全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
!"#$*"$*!)
基金项目$国家自然科学基金"
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#
作者简介$张亚萍"
#1)&(
#!女!在读硕士研究生!主要从事资源植物学方面的研究
2*34.5
$
64
7
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!
#&%,9:3
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通信作者$梁文裕!博士!教授!主要从事植物资源及植物分子生物学的研究
2*34.5
$
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7
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!
#&%,9:3
不同失水状态发菜类囊体膜蛋白的分离及鉴定
张亚萍!杨
!
佳!石
!
晶!毛桂莲!吴诗杰!雷晓婷!梁文裕"
"宁夏大学 生命科学学院!银川
+""!#
#
摘
!
要$采用液氮研磨与超声波破碎相结合的方法!破碎不同失水状态的发菜藻体和细胞!用差速离心法制备发菜
类囊体膜粗制品!蔗糖密度梯度高速离心纯化类囊体膜!
<=<*>?@2
电泳分离类囊体膜蛋白!并对膜蛋白进行了
A?B=C*DEF*DEF
%
A<
质谱分析和鉴定结果表明$"
#
#充分吸胀
$G
后失水
&G
的发菜"含水量
+#,!H
#和失水
!$G
的发菜"含水量
#$,1H
#!经过多步差速离心后再进行蔗糖密度梯度高速离心!可得到纯化的类囊体膜"
!
#发
菜类囊体膜蛋白
<=<*>?@2
电泳分离到
#$
个条带!共鉴定出
)
种蛋白!根据其功能可分为
$
类(((光合作用相关
蛋白"光系统
"
锰稳定蛋白
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合成酶
#
亚基和
$
亚基#)结构域蛋白)选择性通道蛋白
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#!它们在发菜的光合作用中具有重要作用
关键词$发菜&类囊体膜&膜蛋白&分离
中图分类号$
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文献标志码$
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高等植物类囊体膜主要存在于叶绿体中的类囊
体上!蓝藻等原核生物虽然没有叶绿体等细胞器!但
类囊体膜主要分布在细胞周质中!而且类囊体膜上
有完整的蛋白色素复合体!并具有
><
%
和
><
"
+
#*$
,
和光捕获复合体"
BT]
#
+,
蓝藻类囊体蛋白复合
物的种类及其色素)蛋白组成要比高等植物变化多
样!代表着不同的进化层次!因而对这一类群进行深
入的比较研究!将揭示出更多有关光系统结构进化
以蓝藻类囊体膜的重要生物学功能此外!蓝藻类
囊体膜由于直接分布于细胞质中!而且与光合放氧
密切相关!因而成为研究蓝藻光合作用的重要领域
发菜"
!"#$"%
&
(
)
*+
&
",-*L:K0,NMF54G,
#属
于蓝藻门念珠藻科念珠藻属!又称发状念珠藻!是一
种世界性分布的陆生固氮蓝藻在长期的进化过程
中!发菜进化出一套有别于陆生植物的耐旱)耐高光
强能力!其中光合作用的适应与调节是重要特性之
一+&,类囊体是发菜进行光合作用的主要亚细胞结
构!虽然王梅等+,对发菜类囊体膜色素蛋白复合物
进行了初步分离!但重要膜蛋白的分子信息及不同
失水状态发菜类囊体膜和类囊体膜蛋白的分离)鉴
定及其生物学功能并未明确此外!对发菜在干旱)
高光强等逆境中的适应和保护机制的认识尚缺乏光
合膜和膜蛋白的基础性研究因此!探索发菜类囊
体膜的分离纯化!对类囊体膜蛋白进行鉴定并分析
其生物学功能!不仅对认识发菜适应干旱等逆境及
由水生到陆生的进化机理有重要意义!而且为深入
研究发菜光合机制奠定基础
#
!
材料和方法
<,<
!
材
!
料
野生新鲜发菜采自宁夏香山发菜自然生长地
在温度
!+a
)持续光照)光照强度
!""
&
3:5
-
3
(!
-
/
(#
)无持续风速)相对空气湿度
%"H
条件下!对
发菜藻体进行处理$充分吸胀
$G
的发菜"含水量
##1$,1H
#&充分吸胀
$G
后再失水
&G
的发菜"含
水量
+#,!H
#&充分吸胀
$G
后再失水
!$G
的发菜
"含水量
#$,1H
#
<,=
!
发菜类囊体膜的分离
<,=,<
!
类囊体膜粗提
!
称取处理好的发菜样品
+
;
!避光条件下放置研钵中液氮反复研磨!随后加入
预冷的类囊体膜提取液
#+"3B
"
+"33:5
-
B
(#
DK./
!
+33:5
-
B
(#
2=D?
!
#33:5
-
B
(#氯化锰!
#
33:5
-
B
(#氯化镁!
33:5
-
B
(#硝酸钠!
#""33:5
-
B
(#蔗糖!
",+33:5
-
B
(#磷酸氢二钾!
J
T,)
#!
用预冷的
)
层纱布低温避光过滤!滤液冷藏!残渣置
研钵中!避光条件冰浴研磨约
#G
!然后将冷藏滤液
加入研钵中!匀浆后再加入
!+"3B
类囊体膜提取
液!低温避光超声波破碎
&"3.0
"
&"W
!间隔
)/
#
匀浆
$a
)
#"""K
-
3.0
(#离心
#"3.0
!收集上清
液上清液在
$a
!
+"""K
-
3.0
(#下离心
#3.0
!
收集上清液!在
$a
)
#""""K
-
3.0
(#下再离心
%"
3.0
!沉淀即为类囊体膜粗提物
<,=,=
!
类囊体膜粗提物的纯化
!
在发菜类囊体膜
的粗提物中加入不含蔗糖的类囊体膜提取液!低温
避光冰浴条件下!充分研磨!将发菜类囊体膜粗提物
轻置于不同密度梯度的蔗糖溶液上"
&"Hb+"Hb
$"Hb%"Hb!"Hc#b#b#b#b#
#!
$a
!
"""
K
-
3.0
(#离心
$G
用吸管在低温条件下快速收集
离心管中不同颜色的条带!并将收集的样品用不含
蔗糖的提取缓冲液低温避光条件下透析
!$G
以除
去样品中的蔗糖
<,>
!
吸收光谱测定
用紫外分光光度计测定分离出的各条色素带的
$""

""03
吸收光谱
!
$8$A69BC
电泳
<=<*>?@2
电泳在高政权等+),的基础上做了
进一步的修改先用
$H
的
<=<
对经不同密度梯度
蔗糖溶液离心后得到的色素带低温避光条件下进行
二次增溶
%"3.0
!再用
1
倍体积的冷丙酮在
(!"a
条件下抽提样品
!
次
$a
)
#!"""K
-
3.0
(#离心
#"3.0
!取沉淀溶解于上样缓冲液"
,!+3:5
-
B
(#
DK./
!
+H
甘油!
#H <=<
!
","!+H
$
*
巯基乙醇!
J
T
&,)
#中分离胶浓度为
#!H
!浓缩胶浓度为
+H

考马斯亮蓝
@
!+"
染色
!G
!脱色液脱色
!G

<,D
!
蛋白质胶内酶切)质谱分析)数据库查询及蛋
白质鉴定
从
<=<*>?@2
凝胶上切取蛋白条带!置于
#,+
3B
的离心管中!加入
+"H
胰蛋白酶溶液"
#""
33:5
-
B
(#碳酸氢铵溶液配制#振荡脱色!重复数次
直至条带无色加入适量
#""H
胰蛋白酶溶液振
荡!脱水!弃上清!重复
!
次
%a
烘箱中胶条完全
干燥!加入
#"
&
B
浓度为
#!,+0
;
-
&
B
(#胰蛋白酶
溶液!
$a
静置
$+3.0
!后转移至
%a
烘箱中孵育
#!G
冷却至室温后!
&"""K
-
3.0
(#离心!弃上清!
置于
!""
&
B>]Q
管中保存加入
",#H DF?
"三
氟乙酸!
+"H
胰蛋白酶水溶液配制#!充分振荡!室温
静置
+3.0
!
&"""K
-
3.0
(#离心!弃上清!重复
!

%
次!沉淀在
O
!
流下吹干浓缩
!#
&
期
!!!!!!!!!!!!
张亚萍!等$不同失水状态发菜类囊体膜蛋白的分离及鉴定
将完全干燥的沉淀重新溶解于
",
&
B",+
;
-
B
(#
]T]?
溶液"
#
*
氰基
*$*
羟基肉桂酸#中!并将其
全部点到
A?B=C
靶板上!在室温下自然干燥!采用
$""
串联飞行时间质谱仪+
$"">K:MN:3.9/?045
7
*
N`K
"
DEF
%
DEF
DA
#"
?
JJ
5.N^ L.:/
7
/MN3/
!
X#,进
行质谱分析激光源为
O^
$
U?@54/NK
!波长
%++
03
!加速电压
!"8d
!采用正离子模式和自动获取
数据的模式采集数据
A?B=C*DEF
数据去除杂
峰 后!所 得 结 果 用
@><
"
?
JJ
5.N^ L.:/
7
/MN3/
!
X#)
A?<]ED\,#,1
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A4MK.[<9.N09N
!
B:0^:0
!
Xe
#数据库检索在
A4MK.[/9.N09N
网站上
A?<*
]EDA<
%
A<.:0/7
页面下进行检索数据
库为
O]LC0K
!种属为
45
!数据检索的方式为
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I.0N^
!最大允许漏切位点为
#
!酶为胰蛋白酶质
量误差范围设置$
>AF","#H
!
A<
%
A<",&=4

在数据库检索时胰蛋白酶自降解峰和污染物质的峰
手工剔除
!
!
结果与分析
=,<
!
不同失水发菜类囊体膜的收集和纯化
采用一次差速离心制备发菜类囊体膜粗提物!
然后经蔗糖密度梯度超高速离心结果表明!吸水
$G
发菜"含水量
##1$,1H
#样品出现
%
条条带!分
别为
?
#
)
?
!
)
?
%
"图
#
!
?
#&吸水
$G
后再失水
&G
的
发菜"含水量
+#,!H
#样品和吸水
$G
后再失水
!$G
的发菜"含水量
#$,1H
#样品各出现
+
条不同颜色
条带!分别为
L
#
)
L
!
)
L
%
)
L
$
)
L
+
"图
#
!
L
#和
]
#
)
]
!
)
]
%
)
]
$
)
]
+
"图
#
!
]
#
?
#
)
L
#
)
]
#
条带颜色呈蓝色!而
且
]
#
条带的颜色最深&
?
!
颜色呈灰绿色!
L
!
)
]
!
颜
色呈橘黄色&
?
%
颜色呈深绿色!
L
%
)
]
%
颜色呈黄绿
色!颜色最深的为
]
%
&
L
$
)
]
$
颜色呈棕绿色!颜色最
深的为
]
$
&
L
+
)
]
+
颜色呈淡棕绿色!
]
+
颜色最深
采用分步差速离心法制备发菜类囊体膜粗提
物!然后经蔗糖密度梯度超高速离心结果表明!吸
水
$G
发菜"含水量
##1$,1H
#样品出现
%
条条带!
分别为
4
#
)
4
!
)
4
%
"图
#
!
4
#&吸水
$G
后再失水
&G
的
发菜"含水量
+#,!H
#和吸水
$G
后再失水
!$G
的
发菜"含水量
#$,1H
#各出现
+
条不同颜色条带!分
别为
I
#
)
I
!
)
I
%
)
I
$
)
I
+
"图
#
!
I
#和
9
#
)
9
!
)
9
%
)
9
$
)
9
+
"图
#
!
9
#
4
#
)
I
#
)
9
#
颜色呈蓝色!
9
#
的颜色最深&
4
!
颜色
呈灰绿色!
I
!
)
9
!
颜色呈橘黄色&
4
%
)
I
%
)
9
%
颜色呈黄
绿色!颜色最深的为
9
%
&
I
$
)
9
$
颜色呈棕绿色!颜色
最深的为
9
$
&
I
+
)
9
+
颜色呈淡棕绿色!
9
+
颜色最深
上述结果表明!分步差速离心法比一次差速离
心法制备的类囊体膜粗制品经蔗糖密度梯度离心后
沉淀和杂质较少!各条带颜色较深!层次分明因
此!用分步差速离心法制备发菜类囊体粗提物优于
一次差速离心法
=,=
!
不同失水发菜类囊体膜提取液的吸收峰
各样品经密度梯度离心后收集的色素层进行
$""

""03
光谱扫描结果"图
#
#表明!
%
样品
的
?
#
和
4
#
层在
&&03
有吸收峰&
?
!
和
4
!
层在
$#
)
$$"
和
&)"03
有
%
个主峰!在
$#!03
有吸收
肩峰&
?
%
和
4
%
层在
&03
有主峰
"
样品的
L
#
和
I
#
层无明显吸收峰&
L
!
和
I
!
层在
$!#03
和
&)"
03
有
!
个吸收峰&
L
%
和
I
%
层在
$$"03
和
&03
有
!
个主峰!在
$!"03
有吸收肩峰&
L
$
和
I
$
层在
$$"03
和
&103
有
!
个主峰!在
$#103
有个吸收
肩峰&
L
+
和
I
+
层在
$%03
和
&03
有
!
个主峰!
在
$#+03
和
$)&03
有
!
个吸收肩峰
(
样品的
]
#
和
9
#
)
]
!
和
9
!
层无明显吸收峰&
]
%
和
9
%
层在
$!"03
和
&+03
有
!
个主峰!在
$$"03
和
$)"
03
有吸收肩峰&
]
$
和
9
$
层在
$!+03
和
&+03
有
!
个主峰!在
$"+03
有吸收肩峰&
]
+
和
9
+
层在
&+
03
有主峰"图
!

$
#
由特征吸收峰可知!
?
%
)
L
$
)
]
$
)
L
+
)
]
+
和
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%
)
I
$
)
9
$
)
I
+
)
9
+
为类囊体膜分布层从密度梯度离心
后各层颜色判断!
?
#
)
L
#
)
]
#
和
4
#
)
I
#
)
9
#
可能为藻
蓝素!
L
!
)
]
!
和
I
!
)
9
!
为藻红素此外!
$%"

$%)
03
和
&+03
左右为叶绿素
4
的特征吸收峰!
$#+
03
和
$!"03
处为脱镁叶绿素的特征吸收峰!且大
部分样品中脱镁叶绿素的吸收峰明显高于叶绿素
4
的吸收峰值!说明样品中的脱镁叶绿素浓度高于叶
绿素
4
的浓度
$+03
左右处为辅助色素的吸收
峰!可能为类胡萝卜素
=?>
!
发菜类囊体膜蛋白的
$8$A69BC
电泳及
39E8+A.FGA.FG
!
3$
质谱分析
取吸水
$G
后再失水
&G
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含水量为
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类囊体膜的分离纯化是探知类囊体膜蛋白的关
键目前对于类囊体膜的分离主要集中在电泳条件
的改进和增溶剂优化上!最根本的目的是为了获得
高纯度)无干扰杂质的类囊体膜色素蛋白由于发
菜富含多糖)色素)胶质等物质+1,!发菜类囊体膜的
分离和纯化受到严重干扰本研究采用研磨和超声
波破碎两种方式相结合充分破碎发菜细胞!经过多
次差速离心制备类囊体膜粗制品!再进行不同密度
梯度蔗糖溶液高速离心!得到纯化后的类囊体膜
这样不仅去除了多糖)色素)胶质和核酸等物质的干
扰!而且因全过程都处于低温避光条件下!减少了部
分色素蛋白复合物的裂解此外!差速离心得到的
类囊体粗制品杂质较少!经不同蔗糖密度梯度离心
后各条带层分层清晰因此利用密度梯度离心方法
制备发菜类囊体膜是理想的选择此外!不同含水
量的发菜藻体!经过同样程序的处理后!其色素条带
差异明显!且其
<=<*>?@2
条带呈现出明显的差异
性!分析认为由于发菜藻体含水量的不同!尤其是含
水量达
##1$,1+H
时!样品的结构和所含水分对缓
冲液造成了极大的影响!干扰了类囊体膜的分离和
膜蛋白的纯化因此!在发菜类囊体膜蛋白的分离
及研究过程中!应充分考虑藻体含水量对分离效果
的影响
>,=
!
发菜类囊体膜蛋白功能探讨
发菜是一种生长在干旱
*
半干旱荒漠草原地区
的陆生固氮蓝藻为了揭示发菜类囊体膜的光合作
用特性及膜蛋白在逆境条件下的差异性表达规律!
本研究制备了发菜较完整的类囊体膜!进行了膜蛋
白的质谱鉴定!获得了
)
种发菜类囊体膜蛋白的生
物学信息!它们在发菜的光合作用及在极端环境中
的光适应性中可能具有重要作用
"
#
#碳水化合物选择性孔蛋白
E
J
KL
碳水化合
物选择性孔蛋白是一种基于选择性信号通道的糖蛋
白家族!可促进葡萄糖转运并横跨于细胞膜中!并有
助于促进各种不同化合物的扩散
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N
等+#",
研究绿脓杆菌的碳水化合物的选择性
E
J
KL
孔蛋白
的表达时!发现当细胞外葡萄糖浓度降低!会引起铜
绿假单胞菌外膜碳水化合物的选择性
E
J
KL
的孔蛋
白的表达!并推测温度)培养基中水杨酸盐的浓度和
碳水化合物源的
J
T
等因素会影响
E
J
KL
孔蛋白基
因表达
W
7
5.N
等+##,发现碳水化合物的选择性
E
J
KL
孔蛋白表达量的增加或减少可以明显影响菌
株对葡萄糖摄取!但过度的
E
J
KL
表达会影响菌株
对糖类的摄取!并抑制碳水化合物运输因此!
E
J
KL
不能被确定为严格意义上的葡萄糖选择性的
外膜蛋白!而是作为碳水化合物运输的一个重要组
成部分但目前还没有对蓝藻碳水化合物的选择性
孔蛋白功能的报道本研究分离到的碳水化合物的
选择性孔蛋白
E
J
KL
!推测其作为发菜类囊体膜上的
通道蛋白!可能帮助葡萄糖等碳水化合物的摄取和
转运!对于光合作用的正常进行具有重要作用
"
!
#
F
#
F
"
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合成酶
F
#
F
"
?D>
合成酶广泛
存在于细菌的质膜)叶绿体的类囊体膜和线粒体的
内膜上+#!*#%,!主要参与氧化磷酸化与光合磷酸化的
反应!是能量代谢的关键酶之一到目前为止!已经
知道在细菌和叶绿体中的
?D>
合成酶分别由
)
和
1
种亚基组成!其主要区别是亚基的数量和在
?D>
合成酶结构中的位置+#$,本研究鉴定的
F
#
F
"
*?D>
合成酶
#
和
$
亚基!是发菜类囊体膜上重要的参与
光合磷酸化反应的结构蛋白!对发菜生长发育和抗
逆反应具有重要的作用!但其结构还需进一步研究
"
%
#光系统
"
锰稳定蛋白光合放氧是植物
><
"
的重要功能之一!而
><
"
的放氧反应主要是由
><
"
中的
$
个锰原子依次连接与
><
"
的
=#
蛋白
的氨基酸残基上进行催化的锰簇在类囊体膜的囊
腔侧结合若干个外周蛋白!从而对放氧反应起作用
一般
><
"
具有
%
个外周蛋白
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)
>/I>
)
>/IR
分
别与锰簇结合!位于
><
"
囊腔侧!维持
><
"
的放氧
活性!其中
>/IE
起到稳定和保护锰族的作用!因而
被称为锰稳定蛋白"
A<>
#!受到胁迫时
>/IE
首先
释放!然后锰原子释放!放氧活性随之丧失在嗜热
蓝藻中发现只存在
>/IE
蛋白而没有
>/I>
和
>/IR
蛋白!取而代之的是细胞色素
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和一种分子量
为
1

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的蛋白+#+,
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)
>/IR
外周蛋白洗脱后会引起
><
"
放氧功能
的部分丢失而将
>/IE
洗脱而不洗脱锰簇!在有
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f和
]5
(存在时!
><
"
仍可保持一定的放氧活力!
证明放氧活性与锰族的存在及
]4
f和
]5
(离子存在
有关本研究鉴定的
><
"
锰稳定蛋白!可能与
><
"
颗粒的组合有关!参与发菜光合放氧过程!而且推
测发菜的
><
"
锰稳定蛋白不仅与
><
"
颗粒中锰簇
的稳定有关!还可辅助另外
!
个外周蛋白与
><
"
颗
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&
期
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张亚萍!等$不同失水状态发菜类囊体膜蛋白的分离及鉴定
粒的结合虽然目前对于发菜外周蛋白在放氧功能
中的作用不明!但作为
><
"
完成放氧功能的必要成
分!需进一步进行探讨
"
$
#未知功能蛋白本研究获得了
#$
条发菜类
囊体膜蛋白条带!
%+,#H
的蛋白条带确定了其蛋白
名称和功能!另有
!#,$%H
的蛋白!虽然质谱鉴定成
功!并且获得了部分匹配的氨基酸序列!明确了蛋白
名称!数据库中也有其
C=
及特性描述!但由于目前
尚缺乏足够的生物学信息!因此无法判断其生物学
功能还有
$!,)+H
的蛋白点没有鉴定成功!尚不
了解其生物学信息!而这些蛋白可能在发菜光合作
用或碳同化过程中具有重要的生物学功能此外!
部分低丰度蛋白往往是一些关键性的调节蛋白或结
构蛋白!但由于没有分离到或表达量很低而无法对
其进行鉴定和分析因此!还需要进一步利用其他
相关技术分离鉴定发菜类囊体膜蛋白!从而获得对
内囊体膜及其膜蛋白在光合作用中的生物学功能的
全面认识
参考文献"
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