全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(4): 418-424(2012)
收稿日期: 2011-07-14 修回日期: 2012-02-21
基金项目: 国家自然科学基金(30900960);湖南省烟草公司项目(10-12Aa04); 湖南省高校科技创新平台建设经费(09K048)
通讯作者: 高必达,男,教授,主要从事分子植物病理学研究; E-mail:bdgao@yahoo. com. cn
第一作者: 朱宏建(1979 - ),男,湖南石门人,博士,主要从事植物病理学研究; E-mail: hongjian62@163. com。
一株辣椒尖孢炭疽病菌拮抗菌株的分离鉴定
与发酵条件优化
朱宏建1,2, 欧阳小燕1,2, 周 倩1,2, 高必达1,2*
( 1湖南农业大学生物安全科学技术学院, 长沙 410128; 2植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室, 长沙 410128)
摘要:为了探寻辣椒尖孢炭疽病的生防药剂,从而控制该病在辣椒生产上的扩散。 以辣椒尖孢炭疽病菌(Colletotrichum
acutata)为指示菌,从浏阳河风光带土样中分离筛选出 6 株拮抗放线菌株,其中菌株 ND045 对指示菌的拮抗效果最好,菌丝
生长抑制率高达 71. 6% 。 经形态观察、培养性状、生理生化鉴定,并结合 16S rDNA序列分析,将 ND045 菌株鉴定为吸水链
霉菌(Streptomyces hygroscopicus)。 抗菌谱研究表明,该菌株对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、辣椒疫霉病菌(Phytophtho-
ra capsici)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium omysporum)和辣椒白绢病菌(Sclerotium rolfsii)都具有较强的拮抗作用,抑菌率达
40． 58% ~ 72. 00% 。 通过单因子变量法和均匀设计法对菌株 ND045 进行发酵条件研究,结果表明,其最佳的发酵条件为:
15 g大米粉、5 g大豆粉、0. 5 g MgSO4、0. 01 g FeSO4·7H2O、1. 5 g NaCl、水 1 000 mL、30℃、pH 8。 经优化后,菌丝生长抑
制率最高达到 82. 61% ,比优化前提高了 11. 01% 。 该研究结果为辣椒尖孢炭疽病的生物防治提供科学依据。
关键词:放线菌; 辣椒尖孢炭疽病菌; 吸水链霉菌; 发酵条件
Isolation, identification and optimizing fermentation conditions of an antagonistic
strain against Colletotrichum acutata　 ZHU Hong-jian1,2, OUYANG Xiao-yan1,2, ZHOU qian1,2,
GAO Bi-da1,2 　 ( 1College of Bio-Safety Science and Technology, Changsha 410128,China; 2Hunan Provincial Key Laborato-
ry for Biology and Control of Plant Diseases and Insect Pests, Changsha 410128, China)
Abstract: In order to explore biocontrol agents to control pepper anthracnose disease spread in pepper produc-
tion. Six antagonistic actinomycetes strains were isolated from the cultivated soil samples of Liuyang River Sce-
nic Belt,among which ND045 strain was exhibited the highest antagonistic activity against Collectotrichum
acutata and showed the inhibition rate of 71. 6% . The ND045 was identified as Streptomyces hygroscopicus
according to the morphology,culture characteristics,physiological and biochemical tests and 16S rDNA analy-
sis. Further antimicrobial spectrum of ND045 was tested against Magnaporthe grisea, Phytophthora capsici,
Fusarium omysporum and Sclerotium rolfsii and showed the inhibition rate between 40. 58% and 72. 00% . The
optional fermentation conditions for antibacterial substance production of ND045 were rice flour 15. 0 g,soy-
bean flour 10 g,MgSO4 0. 5 g,FeSO4·7H2O 0. 01 g,NaCl 1. 5 g, water 1 000 mL,fermentation temperature
30℃ and pH at 8 through one-variable method and uniform design. After optimization,the inhibition rate of
mycelial growth was up to 82. 61% , increased for 11. 01% more than before. The results provide scientific
evidence to pepper anthracnose biocontrol.
Key words: actinomycetes; Collectotrichum acutata;Streptomyces hygroscopicus;fermentation conditions
中图分类号: S432　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)04-0418-07
　
　 4 期 　 　 朱宏建,等:一株辣椒尖孢炭疽病菌拮抗菌株的分离鉴定与发酵条件优化
　 　 辣椒炭疽病(pepper anthracnose)是为害辣椒生
产的主要病害之一,分布广且危害严重,通常减产
20% ~50% [1]。 2009年 8 月,本课题组从湖南芷江
线果型辣椒红秀 2003 染病果实中分离出一种新的
辣椒炭疽病菌,经鉴定为尖孢丛壳菌 Glomerella
acutata Guerber & J. C. Correll (无性阶段为 Collec-
totrichum acutata),即辣椒尖孢炭疽病菌,为国内首
次报道[2]。 该病菌可危害未成熟果实,并且抗药性
极强,现有用于防治辣椒炭疽病的化学杀菌剂均不
能控制此病。 因此,迫切需要寻求更高效安全的防
病新技术,以控制该病在辣椒生产上的扩散[3]。 利
用环境友好的生防菌株进行植物病害的生物防治是
近年国内外的研究热点。 其中,由于利用放线菌产
生的抗菌活性物质进行生物防治,具有周期短、易于
研究、便于生产、无毒无害等优点[4],已被国内外研
究者广泛应用。 本课题组从浏阳河风光带收集土
样, 分离、筛选出一株对辣椒尖孢炭疽病菌有拮抗
活性的放线菌 ND045, 本文采用传统分类鉴定与分
子生物学相结合的方法对该菌株进行了鉴定,并采
用均匀设计法对其发酵条件进行研究,旨在为辣椒
尖孢炭疽病的防治提供菌种资源。
1　 材料与方法
1. 1　 材料
1. 1. 1　 供试菌株 　 拮抗菌株 ND045 和辣椒尖孢
炭疽病菌(C. acutata)由本课题组分离,保存;供
试的 8 种植物病原真菌,即辣椒疫霉病菌(Phyto-
phthora capsici)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia sola-
ni) 、小麦赤霉病菌(Gibberella zeae)、稻瘟病菌
(Magnaporthe oryzae)、水稻恶苗病菌 (Fusarium
moniliforme)、草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea)、辣
椒白绢病菌(Sclerotium rolfsii)、黄瓜枯萎病菌(F.
omysporum)均由湖南农业大学植物疾病控制研究
所提供。
1. 1. 2　 供试培养基及试剂　 供试真菌的培养与拮
抗活性测定均使用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养
基。 拮抗放线菌的培养性状观察使用 PDA、高氏 1
号、燕麦片琼脂、察氏琼脂、营养琼脂培养基。 种子
及发酵初始培养基配方为:可溶性淀粉 20 g,KNO3
1 g,K2HPO4 1g,NaCl 1 g,CaCO34 g,蒸馏水 1 000
mL,pH 7. 2。 所用试剂均为市售生化试剂(分析
纯),由上海虹宇生物公司提供。
1. 2　 放线菌株的分离
先在 300 mL 高氏一号培养基中加入 3%的
K2Cr2O7 溶液 1 mL,混合均匀后倒入平板,制成含
有抑制剂的选择培养基平板[5]。 将从浏阳河风光
带采集的土样(地表以下 15 cm),采用稀释分离
法[6]进行土样中放线菌的分离。 将纯化后的菌种
转入斜面,4℃条件下保存备用。
1. 3　 放线菌株拮抗辣椒尖孢炭疽病菌的测定
采用平板对峙法[6,7]对分离的放线菌株进行
初步拮抗测定,先将加热的 PDA 培养基倒入无菌
培养皿中,待冷却后每皿中央接种辣椒尖孢炭疽病
菌菌饼(直径 5 mm),于每皿四周接种 4 种待测放
线菌,平均分布于菌饼的 4 个方向,置 28 ~ 30℃恒
温箱中培养 96 h,观察放线菌株周围有无抑菌带,
并测量抑菌带的宽度。
初步筛选出的拮抗菌株选取直径 5 mm 的菌
丝块接种于 100 mL 种子液体培养基中,28℃下摇
瓶发酵 72 h 后,用细菌过滤器过滤发酵液[8]。 采
用含毒介质法进行拮抗测定,在每皿中加入菌株过
滤液原液 3 mL,倒入 12 mL PDA培养基(55 ℃左
右)混匀,制成平板,待冷却后,每皿中央接种辣椒
尖孢炭疽病菌菌饼(直径 5 mm),设清水对照,每
个处理重复 3 次。 静置 1 h后放入 28 ℃恒温箱中
培养,待对照菌落长满整个平板,用十字交叉法测
量菌落直径,记录结果并按下式计算抑制率:
菌落直径 =相垂直的两直径的平均值 -菌饼
直径
抑制率(% ) = (对照菌落直径 -处理菌落直
径) / (对照菌落直径 -菌饼直径) ×100
1. 4　 拮抗菌株分类鉴定
1. 4. 1　 菌株形态观察和生理生化特征　 形态观察
及生理生化测定方法均按照参照文献[9,10]方法
进行。
1. 4. 2　 菌株的分子生物学鉴定
(1) 菌株基因组 DNA的提取　 参照 Kauffmann
等[11]及 Nikodinovic等[12]的方法提取基因组 DNA。
(2)16S rDNA的 PCR 扩增、回收和序列测定
根据放线菌 16S rDNA 的结构特点及其保守区设
计特异引物,正向引物 16sF:5′-AGAGTTTGATC-
CTGGCTCAG-3′;反向引物 16sR:5′-AAGGAGGT-
914
　
植物病理学报 42 卷
GATCCAGCCGCA-3′。 由上海生工生物工程技术
有限公司合成。 以基因组 DNA 为模板,进行 50
μL 反应体系 PCR扩增,扩增条件为 94℃预变性 5
min,94℃变性 1 min,56℃复性 1 min,72℃延伸 2
min,25 个循环,72℃延伸 8 min.采用 1. 0%的琼脂
糖对 PCR扩增产物电泳检测,采用北京赛百盛基
因技术有限公司硅胶模型 TMPCR 产物纯化试剂
盒进行 PCR扩增产物的回收,采用北京天根生化
科技有限公司 pGM-T 克隆试剂盒进行 PCR 扩增
产物的连接以及连接产物的转化。 将转化好的菌
体液体培养,送至上海生工测序。
(3)测序及系统发育分析 　 将测序获得菌株
的 16S rDNA 序列,提交互联网 NCBI 数据库,应
用 BLAST 与数据库中已有的同属菌的 16S rDNA
序列进行相似性比较分析,再用 MEGA3 软件进行
系统发育分析,绘制菌株的系统进化树。
1. 5　 菌株 ND045 的抗菌谱测定
　 　 操作方法同 1. 3。
1. 6　 发酵条件的优化
1. 6. 1　 碳氮源的优化　 采用单因子变量法[13],分
别以玉米粉、大米粉、马铃薯淀粉、麦芽糖、蔗糖、葡
萄糖代替可溶性淀粉作为有机碳源,配置各种培养
基,筛选最佳碳源;分别以大豆粉、酵母粉、硫酸铵、
硝酸钠、蛋白胨代替硝酸钾作为氮源,配置各种培
养基,进行氮源优化。 刮取 ND045 菌株的孢子接
入 300 mL 三角瓶内的 50 mL 液体种子培养基,
28℃180 r / min 振荡培养 30 h;液体种子以 8%的
接种量接入 300 mL 三角瓶内的 50 mL 各种培养
基,28℃180 r / min发酵培养 72 h。 按照 1. 3 中的
方法进行各个处理的抑菌效果测定。
1. 6. 2　 均匀设计法[14]优化发酵条件 　 选择最优
的碳源(大米粉)、最优的氮源(大豆粉)、NaCl、
K2HPO4、pH、温度为影响发酵条件的 6 个因素,每
个因素设置 4 个水平,总共 16 个处理,设计 U16
(46)的均匀设计表。 按照 1. 3 中的方法进行各个
处理的抑菌效果测定,筛选出最优的发酵处理。
2　 结果与分析
2. 1　 放线菌株的分离和拮抗活性测定
从浏阳河风光带采集的 16 份土样中筛选得到
207 个放线菌菌落,以辣椒尖孢炭疽病菌为指示
菌,筛选出 6 株具有拮抗作用的放线菌,其中以菌
株 ND045 的抑菌效果最好,该菌株的 5 倍发酵稀
释液对指示菌的菌丝生长抑制率高达 71. 60% (图
1)。
2. 2　 放线菌株 ND045 的分类鉴定
2. 2. 1　 ND045 菌株的形态特征 　 ND045 菌株在
高氏一号培养基上生长,具有典型的链霉菌属特
征,菌落紧密、表面皱折,皮壳状,青褐色。 气生菌
丝和基内菌丝均很丰富,在扫描电镜下观察(图 2)
发现,气生菌丝体形成孢子链时,孢子丝呈螺旋状,
孢子呈短圆柱形。
2. 2. 2 　 生理生化特性 　 ND045 菌株在高氏一号
固体培养基中生长产生暗黄色色素。 菌株能分解
利用纤维素,使明胶液化,使淀粉水解,能使牛奶胨
化,但不能使牛奶凝固,也不能产生硫化氢。
Fig. 1　 Inhibition of the strain ND045 against
Collectotrichum acutata
Fig. 2　 Morphology of the spore of ND045
024
　
　 4 期 　 　 朱宏建,等:一株辣椒尖孢炭疽病菌拮抗菌株的分离鉴定与发酵条件优化
2. 2. 3 　 菌株 ND045 的分子生物学鉴定 　 菌株
ND045 的 16S rDNA 序列经测定全长为 1 600 bp
(图 3),Blastn 分析( http: / / www. ncbi. nlm. nih.
gov / BLAST / )表明,ND045 与吸水链霉菌( Strep-
tomyces hygroscopicus)的相似性最高,相似性为
99% 。
Fig. 3 　 16S rDNA PCR product electrophore-
sis images of ND045
　 　 将菌株的 16S rDNA序列与 BLAST搜索到的
相近菌株进行 16S rDNA序列比较,计算所测定的
ND045 菌株的 16S rDNA全序列遗传距离,并根据
遗传距离用MEGA 3 软件构建系统发育树(图 4)。
结果表明 , ND045菌株与 Str . hygroscopicus及
Str. corchorusii 的 16S rDNA 序列相似性均达到
99% 。 但结合形态学、培养特征和生理生化特征分
析,将其鉴定为吸水链霉菌(Str. hygroscopicus)。
2. 3　 抗菌谱试验结果
经测验,该菌株的发酵滤液对供试的 8 种植物
病原真菌均有抑制作用,菌丝生长抑制率为
21． 70% ~ 72. 00% (表 1)。 其中,对辣椒疫霉病
菌、黄瓜枯萎病菌和辣椒白绢病菌的抑菌效果较
好,抑制率分别为 65. 20% 、71. 01% 和 72. 00% 。
在 5%和 1%水平上显著高于其他几种病原真菌。
Table 1 　 Inhibition of strain ND045 against
the fungal phytopathogens
Fungal phytopathogen Inhibition rate / %
Gibberella zeae 21. 70 aA
Botrytis cinerea 26. 10 aA
Rhizoctonia solani 28. 00 bB
Fusarium moniliforme 36. 10 cC
Magnaporthe oryzae 40. 58 cC
Phytophthora capsici 65. 20 dD
F. omysporum 71. 01 eE
Sclerotium rolfsii 72. 00 fF
Note: The lowercases and capital letters represent the
significance levels of difference at 5% and 1% , re-
spectively.
Fig. 4　 Phylogenetic tree of ND045
124
　
植物病理学报 42 卷
2. 4　 发酵条件优化结果
2. 4. 1　 不同碳、氮源对菌株发酵液抑菌活性的
影响　 在供试的 7 种碳源和 5 种氮源中,最优的碳
源是蔗糖,对指示菌的生长抑制率为 65. 21% , 其
次为大米粉, 对指示菌的抑制率为 46. 38% ,最优
的氮源是大豆粉,抑制率为 40. 58% (表 2)。 但考
虑到发酵成本和实际应用,选择大米粉和大豆粉作
为最优的碳源、氮源进行发酵条件研究。
2. 4. 2　 均匀设计试验优化发酵条件　 选择最优碳
源(大米粉)、最优氮源(大豆粉)、NaCl、K2HPO4、
pH、温度为影响发酵条件的 6 个因素,每个因素设
置 4 个水平,共 16 个处理,设计 U16(46)的均匀设
计表。 将菌株 ND045 按表中设计的 16 种发酵条
件进行发酵,试验结果用 DPS 数据库处理系统[15]
进行分析和统计,得到各个发酵条件下的滤液对辣
椒尖孢炭疽病菌的抑制效果,对菌丝生长抑制率最
高达到 82. 61% ,比优化前提高了 11. 01% (表 3)。
从表中可知,该菌株的最优发酵条件是大米粉 15
g / L、大豆粉 5 g / L、MgSO40. 5 g / L、FeSO4·7H2O
0. 01 g / L、 NaCl 1. 5 g / L、水 1 000 mL、 30℃、
pH 8. 0。
Table 2　 Different carbon and nitrogen sources on the strain ND045
antibacterial activity of fermentation broth
carbon source Inhibition rate / % nitrogen source Inhibition rate / %
Maltose 18. 84 aA NaNO3 18. 84 aA
Glucose 18. 76 aA (NH4) 2S4 20. 84 aAB
Potato starch 24. 62 bAB Yeast extract 26. 08 bB
Soluble starch 28. 98 bB Peptone 36. 23 cC
Corn flour 36. 23 cC Soybean meal 40. 58 cC
Rice Flour 46. 38 dD
Sucrose 65. 21 eE
Note: The lowercases and capital letters represent the significance levels of difference at 5% and 1% ,respectively.
Table 3　 The results of uniform design optimization of fermentation conditions
Level Rice Flour / g Soybean meal / g NaCl / g K2HPO4 / g T / ℃ pH Inhibition rate / %
1 15 25 0 0 30 5 7. 2 aA
2 35 25 1 1. 5 26 5 30. 34 bB
3 25 15 0. 5 0. 5 32 7 42. 03 cC
4 5 15 1. 5 1 26 6 42. 03 cC
5 25 35 0. 5 0. 5 32 6 43. 48 cdC
6 5 5 1 1. 5 32 6 44. 93 cdC
7 15 25 1 0. 5 28 5 46. 38 cdC
8 5 25 0 1 28 5 49. 28 deCD
9 35 15 1. 5 0 28 6 53. 62 efDE
10 25 35 0. 5 0 30 8 56. 52 efDE
11 15 25 1 0. 5 26 7 57. 97 efDE
12 5 35 0 1 28 7 57. 97 efDE
13 35 5 0. 5 1 26 8 59. 42 efDE
14 35 35 1. 5 1. 5 32 8 62. 32 fE
15 25 5 0 1. 5 30 7 76. 68 gF
16 15 5 1. 5 0 30 8 82. 61 gF
Note: The lowercases and capital letters represent the significance levels of difference at 5% and 1% ,respectively.
224
　
　 4 期 　 　 朱宏建,等:一株辣椒尖孢炭疽病菌拮抗菌株的分离鉴定与发酵条件优化
　 　 由于均匀设计表不具有整齐可比性,不适合于
做直观分析,因此我们采用逐步回归对均匀设计结
果进行深入分析,得出回归方程为:
y = -1. 970 483 771 - 0. 207 249 760 45X1 -
0. 244 000 291 84X2 +2. 884 971 694 6 X3 +
3． 638 596 149 X4 - 0. 554 911 250 6 X5 +
11． 253 305 443X6
　 　 模型统计学分析结果如下: 方程显著性检验,
本试验次数 n =16,因子数 m =6,总平方和 SST =
49. 22,回归平方和 SSR = 35. 24,残差平方和 SSe
=13. 98。 自由度:dfT = n -1 =15,dfR = m =6,dfe
= dfT - dfR = 9. 均方:MSR = SSR / dfR = 5. 87,
MSe = SSe / dfe = 1. 55。 F 检验:F = MSR / MSe =
3． 787,F0. 05(6,9) =3. 37,F > F0. 05(6,9)。 根据
F检验,回归方程有统计学意义。 模型综合分析:
相关系数 R =0. 769 035,调整后的相关系数 Ra =
0. 564 823,决定系数 R2 =0. 591 41;③各自变量偏
回归系数的显著性检验结果见表 4,从表 4 中 t 数
据表明,对菌株 ND045 发酵液对尖孢炭疽病菌的
抑制作用的影响最大的变量从大到小依次是 pH、
大豆粉、大米粉、K2HPO4、 NaCl、温度。 通过新复
极差法[16]进行多重比较,结果表明各个处理之间
有显著差异。
Table 4　 Department of partial regression in-
dependent variables significant test
of convergence
r Partial correlation t-Test Value P- Value
r(y,X1) -0. 195 9 0. 599 4 0. 562 3
r(y,X2) -0. 234 6 0. 724 0 0. 485 6
r(y,X3) 0. 139 9 0. 423 8 0. 680 7
r(y,X4) 0. 181 7 0. 554 5 0. 591 4
r(y,X5) -0. 109 8 0. 331 5 0. 747 1
r(y,X6) 0. 728 8 3. 193 1 0. 009 6
3　 结论与讨论
从浏阳河风光带采集的土样中,分离筛选得到
一株对辣椒尖孢炭疽病菌有强拮抗活性的放线菌
ND045,对该病菌的菌丝生长抑制率达 71. 60% 。
通过进行形态学、培养特征和生理生化特征和 16S
rDNA 序列的分析,将 ND045 菌株鉴定为吸水链
霉菌(Str. hygroscopicus)。 采用均匀设计试验对
该菌株发酵条件进行优化,获得其最优发酵条件:
大米粉 15 g / L、大豆粉 5 g / L、MgSO4 0. 5 g / L、Fe-
SO4·7H2O 0. 01 g / L、NaCl 1. 5 g / L、水 1 000
mL、30℃、pH 8. 0。
关于辣椒炭疽病的生防微生物报道较少,He
等[17]从辣椒植株中分离获得 2 株内生枯草芽孢杆
菌 BS-1 和 BS-2,对辣椒炭疽病具有较好的防治效
果, 菌株培养液对苗期炭疽病的防效分别为
81． 5%和 93. 3% 。 Jung 等[18]从山区森林土壤分
离的荧光假单胞菌 MM-B16 对辣椒炭疽病表现出
很高的防治效果。 Li等[19]从辣椒主产区采集土样
中分离到的 2 株链霉菌(菌株 A 和菌株 B)对辣椒
炭疽病菌有很好的抑制作用,两菌株发酵滤液稀释
10 倍后对辣椒炭疽病菌菌丝生长的抑制率分别达
到 48. 9%和 71. 8% 。 在生产上,辣椒尖孢炭疽病
菌比胶孢炭疽病菌的抗药性更强。 迄今为止,还未
见相关文献报道能用来防治辣椒尖孢炭疽病的生
防菌株。 而本研究发现的放线菌株 ND045 对辣椒
尖孢炭疽病菌有强拮抗活性,对病菌菌丝生长抑制
率最高达到 82. 61% ,为进一步研究开发高效安全
的生防菌剂提供了菌种资源。
吸水链霉菌(Str. hygroscopicus)是一类产生重
要生防活性物质的微生物,已经有大量研究人员对
该类微生物及其代谢产物进行了研究。 如 Gong
等[20]从吸水链霉菌 1. 358 ( Str. hygroscopicus
1． 358)发酵液中分离得到 3 个具有显著拮抗金黄
色葡萄球菌的活性化合物,分别鉴定为抗生素
RK955A、阿扎霉素和尼日尼亚菌素。 Zhang 等[21]
从泰山林地土壤中分离获得一株高效吸水链霉菌
BS-112(Str. hygroscopicus),该菌株能够产生抗细
菌和抗真菌活性两种抗菌物质。 Lian 等[22]从福州
郊区土壤中分离到一株吸水链霉菌 M-22,具有除
草剂活性,与 Kondo 等[23]报道的产生除草剂双丙
磷的吸水链霉菌 SF-1293 特征相近。
目前,ND045 菌株发酵液中抗菌活性物质的
主要成分,本课题组已经开始分离纯化。 而对主要
成分的结构鉴定、抑菌机理及其生防制剂的开发等
有待进一步研究,从而为辣椒尖孢炭疽病的有效防
治奠定基础。
参考文献
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