全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４３(６): ５９６￣６０５(２０１３)
收稿日期: ２０１２￣１２￣１５ꎻ 修回日期: ２０１３￣０８￣２０
基金项目: 国家公益性行业(农业)科研专项(２００９０３０４９)ꎻ 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(２０１２ｈｚｓ１Ｊ００３￣１)ꎻ 海南省自然科
学基金(３１２０７１)
通讯作者: 黄俊生ꎬ研究员ꎬ主要从事香蕉枯萎病研究ꎻ Ｔｅｌ:０８９８￣６６９６９２６９ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: Ｈ８８８１１１＠１２６.ｃｏｍ
第一作者: 齐兴柱ꎬ男ꎬ湖南津市人ꎬ博士ꎬ主要从事尖孢镰刀菌功能基因组研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｑｉｘｉｎｇｚｈｕ２０１３＠１６３.ｃｏｍꎮ
ＦｏＡＰ１基因在香蕉枯萎病菌致病过程中的功能分析
齐兴柱１ꎬ２ꎬ 杨腊英２ꎬ３ꎬ 郭立佳２ꎬ３ꎬ 黄俊生２ꎬ３∗
( １海南大学农学院ꎬ 海口 ５７０２２８ꎻ ２ 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所ꎬ 海口 ５７１１０１ꎻ
３ 农业部热带农林有害生物入侵监测与控制重点开放实验室ꎬ 海口 ５７１１０１)
摘要:为了探究 ＡＰ１转录因子在尖孢镰刀菌古巴专化型 ４ 号生理小种(Ｆｏｃ４)中是否参与香蕉枯萎病的致病过程ꎬ借助尖
孢镰刀菌 Ｆｏ５１７６菌株(ＧｅｎＢａｎｋ序列号:ＡＦＱＦ０１００１４８２.１)全基因组序列ꎬ通过 ＰＣＲ 和 ＲＴ￣ＰＣＲ 技术克隆获得了 Ｆｏｃ４ 中
ＡＰ１转录因子的基因组 ＤＮＡ和 ｃＤＮＡ编码序列ꎮ 利用 ＰＥＧ介导的原生质体转化法获得 ＡＰ１基因敲除转化子ꎮ 利用 ｑＲＴ￣
ＰＣＲ分析 ＡＰ１可能调控的下游基因表达ꎮ 利用灌根法(直接在根部浇菌)检测了 ＡＰ１缺失突变体的致病能力ꎮ 结果表明
Ｆｏｃ４的 ＡＰ１转录因子 ｃＤＮＡ 编码序列长 １ ７７０ ｂｐꎬ编码 ６３.９ ｋＤａ(５８９ ａａ)蛋白ꎬ是一个典型的 ｂＺＩＰ 型转录因子ꎬ命名为
ＦｏＡＰ１ꎻＦｏＡＰ１缺失突变体的气生菌丝大量减少ꎬ菌丝的入侵生长受到严重限制ꎮ 对外源氧化胁迫不敏感ꎬ但致病能力减弱ꎮ
关键词:尖孢镰刀菌古巴专化型ꎻ ４号生理小种ꎻ ＦｏＡＰ１转录因子ꎻ 香蕉枯萎病
Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＦｏＡＰ１ ｉｎ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｃｕｂｅｎｓｅ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ
ｈｏｓｔ Ｍｕｓａ ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ ＱＩ Ｘｉｎｇ￣ｚｈｕ１ꎬ２ꎬ ＹＡＮＧ Ｌａ￣ｙｉｎｇ２ꎬ３ꎬ ＧＵＯ Ｌｉ￣ｊｉａ２ꎬ３ꎬ ＨＵＡＮＧ Ｊｕｎ￣ｓｈｅｎｇ２ꎬ３
( １ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙꎬ Ｈａｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｈａｉｋｏｕ ５７０２２８ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｈａｉｋｏｕ ５７１１０１ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔ Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ａｌｉｅｎ Ｐｅｓｔｓꎬ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｈａｉｋｏｕ ５７１１０１ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｏ ｅｌｕｃｉｄａｔｅ ｔｈａｔ ＡＰ１ ｉｎ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ.ｓｐ. ｃｕｂｅｎｓｅ ｒａｃｅ ４(Ｆｏｃ４) ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏ￣
ｇｅｎｅｓｉｓ ｔｏ ｈｏｓｔ Ｍｕｓａ ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ. ＰＣＲ ａｎｄ ＲＴ￣ＰＣＲ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｌｏｎｅ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ａｎｄ ｃＤＮＡ ｏｆ ＡＰ１
ｆｒｏｍ Ｆｏｃ４ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｆｏ５１７６(ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
ｎｕｍｂｅｒ: ＡＦＱＦ０１００１４８２.１) . ＰＥＧ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｒｅａｔ ｔｈｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ
ＡＰ１. ＱＲＴ￣ＰＣＲ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ＡＰ１. Ｔｈｅ ｒｏｏｔｓ ｏｆ ｂａｎａｎａ ｓｅｅｄ￣
ｌｉｎｇｓ ｓｐｒａｙｅｄ ｗｉｔｈ ｓｐｏｒｅ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃＤＮＡ(１ ７７０ ｂｐ)ｏｆ ＡＰ１
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｃｏｄｅｄ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ６３.９ ｋＤ(５８９ ａａ)ꎬ ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ａ ｔｙｐｉｃａｌ ｂＺＩＰ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒꎬ
ｎａｍｅｄ ＦｏＡＰ１ ａｎｄ ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ(ＪＱ９６５６６５) . Ｔｈｅ ａｅｒｉａｌ ｍｙｃｅｌｉａ ｏｆ ＦｏＡＰ１ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｇｒｅａｔ￣
ｌｙ ｒｅｄｕｃｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｈｙｐｈａｅ ｗａｓ ｓｅｖｅｒｅｌｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ. Ｔｈｅ ＦｏＡＰ１ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｓｅｎ￣
ｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｂｕｔ ａｔｔｅｎｕａｔｅ ｔｈｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｆｏｃ４.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｆｏｃꎻ ｒａｃｅ４ꎻ ＦｏＡＰ１ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒꎻ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｗｉｌｔ ｏｆ ｂａｎａｎａ
中图分类号: Ｓ４３２.４ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１３)０６￣０５９６￣１０
由尖孢镰刀菌古巴专化型引起的香蕉枯萎病ꎬ
又称香蕉巴拿马病ꎬ是一种对全世界香蕉生产造成
巨大损失的植物疾病[１]ꎮ 为防止这种疾病在全世
界香蕉产区蔓延对其进行防治ꎬ不少学者都对该病
的病原菌入侵香蕉植株的分子机理进行过研究ꎬ但
并没有取得突破性进展ꎮ 最近ꎬ一种尖孢镰刀菌
６期 齐兴柱ꎬ等:ＦｏＡＰ１基因在香蕉枯萎病菌致病过程中的功能分析
Ｆｏ５１７６菌株的全基因组序列信息被公开ꎬ由于香
蕉枯萎病病原菌强致病性生理小种 Ｆｏｃ４ 与
Ｆｏ５１７６同属镰刀菌属ꎬ基因组序列高度同源ꎬ为研
究者借助相关信息研究香蕉枯萎病菌的致病机理
及开发新的杀菌剂从而控制香蕉枯萎病的危害提
供了便利ꎮ
在植物病原菌入侵寄主早期ꎬ植物寄主最明显
的防御反应之一就是活性氧迸发[２~４]ꎮ 植物病原
菌也通过进化发展出了许多对抗策略ꎬ包括酶促反
应和非酶促反应使活性氧迸发产生的活性氧物质
(Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓꎬＲＯＳ)降解来达到成功入
侵寄主的目的[５~８]ꎮ 在植物与病原真菌相互作用
过程中ꎬ转录因子通过调控相关酶基因表达来降解
源自寄主的 ＲＯＳ 是消除氧化胁迫的重要方
式[９~１１]ꎬ降解相关的酶包括超氧化物歧化酶ꎬ过氧
化氢酶ꎬ过氧化物酶等ꎬ都在这个过程中起重要作
用[１２~１４]ꎮ 比如ꎬ酿酒酵母( ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ￣
ａｅ)转录因子 ＹＡＰ１作为酵母对外源氧化胁迫作出
应答的最重要的决定因素之一ꎬ负责激活多个清除
ＲＯＳ的基因的表达[１５~１８]ꎮ 在裂殖酵母(Ｓｃｈｉｚｏｓａｃ￣
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ )中ꎬ有丝分裂激活蛋白激酶
(ｍｉｔｏｇｅｎ￣ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅꎬＭＡＰＫ) Ｓｔｙ１ 信
号途径ꎬ与类 ＹＡＰ１ 转录因子 ＰＡＰ１ 一起ꎬ调节基
因对氧化胁迫做出应答[１９]ꎮ 在水稻稻瘟病菌
(Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ)中ꎬＭｏＡＰ１ 的删除表明ꎬ无
论是菌丝还是孢子ꎬ其对 Ｈ２Ｏ２ 的敏感性都增加
了ꎮ 同时ꎬＭｏＡＰ１ 的删除也损害了稻瘟病菌对水
稻的致病能力[２０]ꎮ 到目前为止ꎬＹＡＰ１ 在多个病
原真菌中的同源蛋白都已经被鉴定[２１~２３]ꎮ 它们在
忍受外源胁迫方面的功能相似ꎬ但在致病能力上不
一致ꎮ 在玉米黑粉菌(Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ)ꎬ链格孢菌
(Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ)和白色念珠菌(Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉ￣
ｃａｎｓ)中ꎬ由 ＡＰ１介导的去 ＲＯＳ毒性是它们具有致
病能力的一个决定性因素ꎬ但是在玉米小斑病菌
(Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ)和烟曲霉菌(Ａｓｐｅｒ￣
ｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ)中ꎬ由 ＡＰ１ 介导的去除 ＲＯＳ 毒性
则与它们的致病能力没有关系[２１ꎬ２３]ꎮ
由于众多文献资料表明ꎬ病原真菌中的 ＡＰ１
转录因子参与了抗氧化胁迫基因的表达调控ꎬ因
此ꎬ本研究也希望探讨 Ｆｏｃ４ 中的 ＡＰ１ 基因是否也
与病原菌及寄主互作中的抗氧化胁迫有关以及
ＡＰ１基因的缺失是否对 Ｆｏｃ４的致病力有影响ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 供试菌株及培养条件
供试菌株为 ２００５年分离自海南乐东的尖孢镰
刀菌古巴专化型 ４ 号生理小种(Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏ￣
ｒｕｍ ｆ.ｓｐ. ｃｕｂｅｎｓｅ ｒａｃｅ ４ꎬＦｏｃ４)Ｂ２菌株ꎮ 真菌菌株
的培养采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(ＰＤＡ)和马
铃薯葡萄糖培养基(ＰＤＢ)ꎮ
１.２ 供试香蕉苗
选用海南儋州组培厂生产的普通香蕉(巴西
蕉)袋装苗和椰糠培养基培养的杯装苗作为供试
材料ꎮ
１.３ 试剂和引物
ＤＮＡ的提取采用 ＣＴＡＢ法进行ꎬＲＮＡ 的提取
采用北京天根生化科技有限公司公司的植物总
ＲＮＡ提取试剂盒进行ꎮ 反转录试剂盒采用大连宝
生物工程有限公司(ＴａＫａＲａ)的产品ꎮ 荧光定量
ＰＣＲ采用北京百泰克生物技术有限公司的荧光定
量 ＰＣＲ试剂盒(ＳＹＢＲ)进行ꎮ ＰＣＲ 引物(表 １)由
北京三博远志生物技术有限责任公司合成ꎮ
１.４ ＦｏＡＰ１ 转录因子的克隆及生物信息学分析
鉴定
考虑到多种病原真菌中 ＡＰ１ 转录因子都参与
了抗寄主的氧化胁迫ꎬ以水稻稻瘟病 ＭｏＡＰ１ 基因
在 ＮＣＢＩ网站进行 ＢＬＡＳＴꎬ查找到 Ｆｏ５１７６ 菌株的
ＡＰ１同源基因ꎮ 以 Ｆｏ５１７６ 菌株 ＡＰ１ 基因的基因
组序列为模版ꎬ设计引物ꎬ再以 Ｆｏｃ４ Ｂ２ 菌株基因
组 ＤＮＡ 为模版ꎬＰＣＲ 扩增ꎬ克隆及测序获得了
Ｆｏｃ４ Ｂ２菌株的 ＡＰ１ 基因的基因组序列ꎮ 然后利
用在线 ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ 软件 ｈｔｔｐ: / / ｌｉｎｕｘ１.ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ.ｃｏｍ /
ｂｅｒｒｙ.ｐｈｔｍｌ预测其 ｃＤＮＡ序列及蛋白质序列ꎬ并在
ｃＤＮＡ 序列起始密码子和终止密码子附近设计引
物(表 １)ꎬ并以 Ｆｏｃ４总 ＲＮＡ反转录的 ｃＤＮＡ为模
板ꎬ进行 ＰＣＲ扩增并克隆 Ｆｏｃ４ ＡＰ１基因 ｃＤＮＡ编
码序 列ꎮ 利 用 ＮＣＢＩ 的 Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎｓ
Ｓｅａｒｃｈ 在线软件预测了蛋白质结构域ꎮ 参考
ＧｅｎＢａｎｋ 数据库获得其它相关物种的 ＡＰ１ 序
列ꎮ 应用 ＣｌｕｓｔａｌＸ 软件对 Ｆｏｃ４ 的 ＡＰ１ 及其同
源蛋白序列进行多重序列比对以鉴定它们之间
的同源性ꎻＭＥＧＡ ４.０ 软件对所获得的序列构建
７９５
植物病理学报 ４３卷
书书书
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８９５
６期 齐兴柱ꎬ等:ＦｏＡＰ１基因在香蕉枯萎病菌致病过程中的功能分析
了 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣Ｊｏｉｎｉｎｇ系统发育树ꎬ并用 Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ 方
法(１ ０００ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓꎻ ｓｅｅｄ ＝ ６４ ２３８)对该树进行统
计学检验ꎮ
１.５ ＦｏＡＰ１ 基因敲除及基因缺失突变体的氧化
胁迫敏感性分析
以 Ｆｏｃ４ 基因组 ＤＮＡ 为模版ꎬ用带有相应酶
切位点的引物 ＦｏＡＰＡｓꎬ ＦｏＡＰＡａꎬ ＦｏＡＰＢｓꎬＦｏＡＰ￣
Ｂａ(表 １)分别扩增 ＡＰ１ 基因组上下游序列各 ７９０
ｂｐ左右ꎬ再分别构建到基因敲除载体 ｐＣＸ６２ 的潮
霉素基因表达元件两侧ꎬ然后利用北京天根公司的
ｌｏｎｇ￣ＰＣＲ Ｍｉｘ进行 ＰＣＲ扩增获得含有 Ａ￣潮霉素￣
Ｂ(Ａ为上游片段ꎬＢ为下游片段)的 ＤＮＡ片段ꎬ转
化 Ｆｏｃ４ Ｂ２ 菌株原生质体[２４]ꎬ并筛选潮霉素抗性
转化子ꎬ筛选转化子的 ＰＣＲ 引物分别为 ＦｏＡＰ１￣
ＡｓꎬＨｙｇ￣ａꎬＨｙｇ￣ｓꎬＦｏＡＰ１￣ＢａꎬＡＰ１ｐｓꎬＡＰ１ｐａꎮ 为进
一步确定 Ｆｏｃ４的 ＡＰ１基因敲除转化子ꎬ再次半定
量 ＲＴ￣ＰＣＲ方法对普通 ＰＣＲ检测确定为基因缺失
突变体的转化子进行转录水平的检测ꎮ
为了检测被鉴定为基因敲除转化子的突变体
对外源氧化胁迫的敏感性ꎬ分别将所有基因敲除转
化子接种直径 ０.５ ｃｍ 的菌饼到含有 ０ꎬ５ꎬ１０ 和 ２０
ｍｍｏｌ / Ｌ Ｈ２Ｏ２ 的 ＰＤＡ培养基中ꎬ２８℃培养 ３ ｄꎬ观
察结果ꎬ同时接种 Ｂ２菌株作为对照ꎮ
１.６ 致病性检测
根部的致病性检测采用灌根法ꎬ菌液准备:用
小瓶约 ２５ ｍＬ接菌ꎬ１８０ ｒｐｍ ２８℃摇床培养 ２ ｄꎬ用
６层擦镜纸超净台中过滤获得孢子液ꎬ然后用相同
的孢子数接大瓶 １８０ ｒｐｍ ２８℃摇菌培养 ３ ｄꎬ测孢
子浓度并稀释为 １０６ 个 / ｍＬ备用ꎮ 浇菌处理:浇菌
直接用椰糠培养基杯装苗ꎬ用 １０６ 个 / ｍＬ 孢子液ꎬ
ＦｏＡＰ１缺失突变体和 Ｂ２ 菌株分别各浇 ３０ 颗苗ꎬ
每颗苗浇菌 ５０ ｍＬꎮ 然后置于室内大棚培养ꎬ每 ３
天浇水一次ꎮ 发病症状等级的分级标准如下:０
级:无症状ꎻ１ 级:球茎有黄线ꎻ２ 级:黄线加褐色斑
点ꎻ３级:球茎部位褐化占总体约 １ / ３ꎻ４ 级:球茎部
位褐化约占总体 １ / ２ꎻ５级:球茎部位褐化约占总体
积的 ３ / ４ꎻ６ 级:球茎部位褐化约占总体积的全部ꎮ
使用公式:病情指数 ＝ {[(发病级数 ×该级株
数)] / (最高级数×总株数)}×１００计算香蕉苗病情
指数ꎮ 同时ꎬ使用公式:发病率(％)＝ (发病株数 /
实验测试总株数)×１００计算测试香蕉苗的发病率ꎮ
１.７ ｑＲＴ￣ＰＣＲ分析基因表达动态
将在 ＰＤＢ 液体培养基中培养 ６ ｄ 的 Ｆｏｃ４ Ｂ２
菌株在超净工作台中用 ６ 层擦镜纸过滤收集孢子
液ꎬ然后按 １ ∶５０的比例将孢子液接种到新的 ＰＤＢ
培养基中ꎬ２８℃ꎬ１２０ ｒｐｍ振荡培养 １２ ｈꎬ然后分别
加入洗干净而且根系发达的巴西蕉袋装苗ꎬ用细线
将苗固定于瓶口ꎬ并让苗根部浸入菌液ꎬ继续轻微
摇动培养ꎬ并于 ２４ ｈ 收集香蕉苗根及其附着在根
上的菌丝ꎬ用同样的方法处理 ８号转化子并于 ２４ ｈ
取样ꎬ按北京天根公司的植物总 ＲＮＡ 提取试剂盒
说明书提取处理后菌株的总 ＲＮＡ(提取步骤中直
接去除 ＤＮＡ污染)ꎮ 荧光定量 ＰＣＲ分析采用北京
百泰克生物技术公司的 ２ ×Ｏｎｅ￣ｓｔｅｐ ＳＹＢＲ Ｒｅａｌ￣
ｔｉｍｅ ＲＴ￣ＰＣＲ试剂盒在 ＢＩＯ￣ＲＡＤ公司的荧光定量
ＰＣＲ分析系统(ＭｉｎｉＯｐｔｉｃｏｎＴＭ Ｓｙｓｔｅｍ)中进行检
测ꎬ具体操作按照仪器使用说明书进行ꎮ 反应总体
系为 ２５ μＬꎬ包含 ７.６５ μＬ ＲＮａｓｅ￣ｆｒｅｅ Ｈ２Ｏ、１２.５ μＬ
２×Ｏｎｅ￣ｓｔｅｐ ＳＹＢＲ ｍｉｘ、１０ μｍｏｌＬ－１的引物各 １.３
μＬ、ＲＴ￣ＰＣＲ ｍｉｘ １.２５ μＬ、模版 ＲＮＡ １ μＬꎮ 扩增程
序为:９４℃预变性 ３０ ｓꎻ９４℃ ５ ｓꎬ５０~ ５３℃ ２０ ｓ(梯
度退火)ꎬ７２℃ ２０ ｓꎬ读取荧光值ꎬ４５ 个循环ꎮ 程序
运行完毕ꎬ用 Ｏｐｔｉｃｏｎ ＭｏｎｉｔｏｒＴＭ Ｖｅｒｓｉｏｎ ３.１软件读
取各样品管 Ｃｔ 值ꎬ以 ２－△△Ｃｔ法[２５]ꎬ计算各被检测
基因的相对表达水平ꎮ
２ 结果
２.１ ＦｏＡＰ１基因 ｃＤＮＡ的克隆及其鉴定
参考水稻稻瘟病菌 ＭｏＡＰ１基因序列及尖孢镰
刀菌 Ｆｏ５１７６ 菌株基因组序列ꎬ克隆获得了 Ｆｏｃ４
Ｂ２菌株的 ＡＰ１基因的 ｃＤＮＡ编码序列(图 １)及基
因组序列ꎮ 经 ＮＣＢＩ 网站 ＢＬＡＳＴ 比对发现ꎬ在线
ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ软件预测的 Ｆｏｃ４ ＡＰ１基因 ｃＤＮＡ编码序
列与实际测序获得的编码序列没有差异ꎮ 实际测
序获得的 ＡＰ１基因 ｃＤＮＡ编码序列与其基因组序
列的 ＢＬＡＳＴ比对发现基因组序列编码区存在 ２个
内含子ꎬ分别为 ５６ ｂｐ和 ５８ ｂｐꎮ Ｆｏｃ４中 ＡＰ１ 转录
因子的 ｃＤＮＡ编码序列长 １ ７７０ ｂｐꎬ编码 ６３.９ ｋＤａ
(５８９ ａａ)蛋白ꎬ命名为 ＦｏＡＰ１ꎮ 将 ｃＤＮＡ编码序列
Ｆｉｇ. １ Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ
９９５
植物病理学报 ４３卷
ｆｏｒ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＦｏＡＰ１
Ｍ: １ ｋｂ Ｌａｄｄｅｒ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ｆｒｏｍ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ.
递交到 ＧｅｎＢａｎｋ获得登录序列号 ＪＱ９６５６６５ꎮ 蛋白
质结构域分析显示 ＦｏＡＰ１ 是一个典型的 ｂＺＩＰ 型
转录因子ꎬ其 １６２ ~ ２３３ 位氨基酸序列构成 ｂＺＩＰ
结构域ꎬ２５９ ~ ５５５ 位氨基酸序列构成 ＰＡＰ１ 结
构域ꎮ
根据 Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｓｅａｒｃｈ在线软件查找
到 ５ 个同属于 ｂＺＩＰ 结构域的同源蛋白片段ꎬ并将
其与进行 ＦｏＡＰ１的 １６２~２３３位氨基酸序列片段进
行比对(图 ２Ａ)ꎮ 同时ꎬ在 ＮＣＢＩ 非冗余蛋白序列
库中对 ＦｏＡＰ１ 进行 ＢＬＡＳＴＰ 同源检索和比对分
析ꎬ获得来自不同植物病原真菌的 １５ 个 ＡＰ１ 蛋白
序列ꎮ 针对 ＦｏＡＰ１与这 １５ 个 ＡＰ１ 序列进行多重
比对ꎬ并构建系统进化树 (图 ２Ｂ)ꎮ 结果表明ꎬ
ＦｏＡＰ １与来自尖孢镰刀菌Ｆｏ５１７６菌株(Ｆｕｓａｒｉｕｍ
Ｆｉｇ. ２ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｂＺＩＰ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｏｆ ＡＰ１ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ
Ａ: Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｂＺＩＰ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＦｏＡＰ１ ｆｒｏｍ Ｆｏｃ４ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣｌｕｓｔａｌＷ
ｐｒｏｇｒａｍ. Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ｆｒｏｍ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ: ＧＩ:７５２８１８２５(Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ)ꎬ ＧＩ:７５２８２２５８(Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ)ꎬ
ＧＩ:７４９５８６９０(Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ)ꎬ ＧＩ:８２２１７４４５(Ｒａｎａ ｃａｔｅｓｂｅｉａｎａ)ꎬ ＧＩ:１１６９０８４(Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ ｃｒｉｓｐｕｍ) .
Ｂ: ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ(ＮＪ)ｏｆ ＦｏＡＰ１ꎬ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｍｅｇａ ４.０ꎬ ｗｉｔｈ １０００ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｌｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＡＰ１
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｆｒｏｍ ｆｕｎｇｉ. Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＡＰ１ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｗｅｒｅ ｆｒｏｍ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ: Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ
(ＥＧＹ１７９０６)ꎬ Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ(ＥＪＰ６７０７６)ꎬ Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ(ＥＦＱ３０２４４)ꎬ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ(ＥＧＸ８７７５５)ꎬ
Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ(ＣＣＦ３３９８２)ꎬ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ(ＥＧＲ４７２２２)ꎬ Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ(ＥＦＺ０２６００)ꎬ
Ｎｅｃｔｒｉａ ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ(ＥＨＫ２３８８８)ꎬ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ(ＥＫＪ６７８１９)ꎬ Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ ＰＨ￣１(ＸＰ＿３８８９７６)ꎬ
Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ(ＥＧＥ７７５０１)ꎬ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ(Ｐ１９８８０)ꎬ Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ(ＮＰ＿５９３６６２)ꎬ
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ Ｆｏ５１７６( ＥＧＵ８４６３５)ꎬ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ(ＭＧＧ１２８１４)ꎬ ｔｈｅ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ ｗｅｒｅ ｆｒｏｍ ＮＣＢＩ.
００６
６期 齐兴柱ꎬ等:ＦｏＡＰ１基因在香蕉枯萎病菌致病过程中的功能分析
ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ５１７６)ꎬ血红丛赤壳菌(Ｎｅｃｔｒｉａ ｈａｅｍａｔｏ￣
ｃｏｃｃａ ｍｐＶＩ)ꎬ小麦冠腐病菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｇｒａ￣
ｍｉｎｅａｒｕｍ)和玉蜀黍赤霉菌(Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ ＰＨ￣１)
的 ＡＰ１ 蛋白聚为一个类群ꎮ 根据 Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ
Ｄｏｍａｉｎｓ Ｓｅａｒｃｈ 在线软件预测及图 ２ 对 ＡＰ１ 蛋白
进化树的分析和 ｂＺＩＰ 结构域的比对结果ꎬ将
ＦｏＡＰ１鉴定为 Ｆｏｃ４ 的具有典型 ｂＺＩＰ 结构域的
ＡＰ１转录因子ꎮ
２.２ ＦｏＡＰ１ 基因敲除缺失突变体的获得及其表
型观察
为了探讨 ＦｏＡＰ１在 Ｆｏｃ４致病过程中的作用ꎬ
通过构建基因敲除载体 ｐＣＸ６２￣ＦｏＡＰ１ꎬ并以此载
体为模板ꎬＰＣＲ扩增获得含有 Ａ￣潮霉素￣Ｂ的 ＤＮＡ
片段ꎬ转化 Ｆｏｃ４ Ｂ２菌株原生质体ꎬ获得了 １０个潮
霉素抗性转化子ꎮ 让转化子在含潮霉素的 ＰＤＡ培
养基上连续生长 ４ 代以后分别提取其基因组
ＤＮＡꎬ再分别以 ＦｏＡＰ１￣Ａｓ、Ｈｙｇ￣ａꎬＨｙｇ￣ｓ、ＦｏＡＰ１￣
Ｂａ和 ＡＰ１ｐｓ、ＡＰ１ｐａ(表 １) ３ 对引物进行 ＰＣＲ 检
测ꎬ设计检测引物(图 ３Ａ)ꎬ得出 ＰＣＲ检测结果(图
３ＢꎬＣꎬＤ)ꎮ 为进一步证实 ＰＣＲ 检测结果ꎬ再次用
半定量 ＲＴ￣ＰＣＲ方法对转化子进行转录水平的检
测(图 ３Ｅ)ꎮ 结果表明ꎬ其中 ８ 个转化子均为
ＦｏＡＰ １基因缺失突变体( １号转化子根据ＰＣＲ检
Ｆｉｇ. ３ Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＦｏＡＰ１ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｆｏｃ４
Ａ: ＦｏＡＰ１ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｙ. Ｔｈｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ＦｏＡＰ１ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｗａｓ ｒｅｐｌａｃｅｄ ｗｉｔｈ ａ １.４￣ｋｂ ｆｒａｇｍｅｎｔ
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｃａｓｓｅｔｔｅ(ＨＰＨ) ｔｏ ｃｒｅａｔｅ ａ Ｆｏａｐ１ ｍｕｔａｎｔ. Ｔｈｒｅｅ ｐａｉｒ ｐｒｉｍｅｒｓ(ＦｏＡＰ１￣Ａｓꎬ Ｈｙｇ￣ａꎻ
Ｈｙｇ￣ｓꎬ ＦｏＡＰ１￣Ｂａꎻ ＡＰ１ｐｓꎬ ＡＰ１ｐａ)ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｖａｌｉｄａｔｅ Ｆｏａｐ１ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｂｙ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ.
(Ｓｃａｌｅ ｂａｒ＝ １ ｋｂ) . Ｂ:Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ＦｏＡＰ１￣Ａｓｅｎ ａｎｄ Ｈｙｇ￣ａｎｔ.
Ｃ:Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｈｙｇ￣ｓ ａｎｄ ＦｏＡＰ１￣Ｂａ. Ｄ:Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ＡＰ１ｐｓ ａｎｄ ＡＰ１ｐａ. “ｃ” ｉｓ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ. Ｅ: Ｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
(ＲＴ) ￣ＰＣＲ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｔｏ ｃｏｎｆｉｒｍ ｔｈｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＦｏＡＰ１ ｇｅｎｅ. Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＦｏＡＰ１
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｗａｓ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ＲＴ￣ＰＣＲꎬ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｏｆ ｔｈｅ ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ
ＦｏＡＰ１ ｍｕｔａｎｔｓ. Ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ｏｆ ＦｏＡＰ１.
１０６
植物病理学报 ４３卷
测结果不能确定为基因缺失突变体ꎬ６ 号转化子由
于在传代过程中污染而未做转录水平的检测)ꎮ
为了确定 ＦｏＡＰ１是否影响 Ｆｏｃ４ 的菌丝生长ꎬ
同时将所有 ＦｏＡＰ１的 ８个基因缺失突变体和 Ｆｏｃ４
野生型 Ｂ２ 菌株接种到 ＰＤＡ 培养基ꎬ比较它们的
生长差异ꎬ结果发现 ＦｏＡＰ１ 的基因缺失突变体菌
落外缘气生菌丝几乎没有ꎬ这种特征也与稻瘟病中
ＭｏＡＰ１缺失后的生长特征类似[２０]ꎮ 显微镜下观
察 ＦｏＡＰ１的基因缺失突变体的菌丝及孢子与野生
型 Ｂ２菌株没有明显差别(图片未显示)ꎮ
２.３ ＦｏＡＰ１ 基因缺失突变体对外源氧化胁迫不
敏感
考虑到多种真菌中的 ＡＰ１ 转录因子都参与调
控抗氧化胁迫基因的表达ꎬ因此检测了基因敲除转
化子对外源氧化胁迫敏感性ꎮ 结果发现野生型 Ｂ２
菌株和突变体在含 ０ꎬ５ꎬ１０ 和 ２０ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｈ２Ｏ２ 的
ＰＤＡ培养基中的生长均没有明显差异(图片未列
出)ꎮ 因此认为 ＦｏＡＰ１ 基因缺失突变体对外源氧
化胁迫不敏感ꎮ 在 Ｆｏｃ４ 中ꎬＦｏＡＰ１ 转录因子不参
与调控抗氧化胁迫基因的表达ꎮ
２.４ ＦｏＡＰ１基因缺失降低了其致病能力
为明确 ＦｏＡＰ１ 是否参与了 Ｆｏｃ４ 对香蕉苗的
致病过程ꎬ随机挑选地 ２ 号号转化子(Ｆｏａｐ１￣２)及
８号转化子(Ｆｏａｐ１￣８)进行致病性检测ꎮ 分别将野
生型 Ｂ２ 菌株ꎬＦｏａｐ１￣２ 和 Ｆｏａｐ１￣８ 的孢子悬浮液
( ~１×１０６ｃｏｎｉｄｉａ / ｍＬ)浇到椰糠培养的根系发达的
健康香蕉苗(Ｍｕｓａ ＡＡＡ Ｇｉａｎｔ Ｃａｖｅｎｄｉｓｈ ｃｖ Ｂｒａｚｉｌ)
根部ꎮ 在室内大棚中培养约 ２５ ｄ 后ꎬ叶片边缘开
始出现枯萎变黄的现象ꎮ 培养约 ３５ ｄ 后ꎬ随机挑
选其中疾病特征明显的 Ｂ２ 菌株感染苗、Ｆｏａｐ１￣２ꎬ
Ｆｏａｐ１￣８感染苗及未浇菌处理的空白对照苗各 １
棵ꎬ将其球茎切开观察其差异ꎮ 结果发现 Ｂ２ 菌株
感染苗ꎬＦｏａｐ１￣２及 Ｆｏａｐ１￣８感染苗球茎部位均有
明显症状ꎻ然后将所有检测香蕉苗球茎切开ꎬ拍照ꎬ
并根据发病症状等级的分级标准确定每株检测苗
的症状等级ꎮ 除一株接种 Ｂ２ 的苗被虫蛀作废外ꎬ
有效结果为 ８９棵苗ꎬ接种 Ｂ２菌株的 ２９棵苗ꎬ接种
Ｆｏａｐ１￣８和 Ｆｏａｐ１￣８突变体的各 ３０ 棵苗ꎮ 根据 ３
种菌株接种香蕉苗发病症状等级统计数据ꎬ最后根
据 １.６的公式计算得出接种 Ｂ２菌株的香蕉苗病情
指数为 ３２.２％ꎬ发病率为 ９６.６％ꎻ接种 Ｆｏａｐ１￣２ 突
变体的香蕉苗病情指数为 ２０.５％ꎬ发病率为 ９０％ꎻ
接种 Ｆｏａｐ１￣８突变体的香蕉苗病情指数为 １９.４％ꎬ
发病率为 ８３.３％(表 ２)ꎮ 这个结果表明 Ｆｏａｐ１ 基
因缺失降低了突变体对香蕉苗的致病能力ꎮ
２.５ ＦｏＡＰ１转录因子调控下游基因的表达情况
通过参考 ＭｏＡＰ１所调控的下游基因ꎬ筛选了
１３个 ＦｏＡＰ１ 可能调控的下游基因ꎬ并用 ｑＲＴ￣ＰＣＲ
方法检测了它们在 Ｆｏａｐ１￣８突变体中的表达情况ꎮ
分别采用香蕉苗根部诱导 ２４ ｈ 的 Ｂ２ 菌株及
Ｆｏａｐ１￣８作为实验组ꎬ未处理的 Ｂ２ 菌株作为对照
组ꎬβ￣ａｃｔｉｎ(表 １)为内参ꎮ 实验结果表明:在所检
测的 １３ 个可能的下游基因中ꎬ有 ９ 个基因在
Ｆｏａｐ１￣８和野生型 Ｂ２ 菌株中的表达有明显差异ꎬ
它们分别是 Ｚｎ２＋依赖型金属蛋白酶(Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏ￣
ｔｅａｓｅ)基因ꎬＭＡＰ 激酶(Ｆｏｍｐｓ１)基因ꎬ琥珀酸半醛
脱氢酶 ２( ｓｕｃｃｉｎａｔｅ￣ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ２)
基因ꎬＭＡＰ 激酶(Ｆｏｍｋ１)基因ꎬ Ｃ６ 转录因子 ＯｅｆＣ
(Ｃ６ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＯｅｆＣ)基因ꎬ４ 氨基丁酸转
氨酶(４￣ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ)基因ꎬ质子
依赖型的 ＡＴＰ酶(Ｐ￣ｔｙｐｅ ＡＴＰａｓ)基因ꎬ乙酰转移酶
(ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ)基因和琥珀酸半醛脱氢酶 １
(ｓｕｃｃｉｎａｔｅ￣ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ１)基因(图
４)ꎮ 其中ꎬ琥珀酸半醛脱氢酶 １ 基因ꎬ琥珀酸半醛
脱氢酶 ２基因ꎬＣ６ 转录因子 ＯｅｆＣ 基因ꎬ４ 氨基丁
酸转氨酶基因和乙酰转移酶基因的表达差异非常
明显ꎮ
Ｔａｂｌｅ ２ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔｓ ｏｆ ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ Ｂ２ ｓｔｒａｉｎꎬ Ｆｏａｐ１￣２ ａｎｄ Ｆｏａｐ１￣８ ｍｕｔａｎｔ
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｒａｔｅ / ％ Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎｄｅｘ
Ｂａｎａｎａ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｂ２ ｓｔｒａｉｎ ９６.６ ３２.２
Ｂａｎａｎａ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｆｏａｐ１￣２ ｍｕｔａｎｔ ９０ ２０.５
Ｂａｎａｎａ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｆｏａｐ１￣８ ｍｕｔａｎｔ ８３.３ １９.４
２０６
６期 齐兴柱ꎬ等:ＦｏＡＰ１基因在香蕉枯萎病菌致病过程中的功能分析
Ｆｉｇ. ４ Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｏｗｎ￣
ｓｔｒｅａｍ ｇｅｎｅｓ ｍａｙ ｂｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ
ＦｏＡＰ１ ｉｎ ｔｈｅ ΔＦｏａｐ１￣８ ｍｕｔａｎｔ ａｎｄ Ｂ２
ｓｔｒａｉｎｓ
Ｉｎ ｗｈｉｃｈꎬ ｔｈｅ ｏｎｅ ｉｓ “Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ”ꎬ ｔｈｅ ｔｗｏ ｉｓ “ｖａｃｕｏｌａｒ
ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ １”ꎬ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｉｓ “ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ Ｆｏｍｐｓ１”ꎬ ｔｈｅ
ｆｏｕｒ ｉｓ “ｓｕｃｃｉｎａｔｅ￣ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ２”ꎬ ｔｈｅ ｆｉｖｅ ｉｓ
“ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ Ｆｏｍｋ１”ꎬ ｔｈｅ ｓｉｘ ｉｓ “Ｃ６ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ
ＯｅｆＣ”ꎬ ｔｈｅ ｓｅｖｅｎ ｉｓ “４￣ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ”ꎬ ｔｈｅ
ｅｉｇｈｔ ｉｓ “Ｐ￣ｔｙｐｅ ＡＴＰａｓｅ”ꎬ ｔｈｅ ｎｉｎｅ ｉｓ “ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ”ꎬ
ｔｈｅ ｔｅｎ ｉｓ “ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ａｍｉｄｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ”ꎬ ｔｈｅ ｅｌｅｖｅｎ ｉｓ “ｓｕｃｃｉ￣
ｎａｔｅ￣ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ１”ꎬ ｔｈｅ ｔｗｅｌｖｅ ｉｓ “ｐｅｒｏｘｉｎ￣
３”ꎬ ｔｈｅ ｔｈｉｒｅｅｎ ｉｓ “Ｅｐｌ１ ｐｒｏｔｅｉｎ” .
３ 讨论与结论
本文鉴定了尖孢镰刀菌古巴专化型 ４ 号生理
小种 Ｆｏｃ４的 ＡＰ１转录因子(ＦｏＡＰ１)ꎬＦｏＡＰ１ 与水
稻稻瘟病菌 ＭｏＡＰ１ 蛋白的氨基酸序列同源性为
６６％ꎬ与裂殖酵母 ＰＡＰ１ 的氨基酸序列同源性为
４１％ꎬ与真菌 ＡＰ１ 蛋白家族其它成员的氨基酸序
列也高度同源[２６]ꎬ在其蛋白序列 Ｎ￣端有一个典型
的 ｂＺＩＰ结构域ꎮ
病原真菌在入侵寄主过程中会遭遇多重胁迫ꎬ
包括寄主通过有氧呼吸和代谢产生的氧化胁迫等
有毒的副产品ꎮ 因此ꎬ为了生存ꎬ病原真菌必需发
展进化出一套适应来自寄主细胞内外的胁
迫[２７ꎬ２８]ꎮ 在病原真菌中ꎬＡＰ１ 转录因子大多都作
为主要的调节因子参与了激活抵抗寄主产生的氧
化胁迫相关基因的表达ꎮ 比如ꎬ在白色念珠菌中ꎬ
删除 ＹＡＰ１导致其对氧化胁迫的耐受性及致病能
力均有所降低[２９]ꎬ对玉米黑粉菌(Ｕ. ｍａｙｄｉｓ)的研
究也表明其 ＹＡＰ１ 在消除 Ｈ２Ｏ２ 及成功侵入玉米
植株过程中起了关键的作用[１０]ꎮ 然而ꎬ和大多数
病原真菌的 ＡＰ１转录因子参与抗外源氧化胁迫的
功能不一样ꎬ本研究的实验结果表明 ＦｏＡＰ１ 基因
缺失突变体对外源 Ｈ２Ｏ２ 的氧化胁迫敏感性较弱ꎮ
但致病性检测实验表明 ＦｏＡＰ１ 基因缺失突变体的
致病能力明显下降ꎮ
为了进一步探究 ＦｏＡＰ１基因缺失突变体致病
力下降的原因ꎮ 检测了 ＦｏＡＰ１ 可能调控的下游基
因的表达情况ꎮ 结果表明ꎬＦｏＡＰ１ 转录因子对琥
珀酸半醛脱氢酶 １ꎬ琥珀酸半醛脱氢酶 ２ꎬ乙酰转移
酶ꎬ４氨基丁酸转氨酶和 Ｃ６转录因子 ＯｅｆＣ的表达
具有非常明显的调控作用ꎮ
在水稻稻瘟病菌中ꎬ琥珀酸半醛脱氢酶
(Ｍｏｓｓａｄｈ)和乙酰转移酶(Ｍｏａｃｔ)基因缺失突变体
都失去了侵入植物细胞的能力ꎮ 研究发现ꎬＭｏｓｓａｄｈ
和Ｍｏａｃｔ基因缺失突变体不仅菌丝不容易渗透到寄
主的细胞中去ꎬ而且丧失了形成入侵菌丝的能力从
而导致失去致病能力ꎮ 而琥珀酸半醛脱氢酶
(Ｍｏｓｓａｄｈ)和乙酰转移酶(Ｍｏａｃｔ)也是受稻瘟病菌
ＡＰ１基因(ＭｏＡＰ１)强烈调控的 ２ 个下游基因ꎮ 在
ＭｏＡＰ１基因缺失突变体中ꎬ由于 Ｍｏｓｓａｄｈ 和 Ｍｏａｃｔ
的表达受到严重的抑制ꎬ虽然不影响病菌的生长阶
段的发育ꎬ但是严重影响了孢子的产生及入侵菌丝
的生长能力[２０]ꎮ 而本研究的实验结果中ꎬＦｏＡＰ１基
因的缺失导致琥珀酸半醛脱氢酶和乙酰转移酶的表
达受到了严重的抑制ꎬ这一点ꎬ与 ＭｏＡＰ１ 基因缺失
突变体也是类似的ꎮ 由此ꎬ笔者推测ꎬＦｏＡＰ１基因缺
失突变体致病能力的降低至少部分归因于突变体菌
丝侵入寄主细胞的过程受到了阻碍ꎬ而且即使成功
侵入寄主细胞的菌丝ꎬ其生长也受到了抑制ꎮ 为了
证实这种推测ꎬ又做了 Ｂ２菌株及 Ｆｏａｐ１￣８对洋葱表
皮的穿透实验(图片未列出)ꎬ结果证实了我们的推
测ꎬＦｏａｐ１￣８菌丝在洋葱表皮细胞内的生长远不及
Ｂ２菌株在洋葱表皮细胞内的生长ꎮ
综上所述ꎬ本研究的结论认为ꎬＦｏＡＰ１ 是一个
典型的一个 ｂＺＩＰ型转录因子ꎬ虽然 ＦｏＡＰ１ 不参与
抗氧化胁迫基因的表达调控ꎬ但它通过调控琥珀酸
３０６
植物病理学报 ４３卷
半醛脱氢酶和乙酰转移酶等的表达影响 Ｆｏｃ４入侵
菌丝的生长ꎬ从而影响其致病能力ꎮ
参考文献
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ｍｅｄｉａｔｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｓ ｃｒｕｃｉａｌ ｆｏｒ ｐａｔｈｏ￣
ｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｃｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆｕｎｇｕｓ Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ
ｉｎ ｃｉｔｒｕｓ [ Ｊ] . ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｌａｎｔ￣ｍｉｃｒｏｂｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ
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ｐｅｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｍｏａｔｆ１ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ
ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｆｕｌｌ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｃｅ
ｂｌａｓｔ ｆｕｎｇｕｓ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ [Ｊ] . ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｌａｎｔ￣
ｍｉｃｒｏｂｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ ２０１０ꎬ ２３(８): １０５３－１０６８.
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ｖｅｒｇｅｎｔ ｃａｔａｌａｓｅ ｇｅｎｅｓ ａｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｄｕｒ￣
ｉｎｇ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ
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ｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｔｈａｔ ｉｓ ｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ
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４０６
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ｍｅｒ ｏｆ ｕｎｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ ａｌｐｈａ ｈｅｌｉｃｅｓ: ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ
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ｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ
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ｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｆｏｒ ｄｅｆｅｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｒｅａｃｔｉｖｅ
ｏｘｙｇｅｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｂｕｔ ｉｓ ｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ ｆｏｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉ￣
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责任编辑:张宗英
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