＮＡ文库转化效率及滴度的测定
　 　 在稀释 １０２倍的两个 ＳＤ / ￣Ｌｅｕ 平板上分别长出
３５８和 ３０４ 个菌落(图 ３￣Ａ、Ｂ)ꎬ计算得到 ｃＤＮＡ 文
库转化效率为 ５.０×１０６ / ３ μｇ ｐＧＡＤＴ７￣Ｒｅｃꎬ达到要
求的 １.０×１０６ / ３ μｇ ｐＧＡＤＴ７￣Ｒｅｃ转化效率ꎮ
　 　 在稀释 １０５倍的两个 ＳＤ / ￣Ｌｅｕ 平板上分别长
出 １２７和 １１９ 个菌落(图 ３￣Ｃ、Ｄ)ꎬ计算得到ｃＤＮＡ
文库滴度为 ２.５×１０８ ＣＦＵ􀅰ｍＬ－１ꎬ达到要求的 ２.０×
１０７ ＣＦＵ􀅰ｍＬ－１滴度ꎮ
２.４　 ｃＤＮＡ文库重组率及平均重组片段大小的鉴定
　 　 在 ｃＤＮＡ文库中随机挑取 ３６个酵母菌落进行
ＰＣＲ鉴定ꎮ 琼脂糖凝胶电泳检测显示(图 ４)ꎬ仅有
１个菌落没有扩增出条带 (白色箭头所示)ꎬ故
ｃＤＮＡ文库的重组率为 ９７.２％ꎮ 重组片段大小在
３５０~２ ０００ ｂｐ之间ꎬ平均重组片段大小为 ７５０ ｂｐꎮ
这些数据表明此 ｃＤＮＡ 文库质量较好ꎬ适用于互
作蛋白的筛选ꎮ
Ｆｉｇ. ３　 Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ
ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ
Ａ￣Ｂ: Ｙｅａｓｔ ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｏｆ ＮａＣｌ ｄｉｌｕｔｅｄ (１０２ ) ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｏｎ
ＳＤ / ￣Ｌｅｕ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ. Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ３５８ ａｎｄ ３０４ ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｉｎ ｔｗｏ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｄ
ｐｌａｔｅｓ Ａ ａｎｄ Ｂꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ Ｃ￣Ｄ: Ｙｅａｓｔ ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｏｆ ｆｒｅｅ￣
ｚｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ ｄｉｌｕｔｅｄ (１０５) ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｏｎ ＳＤ / ￣Ｌｅｕ ｍｅｄｉｕｍ
ｆｏｒ ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ. Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ １２７ ａｎｄ １１９ ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｉｎ
ｔｗｏ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｄ ｐｌａｔｅｓ Ｃ ａｎｄ Ｄꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
Ｆｉｇ. ４　 Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｓｈｏｗｉｎｇ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂａｎｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃＤＮＡ
ｌｉｂｒａｒｙ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ｂｙ ｃｏｌｏｎｙ ＰＣＲ
Ｍ: Ｔｒａｎｓ ２Ｋ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １￣１２: Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅｓ.
Ｗｈｉｔｅ ａｒｒｏｗ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｆａｉｌｕｒｅ ｏｆ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｏｎｅ ｃｏｌｏｎｙ.
３７３
　
植物病理学报 ４５卷
２.５　 酵母双杂交 ｃＤＮＡ文库初筛结果
　 　 用含有 ＲＰＷ８. １ 和 ＲＰＷ８. ２ 的 Ｂａｉｔ 载体对
ｃＤＮＡ文库进行酵母双杂交筛选ꎬ分别获得 １１ 和
１２个阳性克隆ꎮ 从筛选的结果(图 ５)看出ꎬ２３ 个
阳性 菌 株 在 ＱＤＯ / Ｘ / Ａ ( ＳＤ / ￣Ａｄｅ / ￣Ｈｉｓ / ￣Ｌｅｕ / ￣
Ｔｒｐ / Ｘ￣ａ￣Ｇａｌ / ＡｂＡ２)培养基上的生长情况各不一
样ꎮ 这些菌株相对于阴性对照均能在四缺培养基
上生长ꎬ但有的菌落生长较小ꎬ有的并未显蓝色ꎬ究
其原因可能是与 Ｂａｉｔ 蛋白互作较弱ꎬ或者为假阳
性ꎮ 分析测序结果发现ꎬ候选基因所编码的蛋白分
别为:ＡＴＰ酶亚基蛋白、光系统蛋白、组蛋白、泛素
连接酶蛋白等(表 １)ꎬ目前正在对这些候选基因进
行验证ꎮ
３　 讨论
　 　 在接种后 ３６ ｈ左右ꎬ白粉菌在 Ｓ５ 叶片表面萌
发并形成第一个吸器ꎬ诱导宿主抗性基因 ＲＰＷ８.１
和 ＲＰＷ８.２的表达ꎬ从而形成一个复杂的抗病调控
Ｆｉｇ. ５　 Ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ ＲＰＷ８.１￣ ａｎｄ ＲＰＷ８.２￣ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ
ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ￣ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ ｏｎ ＱＤＯ / Ｘ / Ａ
ＣＫ￣１: Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ ＣＫ￣２: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ.
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ￣ｔｗｏ￣ｈｙｂｒｉｄ ａｐｐｒｏａｃｈ
Ｎｏ. ＲＰＷ８.２ Ｎｏ. ＲＰＷ８.１
１ ＡＴＰａｓｅ Ｆ ｓｕｂｕｎｉｔ １ ＡＴＰａｓｅ Ｆ ｓｕｂｕｎｉｔ
２ Ｄ１ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ Ｉ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｅｎｔｅｒ ２ Ｄ１ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ Ｉ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｅｎｔｅｒ
３ Ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｉｓ ｐａｒｔ ｏｆ ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ ＩＩ ３ Ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ Ｉ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｅｎｔｅｒ
４ Ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｌｉｇｈｔ￣ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ ＩＩ ４ Ｌｉｇｈｔ ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ ＩＩ ｓｕｂｕｎｉｔ ６
５ ３０Ｓ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ１４ ５
ＦＫＢＰ￣ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｙｌ￣ｐｒｏｌｙｌ ｃｉｓ￣ｔｒａｎｓ
ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ
６ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ￣ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ Ｅ２ ６ ＲＩＮＧ / ＦＹＶＥ / ＰＨＤ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ
７ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ￣ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ７ Ｔｒｙｐｓｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ＰＤＺ ｄｏｍａｉｎ
８ Ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔ (ＴＰＲ) ￣ｌｉｋｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ８ Ｈｉｓｔｏｎｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ
９ Ｐｕｔａｔｉｖｅ ＲＩＮＧ￣Ｈ２ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ９ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ Ｐ￣ｐｒｏｔｅｉｎ ２
１０ Ｕｎｋｎｏｗｎ ｐｒｏｔｅｉｎ １０ Ｇｅｒｍｉｎ￣ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １
１１
Ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ＴＦＩＩＨ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ
ｆａｃｔｏｒ (Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ ＵＣＳＣ１)
１１ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｃｌｏｎｅ Ｆ１１
１２
Ｓｏｒｔｉｎｇ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ(Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ
ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ ＵＣＳＣ１)
４７３
　
　 ４期 黄衍焱ꎬ等:白粉菌侵染后的拟南芥酵母双杂交 ｃＤＮＡ文库构建及其利用
网络ꎬ开始产生一系列针对白粉菌的抗性生理生化
反应ꎮ 构建这一时间点的 ｃＤＮＡ 文库ꎬ筛选与
ＲＰＷ８互作的蛋白ꎬ进而完善其互作基因网络及抗
病机制ꎬ为研究其对烟草白粉菌、拟南芥霜霉菌和
烟草花叶病毒等病原菌的广谱抗性机理奠定基础ꎮ
　 　 ｃＤＮＡ 文库在构建过程中由于受实验条件等
限制ꎬ一般对基因的 ５′端覆盖率不足ꎬ尤其是对序
列较长的基因ꎮ 所以本研究用含有随机引物的接
头 ＣＤＳ ＩＩＩ / ６ Ｐｒｉｍｅｒ 来弥补 ｃＤＮＡ 文库对基因 ５′
端覆盖不足的缺点ꎬ该引物可与 ｍＲＮＡ 序列随机
退火ꎬ由其合成的 ｄｓ ｃＤＮＡ分布区域明显较小(图
２￣Ｄ)ꎬ因而 ｃＤＮＡ文库平均插入片段偏小ꎬ但由于
提高了文库对基因全长的覆盖率ꎬ有助于提高文库
筛选的成功率ꎮ 另外由于使用 ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮＴＭ
ＴＥ￣４００ Ｃｏｌｕｍｎ纯化 ｄｓ ｃＤＮＡ效率不高ꎬ需要使用
加倍的 ｄｓ ｃＤＮＡ ＰＣＲ 产物(１００ μＬ)才能纯化得
到文库所要求的 ｄｓ ｃＤＮＡ浓度ꎮ
　 　 经过分析发现ꎬＲＰＷ８.２ 不仅含有一个跨膜结
构域ꎬ而且含有 ２ 个核定位与 ３ 个核输出信号[６]ꎬ
如此多的核质穿梭元件可能决定了 ＲＰＷ８.２ 在细
胞核ꎬ细胞质和吸器外质膜上[３]共同调控一个抗
病网络ꎬ从而达到其广谱抗病的效果ꎮ 本文库适用
于筛选与 ＲＰＷ８在细胞核与细胞质中互作蛋白的
筛选ꎬ而与 ＲＰＷ８ 在膜上互作蛋白需要通过膜蛋
白酵母双杂交系统[７]来筛选ꎮ
参考文献
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责任编辑:李晖
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