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Identification of pathogen causing black-stem on Cinnamomum kotoense

兰屿肉桂黑茎病病原菌的鉴定



全 文 :植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA  45(5): 552 ̄555(2015)
收稿日期: 2014 ̄09 ̄18ꎻ 修回日期: 2015 ̄05 ̄27
基金项目: 海南省科技基金项目资助(Rnd0524)
通讯作者: 缪卫国ꎬ教授ꎬ博士生导师ꎬ主要从事分子植物病理学的研究ꎻE ̄mail:miao@hainu.edu.cnꎮ
doi:10.13926 / j.cnki.apps.2015.05.014
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研究简报
兰屿肉桂黑茎病病原菌的鉴定
谢昌平1ꎬ 李宗来2ꎬ 陈 剑1ꎬ 郑妃庆1ꎬ 文衍堂1ꎬ 缪卫国1∗
( 1海南大学环境与植物保护学院ꎬ海口 570228ꎻ 2 海南佳维园艺有限公司ꎬ海口 570206)
Identification of pathogen causing black ̄stem on Cinnamomum kotoense  XIE Chang ̄
ping1ꎬ LI Zong ̄lai2ꎬ CHEN Jian1ꎬ ZHENG Fei ̄qing1ꎬ WEN Yan ̄tang1ꎬ MIAO Wei ̄guo1∗   ( 1 College of
Environment and Plant ProtectionꎬHainan UniversityꎬHaikou 570228ꎬ Chinaꎻ 2 Hainan Jiawei Gardening Co.ꎬ Ltd.ꎬHaikou
570206ꎬChina)
Abstract: Cinnamomum kotoense black ̄stem is a new disease first found in Hainan Province in recent years.
The symptoms of the black stem include brownish black streaks in the field in early stagesꎬblack necrosis and
yellowing leaves in later stages.The wilting plant eventually lead to death in its final stage. The pathogen causing
black stem of C. kotoense was identified as Phytophthora cinnamomi Rands from the isolatesꎬ based on
pathogenicity testꎬmorphological characteristics of the colonyꎬ hyphal swellingsꎬ sporangia on different solid
media and rDNA ̄ ITS sequence analyses. This is the first report of P. cinnamomi causing black ̄stem on
C. kotoense in China. The result could provide a reference for control of C. kotoense black ̄stem disease.
Key words: Cinnamomum kotoenseꎻ black ̄stem diseaseꎻ Phytophthora cinnamomi
文章编号: 0412 ̄0914(2015)05 ̄0552 ̄04
    兰屿肉桂又称平安树ꎬ为樟科、樟属的观叶常
绿小乔木ꎮ 原产台湾兰屿岛ꎬ是一种室内摆设的观
叶植物和园林景观树种之一ꎮ 具有驱逐室内污气、
净化空气和保护人体健康等作用ꎬ是理想的防污园
林绿化树种[1]ꎮ 目前国内关于兰屿肉桂的病害报
道很少ꎬ已经报道的病害有炭疽病、褐斑病和褐根
病[2]ꎬ但具体病原未见报道ꎮ
    2009年 10月ꎬ作者在海南省海口市附近的苗
圃中发现一种为害兰屿肉桂茎部的病害ꎬ发病率在
30%~ 40%ꎬ严重影响植株的生长ꎬ造成大量植株
死亡ꎬ给生产造成极大影响ꎮ 目前该病害在国内尚
未有报道ꎬ本研究对该病的症状进行描述和病原鉴
定ꎬ以期为病害的防控提供依据ꎮ
1  材料与方法
1.1  病株采集及症状观察
    兰屿肉桂黑茎病病株采自海南省海口市桂林
洋附近的某花圃ꎬ按常规方法对病株的症状进行描
述和拍摄ꎮ
1.2  菌株的分离
    采用常规组织分离法分离ꎬ无菌操作接种到马
铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上ꎬ待长出菌落后ꎬ
于 4℃下保存备用ꎮ
1.3  菌株的致病性测定
    分别采用刺伤和无伤接种ꎬ将分离菌株的菌饼
 
  5期 谢昌平ꎬ等:兰屿肉桂黑茎病病原菌的鉴定
贴在茎部上ꎬ每个处理 10 株ꎬ重复 3 次ꎮ 同时ꎬ以
10株作为对照ꎬ用与菌饼同样大小的琼脂块贴于
伤口ꎬ表面覆盖已灭菌的吸水纸ꎬ保湿培养 3~ 7 dꎬ
观察并记录发病情况ꎮ
1.4  病原菌菌落和形态学观察
    将病原菌分别接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养
基(PDA)、马铃薯胡萝卜琼脂培养基(PCA)、V8培
养基、大豆琼脂培养基 ( SA)、燕麦琼脂培养基
(OMA)、番茄琼脂培养基(TA)、胡萝卜琼脂培养
基(CA)和玉米粉琼脂培养基(CMA)上ꎬ25℃培养
5 d后ꎬ观察菌落的培养性状ꎬ包括菌落颜色、表面
形状、边缘形状、气生菌丝是否丰盛以及是否存在
菌丝膨大体等ꎻ采用菌丝丛水培法诱导孢子囊产
生ꎮ 观察孢子囊的形态和释放游动孢子情况及测
量孢子囊和排孢孔的大小ꎮ
1.5  病原菌 rDNA ̄ITS的序列分析和同源性比较
    采用 CTAB 法提取 DNAꎮ 采用通用引物
ITS1: 5′ ̄TCCGTAGGTGAACCTGCGC ̄3′ꎬ ITS4:
5′ ̄TCCTCCGCTTATTGATATGC ̄3′扩增菌株的
rDNA ̄ITS片段ꎬ并委托天根生化科技(广州)有限
公司进行序列测定ꎮ 对测得的供试菌株 rDNA ̄ITS
区段的序列ꎬ分别运用 GenBank 核酸数据库中的
BLAST工具软件ꎬ在 DNA序列数据库中搜索同源
DNA序列并进行比较分析ꎬ根据 BLAST搜索和比
较的结果ꎬ进行同源性分析ꎮ
2  结果与分析
2.1  田间症状描述
    兰屿肉桂黑茎病主要发生在每年 10月至次年
2月ꎬ在高湿度凉爽气候条件发生最为严重ꎮ 兰屿
肉桂播种时间在 4~6月份ꎬ待苗高为 30~50 cm即
开始发病ꎮ 发病初期在近地面的茎部产生棕色至
棕褐色的短条斑ꎬ逐渐向周围延伸ꎮ 纵向扩展的速
度很快ꎬ往往几天即可在茎部产生长条形的病斑ꎬ
长度可达 15 ~ 20 cm 以上ꎮ 横向扩展致使整个茎
部被病斑环绕一圈ꎬ造成病斑以上部位干枯ꎬ后期
整个茎部病斑呈黑色(图 1 ̄A1、A2、A3)ꎮ 引起植
株叶片变黄和萎垂ꎮ 为害种植多年的大树ꎬ茎部病
斑外表出现纵向开裂ꎬ剖开病斑开裂处ꎬ可见茎部
的皮层变褐色至黑色ꎮ 地上部位的叶片变黄ꎬ中午
温度高时植株呈现萎蔫症状ꎮ
2.2  菌株的致病性测定
    将分离菌株接种到苗高为 30 ~ 50 cm 健康活
体植株的茎部上ꎬ经过 4 ~ 7 d 的观察ꎬ无伤和有伤
接种的茎部可见明显的症状(图 1 ̄B、C)ꎬ发病率
均 100%ꎬ而对照全是健康的ꎮ 病斑的症状与田间
症状相一致ꎮ 从接种茎部的发病部位分离到与接
种菌株菌落生长性状和孢子囊形态相同的病原菌ꎬ
符合柯赫氏法则ꎮ
2.3  病原菌菌落的观察
    分离菌株在 8 种固体培养基上的菌落差异较
大ꎮ 其中在 PCA和 PDA上的菌落呈花瓣状ꎬ边缘
不整齐(图 2 ̄A、B)ꎬ在 TA、V8、CA、SA、CMA 和
OMA上菌落平展ꎬ不呈花瓣状ꎬ边缘较为整齐(图
2 ̄C~ H)ꎻ在 PCA、PDA、TA、V8、CA、SA 和 CMA
上气生菌丝很发达或较发达ꎬ而在 OMA 上气生菌
丝不发达ꎮ
Fig. 1  Symptoms of black ̄stem and artificial inoculation on Cinnamomum kotoense
A1ꎬA2 and A3:Symptoms of natural incidence in different stagesꎻB:No wound inoculationꎻC:Wound inoculation.
355
 
植物病理学报 45卷
2.4  病原菌形态的观察
    菌丝无隔膜ꎬ宽为 6.1~8.2(6.5)μm(图 3 ̄A)ꎻ
菌丝粗细均匀或产生特有的珊瑚状菌丝(图 3 ̄B)ꎻ
在 8种固体培养基上是否产生珊瑚状菌丝有较大
差异ꎬ其中 PDA、PCA、V8、TA、OMA、CA 和 CMA
可见珊瑚状菌丝ꎬ而 SA未见ꎻ同时ꎬ病原菌在 8 种
固体培养基产生球形的菌丝膨大体也有较大的差
异ꎬ其中在 PCA、V8、TA、OMA、CA、SA和 CMA可
见球形菌丝膨大体(图 3 ̄C、D)ꎬPDA 和 OGA 未
见ꎻ但将 8种固体培养基菌丝丛挑到水中培养 2~3
d后均可产生球形菌丝膨大体ꎬ直径为 31.5 ~ 60.2
(42.5)μmꎮ 在 8种培养基上均不能诱导孢子囊的
产生ꎬ但 V8和 CA 上培养的菌丝丛挑到自来水或
土壤浸出液中培养可产生孢子囊ꎬ其中在 V8上产
生的孢子囊数量较多ꎬ孢子囊长椭圆形或卵圆形ꎬ
无乳突ꎬ顶生ꎬ长为 34.3~62.2(46.2)μmꎬ宽为 23.0
Fig. 2  Colony morphology of pathogen causing black ̄stem on Cinnamomum kotoense
on different culture media
A:PCAꎻ B:PDAꎻ C:TAꎻ D:V8ꎻ E:CAꎻ F:SAꎻ G:OMAꎻ H:CMA.
Fig. 3  Morphology of pathogen causing black ̄stem on Cinnamomum kotoense
A:Non ̄septate myceliumꎻ B:Mycelium like coral ꎻ C:Spherical hyphal swellings ꎻ D:Amplification of the spherical
hyphal swellingsꎻ E:Long oval sporangiumꎻ F:Ovoid sporangium G:Sporangium release zoosporesꎻ H:Empty sporangium.
455
 
  5期 谢昌平ꎬ等:兰屿肉桂黑茎病病原菌的鉴定
~34.6(30.0)μmꎬ长宽比为 1.3 ~ 1.9(1.5)ꎬ孢子囊
不易脱落(图 3 ̄E、F)ꎻ游动孢子从孢子囊顶部释
放ꎬ排孢孔宽为 7.1 ~ 11.4(9.5) μm(图 3 ̄G、H)ꎮ
根据上述形态特征ꎬ参考相关文献[3、4]ꎬ可初步
判断引起兰屿肉桂黑茎病的病原菌为樟疫霉
(Phytophthora cinnamomi Rands)ꎮ
2.5  病原菌 rDNA ̄ITS测序分析与同源性比较结果
    以提取病原菌的基因组 DNA 为模板进行
PCR扩增ꎬ各样品均可扩增出一条大小与预计长
度符合约 900 bp的特异片段ꎮ 以转化后收集的菌
液进行 PCR扩增ꎬ克隆的结果与基因片段的 PCR
扩增结果一致ꎬ长度约为 900 bpꎮ 将分离菌株的
rDNA ̄ITS PCR扩增产物经测序ꎬ去除引物序列拼
接所得序列长度为 865 bpꎮ 将其提交至 GenBank
进行注册和 Blastn 分析ꎬ同源性比较结果表明ꎬ与
兰屿肉桂黑茎病病原物分离菌株同源性高的 100
个菌株均是樟疫霉菌株ꎬ其中同源性最高的前 32
个菌株的序列一致性达 100%ꎮ
3  结论与讨论
    樟疫霉的寄主范围和分布很广ꎬ可危害寄主多
达 900多种[5]ꎬ是一种重要的植物病原菌ꎮ 笔者对
采集到的兰屿肉桂黑茎病进行分离ꎬ通过对分离菌
株的形态特征如菌丝膨大体、珊瑚状菌丝、孢子囊
大小形状的观察ꎬ比较 8种培养基中病原菌菌落的
特征和 rDNA ̄ITS序列同源性的分析ꎬ将分离的菌
株鉴定为樟疫霉(P. cinnamomi Rands)ꎮ 樟疫霉
危害兰屿肉桂在国内属首次报道ꎮ
    樟疫霉不仅危害多种植物的根部ꎬ也可以危害
地上的叶片和茎部ꎮ 这类病害在低洼潮湿、通风不
良和种植过密等高湿的环境条件下易于发生和流
行ꎮ 由于兰屿肉桂苗期多在苗圃内种植ꎬ密度较
大ꎬ湿度高ꎬ所以在苗圃的小苗较田间植株的发病
严重ꎮ 苗圃内的小苗一旦发病ꎬ往往几天内整个茎
部变黑ꎬ难以防治ꎮ 因此ꎬ防治上首先应及时清除
病株ꎮ 同时ꎬ苗圃应做好田间的排水系统ꎬ采用高
畦开沟种植ꎬ并辅以化学防治才能有效的控制病害
的发生和流行ꎮ
参考文献
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( in Chinese)[ J] . China Flowers and Bonsai(中国花
卉盆景)ꎬ2002ꎬ(7): 8-9.
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technique of Cinnamomum kotoense( in Chinese) [ J] .
Tropical forestry(热带林业)ꎬ2011ꎬ39(4):29-31.
[3]   Zheng X B.Phytophthora and research technology( in
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京:中国农业出版社)ꎬ 1997ꎬ10-21.
[4]   Waterhouse G M. The fenus Phytophthora De Bary
(The Second Edition) [ J] . Mycological Paperꎬ1970ꎬ
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[5]   Zentmyer G. A. Phytopthora cinnamomi and the
disease it causes [ J ] . Monograph American Phyto ̄
pathol.ꎬ1980ꎬ10:3-12.
责任编辑:曾晓葳
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