全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４５(５): ５５２￣５５５(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０９￣１８ꎻ 修回日期: ２０１５￣０５￣２７
基金项目: 海南省科技基金项目资助(Ｒｎｄ０５２４)
通讯作者: 缪卫国ꎬ教授ꎬ博士生导师ꎬ主要从事分子植物病理学的研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｍｉａｏ＠ｈａｉｎｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０５.０１４
研究简报
兰屿肉桂黑茎病病原菌的鉴定
谢昌平１ꎬ 李宗来２ꎬ 陈 剑１ꎬ 郑妃庆１ꎬ 文衍堂１ꎬ 缪卫国１∗
( １海南大学环境与植物保护学院ꎬ海口 ５７０２２８ꎻ ２ 海南佳维园艺有限公司ꎬ海口 ５７０２０６)
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｃａｕｓｉｎｇ ｂｌａｃｋ￣ｓｔｅｍ ｏｎ Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｋｏｔｏｅｎｓｅ ＸＩＥ Ｃｈａｎｇ￣
ｐｉｎｇ１ꎬ ＬＩ Ｚｏｎｇ￣ｌａｉ２ꎬ ＣＨＥＮ Ｊｉａｎ１ꎬ ＺＨＥＮＧ Ｆｅｉ￣ｑｉｎｇ１ꎬ ＷＥＮ Ｙａｎ￣ｔａｎｇ１ꎬ ＭＩＡＯ Ｗｅｉ￣ｇｕｏ１∗ ( １ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ
Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ ＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬＨａｉｎａｎ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＨａｉｋｏｕ ５７０２２８ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｈａｉｎａｎ Ｊｉａｗｅｉ Ｇａｒｄｅｎｉｎｇ Ｃｏ.ꎬ Ｌｔｄ.ꎬＨａｉｋｏｕ
５７０２０６ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｋｏｔｏｅｎｓｅ ｂｌａｃｋ￣ｓｔｅｍ ｉｓ ａ ｎｅｗ ｄｉｓｅａｓｅ ｆｉｒｓｔ ｆｏｕｎｄ ｉｎ Ｈａｉｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｉｎ ｒｅｃｅｎｔ ｙｅａｒｓ.
Ｔｈｅ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌａｃｋ ｓｔｅｍ ｉｎｃｌｕｄｅ ｂｒｏｗｎｉｓｈ ｂｌａｃｋ ｓｔｒｅａｋｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅｓꎬｂｌａｃｋ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ａｎｄ
ｙｅｌｌｏｗｉｎｇ ｌｅａｖｅｓ ｉｎ ｌａｔｅｒ ｓｔａｇｅｓ.Ｔｈｅ ｗｉｌｔｉｎｇ ｐｌａｎｔ ｅｖｅｎｔｕａｌｌｙ ｌｅａｄ ｔｏ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｉｔｓ ｆｉｎａｌ ｓｔａｇｅ. Ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｃａｕｓｉｎｇ
ｂｌａｃｋ ｓｔｅｍ ｏｆ Ｃ. ｋｏｔｏｅｎｓｅ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃｉｎｎａｍｏｍｉ Ｒａｎｄｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓꎬ ｂａｓｅｄ ｏｎ
ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔꎬｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｌｏｎｙꎬ ｈｙｐｈａｌ ｓｗｅｌｌｉｎｇｓꎬ ｓｐｏｒａｎｇｉａ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｌｉｄ
ｍｅｄｉａ ａｎｄ ｒＤＮＡ￣ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｅｓ. Ｔｈｉｓ ｉｓ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ Ｐ. ｃｉｎｎａｍｏｍｉ ｃａｕｓｉｎｇ ｂｌａｃｋ￣ｓｔｅｍ ｏｎ
Ｃ. ｋｏｔｏｅｎｓｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｃ. ｋｏｔｏｅｎｓｅ ｂｌａｃｋ￣ｓｔｅｍ ｄｉｓｅａｓｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｋｏｔｏｅｎｓｅꎻ ｂｌａｃｋ￣ｓｔｅｍ ｄｉｓｅａｓｅꎻ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃｉｎｎａｍｏｍｉ
文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０５￣０５５２￣０４
兰屿肉桂又称平安树ꎬ为樟科、樟属的观叶常
绿小乔木ꎮ 原产台湾兰屿岛ꎬ是一种室内摆设的观
叶植物和园林景观树种之一ꎮ 具有驱逐室内污气、
净化空气和保护人体健康等作用ꎬ是理想的防污园
林绿化树种[１]ꎮ 目前国内关于兰屿肉桂的病害报
道很少ꎬ已经报道的病害有炭疽病、褐斑病和褐根
病[２]ꎬ但具体病原未见报道ꎮ
２００９年 １０月ꎬ作者在海南省海口市附近的苗
圃中发现一种为害兰屿肉桂茎部的病害ꎬ发病率在
３０％~ ４０％ꎬ严重影响植株的生长ꎬ造成大量植株
死亡ꎬ给生产造成极大影响ꎮ 目前该病害在国内尚
未有报道ꎬ本研究对该病的症状进行描述和病原鉴
定ꎬ以期为病害的防控提供依据ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 病株采集及症状观察
兰屿肉桂黑茎病病株采自海南省海口市桂林
洋附近的某花圃ꎬ按常规方法对病株的症状进行描
述和拍摄ꎮ
１.２ 菌株的分离
采用常规组织分离法分离ꎬ无菌操作接种到马
铃薯葡萄糖琼脂培养基(ＰＤＡ)上ꎬ待长出菌落后ꎬ
于 ４℃下保存备用ꎮ
１.３ 菌株的致病性测定
分别采用刺伤和无伤接种ꎬ将分离菌株的菌饼
５期 谢昌平ꎬ等:兰屿肉桂黑茎病病原菌的鉴定
贴在茎部上ꎬ每个处理 １０ 株ꎬ重复 ３ 次ꎮ 同时ꎬ以
１０株作为对照ꎬ用与菌饼同样大小的琼脂块贴于
伤口ꎬ表面覆盖已灭菌的吸水纸ꎬ保湿培养 ３~ ７ ｄꎬ
观察并记录发病情况ꎮ
１.４ 病原菌菌落和形态学观察
将病原菌分别接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养
基(ＰＤＡ)、马铃薯胡萝卜琼脂培养基(ＰＣＡ)、Ｖ８培
养基、大豆琼脂培养基 ( ＳＡ)、燕麦琼脂培养基
(ＯＭＡ)、番茄琼脂培养基(ＴＡ)、胡萝卜琼脂培养
基(ＣＡ)和玉米粉琼脂培养基(ＣＭＡ)上ꎬ２５℃培养
５ ｄ后ꎬ观察菌落的培养性状ꎬ包括菌落颜色、表面
形状、边缘形状、气生菌丝是否丰盛以及是否存在
菌丝膨大体等ꎻ采用菌丝丛水培法诱导孢子囊产
生ꎮ 观察孢子囊的形态和释放游动孢子情况及测
量孢子囊和排孢孔的大小ꎮ
１.５ 病原菌 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ的序列分析和同源性比较
采用 ＣＴＡＢ 法提取 ＤＮＡꎮ 采用通用引物
ＩＴＳ１: ５′￣ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣ￣３′ꎬ ＩＴＳ４:
５′￣ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ￣３′扩增菌株的
ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ片段ꎬ并委托天根生化科技(广州)有限
公司进行序列测定ꎮ 对测得的供试菌株 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ
区段的序列ꎬ分别运用 ＧｅｎＢａｎｋ 核酸数据库中的
ＢＬＡＳＴ工具软件ꎬ在 ＤＮＡ序列数据库中搜索同源
ＤＮＡ序列并进行比较分析ꎬ根据 ＢＬＡＳＴ搜索和比
较的结果ꎬ进行同源性分析ꎮ
２ 结果与分析
２.１ 田间症状描述
兰屿肉桂黑茎病主要发生在每年 １０月至次年
２月ꎬ在高湿度凉爽气候条件发生最为严重ꎮ 兰屿
肉桂播种时间在 ４~６月份ꎬ待苗高为 ３０~５０ ｃｍ即
开始发病ꎮ 发病初期在近地面的茎部产生棕色至
棕褐色的短条斑ꎬ逐渐向周围延伸ꎮ 纵向扩展的速
度很快ꎬ往往几天即可在茎部产生长条形的病斑ꎬ
长度可达 １５ ~ ２０ ｃｍ 以上ꎮ 横向扩展致使整个茎
部被病斑环绕一圈ꎬ造成病斑以上部位干枯ꎬ后期
整个茎部病斑呈黑色(图 １￣Ａ１、Ａ２、Ａ３)ꎮ 引起植
株叶片变黄和萎垂ꎮ 为害种植多年的大树ꎬ茎部病
斑外表出现纵向开裂ꎬ剖开病斑开裂处ꎬ可见茎部
的皮层变褐色至黑色ꎮ 地上部位的叶片变黄ꎬ中午
温度高时植株呈现萎蔫症状ꎮ
２.２ 菌株的致病性测定
将分离菌株接种到苗高为 ３０ ~ ５０ ｃｍ 健康活
体植株的茎部上ꎬ经过 ４ ~ ７ ｄ 的观察ꎬ无伤和有伤
接种的茎部可见明显的症状(图 １￣Ｂ、Ｃ)ꎬ发病率
均 １００％ꎬ而对照全是健康的ꎮ 病斑的症状与田间
症状相一致ꎮ 从接种茎部的发病部位分离到与接
种菌株菌落生长性状和孢子囊形态相同的病原菌ꎬ
符合柯赫氏法则ꎮ
２.３ 病原菌菌落的观察
分离菌株在 ８ 种固体培养基上的菌落差异较
大ꎮ 其中在 ＰＣＡ和 ＰＤＡ上的菌落呈花瓣状ꎬ边缘
不整齐(图 ２￣Ａ、Ｂ)ꎬ在 ＴＡ、Ｖ８、ＣＡ、ＳＡ、ＣＭＡ 和
ＯＭＡ上菌落平展ꎬ不呈花瓣状ꎬ边缘较为整齐(图
２￣Ｃ~ Ｈ)ꎻ在 ＰＣＡ、ＰＤＡ、ＴＡ、Ｖ８、ＣＡ、ＳＡ 和 ＣＭＡ
上气生菌丝很发达或较发达ꎬ而在 ＯＭＡ 上气生菌
丝不发达ꎮ
Ｆｉｇ. １ Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｂｌａｃｋ￣ｓｔｅｍ ａｎｄ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｋｏｔｏｅｎｓｅ
Ａ１ꎬＡ２ ａｎｄ Ａ３:Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔａｇｅｓꎻＢ:Ｎｏ ｗｏｕｎｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎꎻＣ:Ｗｏｕｎｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ.
３５５
植物病理学报 ４５卷
２.４ 病原菌形态的观察
菌丝无隔膜ꎬ宽为 ６.１~８.２(６.５)μｍ(图 ３￣Ａ)ꎻ
菌丝粗细均匀或产生特有的珊瑚状菌丝(图 ３￣Ｂ)ꎻ
在 ８种固体培养基上是否产生珊瑚状菌丝有较大
差异ꎬ其中 ＰＤＡ、ＰＣＡ、Ｖ８、ＴＡ、ＯＭＡ、ＣＡ 和 ＣＭＡ
可见珊瑚状菌丝ꎬ而 ＳＡ未见ꎻ同时ꎬ病原菌在 ８ 种
固体培养基产生球形的菌丝膨大体也有较大的差
异ꎬ其中在 ＰＣＡ、Ｖ８、ＴＡ、ＯＭＡ、ＣＡ、ＳＡ和 ＣＭＡ可
见球形菌丝膨大体(图 ３￣Ｃ、Ｄ)ꎬＰＤＡ 和 ＯＧＡ 未
见ꎻ但将 ８种固体培养基菌丝丛挑到水中培养 ２~３
ｄ后均可产生球形菌丝膨大体ꎬ直径为 ３１.５ ~ ６０.２
(４２.５)μｍꎮ 在 ８种培养基上均不能诱导孢子囊的
产生ꎬ但 Ｖ８和 ＣＡ 上培养的菌丝丛挑到自来水或
土壤浸出液中培养可产生孢子囊ꎬ其中在 Ｖ８上产
生的孢子囊数量较多ꎬ孢子囊长椭圆形或卵圆形ꎬ
无乳突ꎬ顶生ꎬ长为 ３４.３~６２.２(４６.２)μｍꎬ宽为 ２３.０
Ｆｉｇ. ２ Ｃｏｌｏｎｙ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｃａｕｓｉｎｇ ｂｌａｃｋ￣ｓｔｅｍ ｏｎ Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｋｏｔｏｅｎｓｅ
ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ
Ａ:ＰＣＡꎻ Ｂ:ＰＤＡꎻ Ｃ:ＴＡꎻ Ｄ:Ｖ８ꎻ Ｅ:ＣＡꎻ Ｆ:ＳＡꎻ Ｇ:ＯＭＡꎻ Ｈ:ＣＭＡ.
Ｆｉｇ. ３ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｃａｕｓｉｎｇ ｂｌａｃｋ￣ｓｔｅｍ ｏｎ Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｋｏｔｏｅｎｓｅ
Ａ:Ｎｏｎ￣ｓｅｐｔａｔｅ ｍｙｃｅｌｉｕｍꎻ Ｂ:Ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｌｉｋｅ ｃｏｒａｌ ꎻ Ｃ:Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ ｈｙｐｈａｌ ｓｗｅｌｌｉｎｇｓ ꎻ Ｄ:Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｈｅｒｉｃａｌ
ｈｙｐｈａｌ ｓｗｅｌｌｉｎｇｓꎻ Ｅ:Ｌｏｎｇ ｏｖａｌ ｓｐｏｒａｎｇｉｕｍꎻ Ｆ:Ｏｖｏｉｄ ｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ Ｇ:Ｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ ｚｏｏｓｐｏｒｅｓꎻ Ｈ:Ｅｍｐｔｙ ｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ.
４５５
５期 谢昌平ꎬ等:兰屿肉桂黑茎病病原菌的鉴定
~３４.６(３０.０)μｍꎬ长宽比为 １.３ ~ １.９(１.５)ꎬ孢子囊
不易脱落(图 ３￣Ｅ、Ｆ)ꎻ游动孢子从孢子囊顶部释
放ꎬ排孢孔宽为 ７.１ ~ １１.４(９.５) μｍ(图 ３￣Ｇ、Ｈ)ꎮ
根据上述形态特征ꎬ参考相关文献[３、４]ꎬ可初步
判断引起兰屿肉桂黑茎病的病原菌为樟疫霉
(Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃｉｎｎａｍｏｍｉ Ｒａｎｄｓ)ꎮ
２.５ 病原菌 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ测序分析与同源性比较结果
以提取病原菌的基因组 ＤＮＡ 为模板进行
ＰＣＲ扩增ꎬ各样品均可扩增出一条大小与预计长
度符合约 ９００ ｂｐ的特异片段ꎮ 以转化后收集的菌
液进行 ＰＣＲ扩增ꎬ克隆的结果与基因片段的 ＰＣＲ
扩增结果一致ꎬ长度约为 ９００ ｂｐꎮ 将分离菌株的
ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ ＰＣＲ扩增产物经测序ꎬ去除引物序列拼
接所得序列长度为 ８６５ ｂｐꎮ 将其提交至 ＧｅｎＢａｎｋ
进行注册和 Ｂｌａｓｔｎ 分析ꎬ同源性比较结果表明ꎬ与
兰屿肉桂黑茎病病原物分离菌株同源性高的 １００
个菌株均是樟疫霉菌株ꎬ其中同源性最高的前 ３２
个菌株的序列一致性达 １００％ꎮ
３ 结论与讨论
樟疫霉的寄主范围和分布很广ꎬ可危害寄主多
达 ９００多种[５]ꎬ是一种重要的植物病原菌ꎮ 笔者对
采集到的兰屿肉桂黑茎病进行分离ꎬ通过对分离菌
株的形态特征如菌丝膨大体、珊瑚状菌丝、孢子囊
大小形状的观察ꎬ比较 ８种培养基中病原菌菌落的
特征和 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ序列同源性的分析ꎬ将分离的菌
株鉴定为樟疫霉(Ｐ. ｃｉｎｎａｍｏｍｉ Ｒａｎｄｓ)ꎮ 樟疫霉
危害兰屿肉桂在国内属首次报道ꎮ
樟疫霉不仅危害多种植物的根部ꎬ也可以危害
地上的叶片和茎部ꎮ 这类病害在低洼潮湿、通风不
良和种植过密等高湿的环境条件下易于发生和流
行ꎮ 由于兰屿肉桂苗期多在苗圃内种植ꎬ密度较
大ꎬ湿度高ꎬ所以在苗圃的小苗较田间植株的发病
严重ꎮ 苗圃内的小苗一旦发病ꎬ往往几天内整个茎
部变黑ꎬ难以防治ꎮ 因此ꎬ防治上首先应及时清除
病株ꎮ 同时ꎬ苗圃应做好田间的排水系统ꎬ采用高
畦开沟种植ꎬ并辅以化学防治才能有效的控制病害
的发生和流行ꎮ
参考文献
[１] Ｈｕ Ｙ Ｍ. Ｆｏｌｉａｇｅ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｃｉｎｎａｍｏｎ￣“Ｃｈｒｉｓｔｍａｓ ｔｒｅｅ”
( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)[ Ｊ] . Ｃｈｉｎａ Ｆｌｏｗｅｒｓ ａｎｄ Ｂｏｎｓａｉ(中国花
卉盆景)ꎬ２００２ꎬ(７): ８－９.
[２] Ｓｕｎ Ｄ Ｓꎬ Ｆｅｎｇ Ｊ Ｐ. Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ ｋｏｔｏｅｎｓｅ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] .
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Ｃｈｉｎｅｓｅ)[Ｍ] . Ｂｅｉｊｉｎｇ: Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｅｓｓ(北
京:中国农业出版社)ꎬ １９９７ꎬ１０－２１.
[４] Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ Ｇ Ｍ. Ｔｈｅ ｆｅｎｕｓ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ Ｄｅ Ｂａｒｙ
(Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ) [ Ｊ] . Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐａｐｅｒꎬ１９７０ꎬ
１２２:１－５９.
[５] Ｚｅｎｔｍｙｅｒ Ｇ. Ａ. Ｐｈｙｔｏｐｔｈｏｒａ ｃｉｎｎａｍｏｍｉ ａｎｄ ｔｈｅ
ｄｉｓｅａｓｅ ｉｔ ｃａｕｓｅｓ [ Ｊ ] . Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈｙｔｏ￣
ｐａｔｈｏｌ.ꎬ１９８０ꎬ１０:３－１２.
责任编辑:曾晓葳
５５５