全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４４(６): ７１８￣７２２(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣０９￣２２ꎻ 修回日期: ２０１４￣０８￣０２
基金项目: 农业部公益性行业 (农业)科研专项 ( ２０１００３０２９)ꎻ云南省自然科学基金重点项目 ( ２００８ＣＣ０２４)ꎻ云南省科技强省专项
(２００９ＥＢ０６０)
通讯作者: 何月秋ꎬ教授ꎬ博士生导师ꎬ主要从事植物病理学及生物农药研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｙｎｆｈ２００７＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０６.０２２
研究简报
芽孢杆菌环脂肽类次生代谢产物的快速检测
李兴玉１ꎬ３ꎬ 毛自朝２ꎬ 吴毅歆２ꎬ 何月秋１ꎬ２∗
( １云南农业大学农业生物多样性应用技术国家工程中心ꎬ昆明 ６５０２０１ꎻ
２云南农业大学农学与生物技术学院ꎬ昆明 ６５０２０１ꎻ ３云南农业大学基础与信息工程学院ꎬ昆明 ６５０２０１)
Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｃｌｉｃ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＬＩ Ｘｉｎｇ￣ｙｕ１ꎬ３ꎬ ＭＡＯ
Ｚｉ￣ｃｈａｏ２ꎬ ＷＵ Ｙｉ￣ｘｉｎ２ꎬ ＨＥ Ｙｕｅ￣ｑｉｕ１ꎬ２ ( １Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｄｉ￣
ｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｙｕｎｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ (ＹＡＵ)ꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２０１ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ ＹＡＵꎬ
Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２０１ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ ＹＡＵꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２０１ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｃｙｃｌｉｃ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｒｅ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｐｏｔｅｎｔｉａｌ. Ａ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｂ. ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＺＢ４２ꎬ
Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＸＦ￣１ꎬ Ｂ. ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｂ９６０１￣Ｙ２ ａｎｄ Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８ ｉｎ ｓｉｔｕ ｕｓｉｎｇ ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ. Ｉｔ ｗａｓ
ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｓｔｒａｉｎｓ ＦＺＢ４２ ａｎｄ ＸＦ￣１ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｆｅｎｇｙｃｉｎｓꎬ ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ ａｎｄ ｉｔｕｒｉｎｓ. Ｙ２ ｍａｉｎｌｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｆｅｎｇｙｃｉｎｓ
ａｎｄ ｉｔｕｒｉｎｓ. Ｓｔｒａｉｎ １６８ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ａ ｓｍａｌｌ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｉｔｕｒｉｎｓ ｏｎｌｙ. Ｏｔｈｅｒ ｆｏｕｒ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ
ａｎｄ ｉｔｕｒｉｎｓ. Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｉｎ ｓｉｔｕ ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ ｉｓ ａ ｓｉｍｐｌｅꎬ ｒａｐｉｄꎬ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ
ａｃｃｕｒａｔｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｃｙｃｌｉｃ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌꎻ ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳꎻ ｆｅｎｇｙｉｃｎꎻ ｆｕｒｆａｃｔｉｎꎻ ｉｔｕｒｉｎ
文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０６￣０７１８￣０５
许多芽孢杆菌能分泌多种抗生素而被用于生
物防治ꎬ其中环脂肽(ＣＬＰＳ)类化合物因其结构多
样和广谱抑菌而倍受关注ꎮ 其结构包括一个环肽
和一条 β￣羟基或 β￣氨基脂肪酸支链ꎬ是一类具有
两亲特性的化合物ꎬ在多领域具有开发潜力ꎮ 如表
面活性素(Ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ)具有超强的表面活性、卓越
的乳化和起泡性ꎬ是目前最好的生物表面活性剂ꎮ
因这类物质具两性特点ꎬ能快速接近并嵌入细胞脂
质层ꎬ在一定剂量下会破坏细胞生物膜的完整性ꎬ
从而具有溶血、抗病毒和抗支原体等活性ꎻ伊枯草
菌素( Ｉｔｕｒｉｎｓ)有较强的溶血、抗细菌活性、广谱的
抗丝状真菌和抗酵母活性ꎬ没有抗病毒活性ꎻ丰源
素(Ｆｅｎｇｙｃｉｎｓ)的溶血活性弱ꎬ但具有超强抗丝状
真菌活性ꎮ ＣＬＰＳ类物质能不同层次地参与菌体居
群游动、生物膜和子实体形成等复杂的工作网络ꎬ如
表面活性素能影响枯草芽孢杆菌独立鞭毛的蠕动ꎬ
其表面活性减小了表面张力ꎬ从而减小细胞群体移
动摩擦力ꎬ促进枯草芽孢杆菌的有效定殖ꎮ 此外ꎬ表
面活性素和丰源素还可诱导植物产生抗性[１]ꎮ
本研究利用 ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ 全细胞原位技
术检测了 ８株芽孢杆菌ꎬ其中 ４个菌株的基因及次
生代谢产物研究已较为透彻ꎬ分别为生防菌 Ｂａｃｉｌ￣
ｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＺＢ４２ ( ＦＺＢ４２)ꎬ Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ＸＦ￣１ (ＸＦ￣１)ꎬ Ｂ. ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｙ２ (Ｙ２)和枯草
芽孢杆菌模式菌株 Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８ (Ｂ１６８)ꎮ 旨在证
实并推广ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ 全细胞原位检测技术作
６期 李兴玉ꎬ等:芽孢杆菌环脂肽类次生代谢产物的快速检测
为一种简单、快速、准确、灵敏的环脂肽化合物检测
方法ꎬ为生防芽孢杆菌防病机制研究提供技术支撑ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 菌株
４个对照菌株:Ｂ１６８(模式菌株)ꎬ其基因序列
包含环脂肽化合物合成基因ꎬ但是野生型菌株不产
丰源素和表面活性素ꎬ其他脂肽类化合物产量也很
低[２]ꎻＦＺＢ４２为植物根际促生防病细菌ꎬ是德国洪
堡大学用于生产“德国根宝(ＲｈｉｚｏＶｉｔａｌ® ４２)”产
品的菌株ꎬ其次生代谢产物主要含有表面活性素
(脂肪酸链由 １３~１５个碳原子组成ꎬ文章中均标记
为 Ｃ１３~１５的格式)、丰源素 Ａ (Ｃ１５~１７ )、丰源素 Ｂ
(Ｃ１５~１７)和杆菌抗霉素 Ｄ (Ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ Ｄ Ｃ１４~１７)
及聚酮类化合物[３]ꎻＸＦ￣１ 和 Ｙ２ 为本实验室的专
利菌株ꎬＸＦ￣１具有很好防治十字花科根肿病的能
力ꎬ其次生代谢产物主要包括丰源素 Ａ (Ｃ１４~１９)
[４]ꎬ 表 面 活 性 素 ( Ｃ１３~１７ ) 和 伊 枯 草 菌 素 Ｃ
(Ｃ１５ꎬ１７~１８)ꎮ Ｙ２ 具有促进植物生长ꎬ插条生根ꎬ抑
制真菌性、细菌性和线虫性病害的作用ꎮ 有 ９个基
因簇参与合成脂肽化合物杆菌抗霉素 Ｄ 和丰源
素、聚酮化合物杆菌烯 ( Ｂａｃｉｌｌａｅｎｅ)、地菲西丁
(Ｄｉｆｆｉｃｉｄｉｎ)和大环内酯(Ｍａｃｒｏｌａｃｔｉｎ)ꎬ以及二肽溶
杆菌素(Ｂａｃｉｌｙｓｉｎ)等次生代谢产物[５]ꎮ
４ 个测试菌株: Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. ０４１ꎬＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.
２８５ꎬＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. ３５５和 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ. ０３３(以下分别
称为 Ｂ０４１ꎬ Ｂ２８５ꎬ Ｂ３５５和 Ｂ０３３)均为本实验室分
离保存的生防菌株ꎮ
１.２ 培养基
ＬＢ培养基和 Ｌａｎｄｙ培养基ꎮ
１.３ 试剂与仪器
乙腈(色谱纯)ꎬ三氟醋酸(ＴＦＡ) (色谱纯)ꎬ
α￣氰基￣４￣羟基肉桂酸(ＣＨＣＡ)(色谱纯)ꎬ重蒸水ꎮ
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪:
Ｂｒｕｋｅｒ Ａｕｔｏｆｌｅｘ Ｓｐｅｅｄ ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ ( Ｂｒｕｋｅｒ
Ｄａｌｔｏｎｉｃｓꎬ Ｂｉｌｌｅｒｉｃａꎬ ＭＡꎬ ＵＳＡ)、高压灭菌锅、冷
冻离心机、恒温摇床、冰箱、超净工作台ꎮ
提取溶剂配制:７０ ｍＬ 乙腈加入 ０.１ ｍＬ ＴＦＡ
定容至 １００ ｍＬꎮ
辅助基质溶液配制:常温下 ＣＨＣＡ 溶于提取
溶剂配成饱和溶液ꎮ
１.４ 菌株培养
将各芽孢杆菌菌株划线于 ＬＢ 固体培养基上
３７℃恒温培养 ２４ ｈꎬ活化后的各菌株按 ５％接种于
ＬＢ液体培养基中ꎬ３０℃ꎬ１８０ ｒｐｍꎬ振荡培养 ２４ ｈꎬ
作为一级种子液ꎬ按 ５％接种于 Ｌａｎｄｙ 培养基ꎬ同
样条件下培养二级种子液ꎬ后者以无菌水稀释后涂
布于 Ｌａｎｄｙ固体培养基 ３７℃恒温培养 ４８ ｈꎮ
１.５ ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ检测
各芽孢杆菌挑取 ２个单菌落于目标板孔靶上ꎬ
加 ２ μＬ提取溶剂、２ μＬ 辅助基质混匀ꎬ自然风干
后 ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ检测ꎮ 仪器参数为:反射操作
模式ꎬ正离子检测ꎬ检测范围 １００ ~ ２ ０００ Ｄａꎬ激光
点击数每图谱 ５０ꎬ激光频率 ３０.０ Ｈｚꎬ离子源加速
电压 ２０ ｋＶꎬ反射电压 ２３.５ ｋＶ脉冲离子ꎮ
２ 结果与分析
图 １展示了 ８株芽孢杆菌经 ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ
检测所得的 ＣＬＰｓ 化合物的质谱图 (ｍ / ｚ ８００ ~
２ ０００)ꎬ表面活性素和伊枯草菌素的分子离子峰集
中于 ｍ / ｚ １ ０００~１ １００ꎻｍ / ｚ １ ４００~１ ５００属于丰源
素化合物信号ꎬ如图 １中 ＦＺＢ４２所示ꎬｍ/ ｚ (１ ０３１.８ꎬ
１ ０５３.５ꎬ １ ０６９.５ꎻ １ ０６７.５ꎬ １ ０８３.５ꎻ １ ０８１.５ꎬ １ ０９７.５ꎻ
１ ０９５.５ꎬ １ １１１.６ꎻ １ １０９.５ꎻ １ ０６３.６ꎻ １ ０９９.６)为伊枯
草菌素家族的化合物Ｃ１１Ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ Ｄ ([Ｍ＋Ｈ]
＋ꎬ
[Ｍ＋Ｎａ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｋ] ＋)ꎻＣ１ ２杆菌抗霉素 Ｄ ([Ｍ＋
Ｎａ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｋ] ＋)ꎻＣ１３杆菌抗霉素 Ｄ ([Ｍ＋Ｎａ]
＋ꎬ
[Ｍ＋Ｋ] ＋)ꎻＣ１ ４杆菌抗霉素 Ｄ ([Ｍ＋Ｎａ]
＋ꎬ [Ｍ＋
Ｋ] ＋)ꎻＣ１５杆菌抗霉素 Ｄ ([Ｍ＋Ｎａ]
＋)ꎻＣ１４杆菌抗
霉素 ＬＣ ([Ｍ＋Ｈ] ＋)和 Ｃ１５杆菌抗霉素 ＬＣ ([Ｍ＋
Ｎａ] ＋)ꎮ ｍ / ｚ (１ ０３０.６ꎬ １ ０４６.６ꎻ １ ０４４.６ꎬ １ ０６０.６ꎻ
１ ０５８.７ꎬ １ ０７４.６ꎻ １ ０８８.７)为表面活性素家族的化
合物 Ｃ１１表面活性素([Ｍ＋Ｎａ]
＋ꎬ [Ｍ＋Ｋ] ＋)ꎻ Ｃ１２
表面活性素([Ｍ＋Ｎａ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｋ] ＋)ꎻ Ｃ１３表面活性
素([Ｍ＋Ｎａ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｋ] ＋)ꎻ Ｃ１ ４表面活性素([Ｍ＋
Ｋ] ＋)ꎬ但是ꎬ由于该族化合物存在多种同分异构现
象ꎬ如 Ｃ１１ 表面活性素ꎬ Ｃ１０ Ｅｓｐｒｉｎꎬ Ｃ１０ 地衣素
(Ｌｉｃｈｅｎｙｓｉｎ)ＢꎬＣ１０Ｐｕｍｉｌａｃｉｄｉｎ 和 Ｃ１９Ｂａｍｙｌｏｃｉｎ Ａ
为一组同分异构体[１]ꎬ因此不能确定为何种结构ꎬ
便于叙述ꎬ表 １中记为表面活性素ꎮ ｍ / ｚ (１ ４７３.７ꎬ
９１７
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. １ Ｍｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ ｏｆ ｃｙｃｌｉｃ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｅｉｇｈｔ Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｒａｉｎｓ ｂｙ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｉｎ ｓｉｔｕ ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ
０２７
６期 李兴玉ꎬ等:芽孢杆菌环脂肽类次生代谢产物的快速检测
Ｔａｂｌｅ １ Ｉｔｕｒｉｎｓꎬ ｆｅｎｇｙｃｉｎｓ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ
ｍ / ｚ Ｉｏｎｉｃ ｔｙｐｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｂ１ Ｂ２ Ｂ３ Ｂ４ Ｂ５ Ｂ６ Ｂ７ Ｂ８
( Ｉｔｕｒｉｎｓ) [１ ꎬ ３]
１ ０３１.８ꎬ １ ０５３.５ꎬ １ ０６９.５ [Ｍ＋Ｈ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｎａ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｋ] ＋ Ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ Ｄ (Ｃ１１) ＋ ＋ ＋ ＋
１ ０６７.５ꎬ １ ０８３.５ [Ｍ＋Ｎａ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｋ] ＋ Ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ Ｄ (Ｃ１２) ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
１ ０８１.５ꎬ １ ０９７.５ [Ｍ＋Ｎａ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｋ] ＋ Ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ Ｄ (Ｃ１３) ＋ ＋ ＋
１ ０９５.５ꎬ １ １１１.６ [Ｍ＋Ｎａ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｋ] ＋ Ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ Ｄ (Ｃ１４) ＋ ＋ ＋
１ １０９.５ [Ｍ＋Ｎａ] ＋ Ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ Ｄ (Ｃ１５) ＋
１ ０６６.７ꎬ １ ０８２.６ [Ｍ＋Ｎａ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｋ] ＋ Ｉｔｕｔｉｎ Ｃ (Ｃ１１) ＋ ＋
１ ０８０.７ꎬ １ ０９６.６ [Ｍ＋Ｎａ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｋ] ＋ Ｉｔｕｔｉｎ Ｃ (Ｃ１２) ＋ ＋ ＋ ＋
１ ０９４.６ [Ｍ＋Ｎａ] ＋ Ｉｔｕｔｉｎ Ｃ (Ｃ１３) ＋
１ １３６.６ [Ｍ＋Ｎａ] ＋ Ｉｔｕｔｉｎ Ｃ (Ｃ１６) ＋
１ １５０.６ [Ｍ＋Ｎａ] ＋ Ｉｔｕｔｉｎ Ｃ (Ｃ１７) ＋
１ ０６３.６ [Ｍ＋Ｈ] ＋ Ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ ＬＣ (Ｃ１４) ＋
１ ０９９.６ [Ｍ＋Ｎａ] ＋ Ｂａｃｉｌｌｏｍｙｃｉｎ ＬＣ (Ｃ１５) ＋ ＋
１ ０９８.６ꎬ １ １２０.６ [Ｍ＋Ｈ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｎａ] ＋ Ｉｔｕｔｉｎ Ｃ (Ｃ１５含一个双键) ＋ ＋
１ １１２.６ꎬ １ １３４.６ [Ｍ＋Ｈ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｎａ] ＋ Ｉｔｕｔｉｎ Ｃ (Ｃ１６含一个双键) ＋ ＋ ＋ ＋
(Ｆｅｎｇｙｃｉｎｓ) [１ꎬ ３ꎬ ４]
１ ４７３.７ꎬ １ ４３５.８ꎬ １ ４５７.８ [Ｍ＋Ｋ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｈ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｎａ] ＋ Ｆｅｎｇｙｃｉｎ Ａ (Ｃ１ ４) ＋ ＋ ＋
１ ４４９.８ꎬ １ ４８７.７ꎬ １ ４７１.７ [Ｍ＋Ｈ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｋ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｎａ] ＋ Ｆｅｎｇｙｃｉｎ Ａ (Ｃ１５) ＋ ＋ ＋
１ ４６３.８ꎬ １ ４８５.８ꎬ １ ５０１.７ [Ｍ＋Ｈ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｎａ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｋ] ＋ Ｆｅｎｇｙｃｉｎ Ａ (Ｃ１６) ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
１ ４７７.８ꎬ １ ４９９.８ꎬ １ ５１５.６ [Ｍ＋Ｈ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｎａ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｋ] ＋ Ｆｅｎｇｙｃｉｎ Ａ (Ｃ１７) ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
１ ４９１.９ꎬ １ ５１３.８ꎬ １ ５２９.８ [Ｍ＋Ｈ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｎａ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｋ] ＋ Ｆｅｎｇｙｃｉｎ Ａ (Ｃ１８) ＋ ＋ ＋ ＋
１ ５０５.８ꎬ １ ５２７.８ꎬ １ ５４３.８ [Ｍ＋Ｈ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｎａ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｋ] ＋ Ｆｅｎｇｙｃｉｎ Ａ (Ｃ１９) ＋ ＋ ＋ ＋
１ ５１９.７ꎬ １ ５５７.８ [Ｍ＋Ｈ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｋ] ＋ Ｆｅｎｇｙｃｉｎ Ａ (Ｃ２０) ＋ ＋
１ ５３３.８ꎬ １ ５７１.８ [Ｍ＋Ｈ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｋ] ＋ Ｆｅｎｇｙｃｉｎ Ａ (Ｃ２１) ＋ ＋
１ ５４７.８ [Ｍ＋Ｈ] ＋ Ｆｅｎｇｙｃｉｎ Ａ (Ｃ２２) ＋
(Ｓｕｒｆａｃｔｉｎｓ) [１ꎬ ３]
１ ０３０.６ꎬ １ ０４６.６ [Ｍ＋Ｎａ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｋ] ＋ Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ (Ｃ１１) ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
１ ０４４.６ꎬ １ ０６０.６ [Ｍ＋Ｎａ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｋ] ＋ Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ (Ｃ１２) ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
１ ０５８.７ꎬ １ ０７４.６ [Ｍ＋Ｎａ] ＋ꎬ [Ｍ＋Ｋ] ＋ Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ (Ｃ１３) ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
１ ０８８.７ [Ｍ＋Ｋ] ＋ Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ (Ｃ１４) ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
１ １０２.７ [Ｍ＋Ｋ] ＋ Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ (Ｃ１５) ＋ ＋ ＋ ＋
Ｎｏｔｅ: Ｂ１ ￣Ｂ８ ｍｅａｎｓ Ｂ. ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＺＢ４２ꎬ Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＸＦ￣１ꎬ Ｂ. ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ Ｂ９６０１￣Ｙ２ꎬ Ｂ. ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８ꎬ Ｂ０４１ꎬ
Ｂ２８５ꎬ Ｂ３５５ ａｎｄ Ｂ０３３ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
“＋”ｍｅａｎｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｂｌａｎｋ ｍｅａｎｓ ｎｏ ｓｉｇｎａｌ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｒａｉｎ.
１２７
植物病理学报 ４４卷
１ ４３５. ８ꎬ １ ４５７. ８ꎻ １ ４４９. ８ꎬ １ ４８７. ７ꎬ １ ４７１. ７ꎻ
１ ４６３.８ꎬ １ ４８５. ８ꎬ １ ５０１. ７ꎻ １ ４７７. ８ꎬ １ ４９９.８ꎬ
１ ５１５.６ꎻ １ ４９１. ９ꎬ １ ５１３. ８ꎬ １ ５２９. ８ꎻ １ ５０５.８ꎬ
１ ５２７.８ꎬ １ ５４３. ８ꎻ １ ５１９. ７ꎬ １ ５５７. ８ꎻ １ ５３３.８ꎬ
１ ５７１.８)为丰源素家族的化合物ꎬ该族化合物也存
在多种同分异构现象 (丰源素 Ａꎬ Ｂꎬ Ｃꎬ Ｅ 和
Ｓ) [４]ꎬ便于叙述ꎬ记为丰源素 Ａꎬ以上信号对应 Ｃ１４
~ Ｃ２１丰源素 Ａ的分子离子峰[Ｍ＋Ｋ]
＋ꎬ [Ｍ＋Ｈ] ＋
和[Ｍ＋Ｎａ] ＋ꎮ 其余菌株的 ＣＬＰｓ 化合物如表 １ 所
示ꎬ其中对照菌株 ＦＺＢ４２ꎬ ＸＦ￣１ꎬ Ｙ２ 和 Ｂ１６８ 检测
结果与文献报道一致ꎬ尤其是野生型 Ｂ１６８ꎬ已证明
其不产丰源素和表面活性素ꎬ其它脂肽也很少[２]ꎮ
本次研究中仅检测到 １个伊枯草菌素分子ꎬ与文献
报道完全吻合ꎬ这充分证明用 ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ 全
细胞原位检测芽孢杆菌的环脂肽类化合物真实可
靠ꎮ
Ｂ０４１、Ｂ２８５、Ｂ３５５ 和 Ｂ０３３ 与 ＦＺＢ４２、ＸＦ￣１和
Ｙ２相比ꎬ它们抑制三七根腐病活性相对较弱(抑
制结果未展示)ꎮ 通过 ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ 图谱分析
发现(图 １)ꎬＢ０４１、Ｂ２８５、Ｂ３５５和 Ｂ０３３缺少了 ｍ / ｚ
１ ４００~ １ ５００ 的信号或信号很弱ꎬ说明不产或少产
丰源素类化合物ꎬ而这类化合物对真菌有较强的生
防活性ꎬ尤其是对丝状真菌活性最强ꎮ 这也许是 ４
个测试菌株生防活性相对较弱的原因之一ꎮ
３ 讨论
芽孢杆菌的生防活性与 ＣＬＰｓ 类抗生素有关ꎬ
甚至称其为“生防多功能武器” [１]ꎬ快速准确地检
测这一“武器”显得尤为重要ꎮ ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ
具有灵敏度高、准确性高及分辨率高等特点ꎬ在生
命科学等领域的研究中起着越来越重要的作用ꎬ如
肽质量指纹谱蛋白质鉴定ꎬ快速测定分析寡核苷
酸ꎬ代谢产物微生物逆向鉴定法等等ꎮ 该方法近些
年来被应用于微生物次生代谢产物定性研究已获
得了许多成果ꎮ 本文利用该技术结合全细胞原位
分析法检测了 ８株生防芽孢杆菌的次生代谢产物ꎬ
在 ｍ / ｚ ８００~２ ０００获得了清晰的 ＣＬＰｓ化合物分子
离子峰信号(如图 １ 所示)ꎬ可以快速定性判断表
面活性素ꎬ伊枯草菌素和丰源素类化合物ꎮ 该方法
无需发酵、提取、分离纯化等过程ꎬ可以直接测定细
胞单菌落ꎬ其过程简单快速ꎬ灵敏度高ꎮ 但由于芽
孢杆菌环脂肽类化合物结构变化多样ꎬ存在多种同
分异构体[１]ꎬ仅从 ＭＡＬＤＩ￣ＴＯＦ￣ＭＳ 检测结果ꎬ不
能鉴定此类化合物ꎬ如 ｍ / ｚ １０３０.６ 可能是 Ｃ１１表面
活性素ꎬＣ１０ＥｓｐｒｉｎꎬＣ１０地衣素 ＢꎬＣ１０Ｐｕｍｉｌａｃｉｄｉｎ 或
是 Ｃ９Ｂａｍｙｌｏｃｉｎ Ａꎬ若想获得结构信息ꎬ需进一步
测定其二级质谱ꎬ通过碎片离子峰来鉴定化合物结
构ꎮ 其次ꎬ该技术应用于环脂肽类化合物分析准确
可靠ꎬ不受辅助基质的干扰ꎬ但应用于次生代谢产
物系统分析存在局限ꎬ如 ｍ / ｚ ５００以下的信号受基
质信号干扰很难被利用ꎻ水溶性强、易扩散至培养
基或发酵液中的化合物很难被检测到ꎬ如聚酮化合
物[３]ꎮ
参考文献
[１] Ｏｎｇｅｎａ Ｍꎬ Ｊａｃｑｕｅｓ Ｐ. Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅｓ: ｖｅｒｓａｔｉｌｅ
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Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００８ꎬ １６(３):１１５－１２５.
[２] Ｔｓｕｇｅ Ｋꎬ Ａｎｏ Ｔꎬ Ｈｉｒａｉ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｄｅｇＱꎬ
ｐｐｓꎬ ａｎｄ ｌｐａ￣８ (ｓｆｐ) ａｒｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８ ｔｏ ｐｌｉｐａｓｔａｔｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ [ Ｊ ] .
Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙꎬ １９９９ꎬ ４３
(９):２１８３－２１９２.
[３] Ｃｈｅｎ Ｘ Ｈꎬ Ｋｏｕｍｏｕｔｓｉ Ａꎬ Ｓｃｈｏｌｚ Ｒꎬ ｅｔ ａｌ. Ｍｏｒｅ ｔｈａｎ
ａｎｔｉｃｉｐａｔｅｄ￣ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｅｃｏｎｄａ￣
ｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＦＺＢ４２
[Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ￣
ｎｏｌｏｇｙꎬ ２００９ꎬ １６:１４－２４.
[４] Ｌｉ Ｘ Ｙꎬ Ｍａｏ Ｚ Ｃꎬ Ｗａｎｇ Ｙ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ. Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ
ａｃｔｉｖｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｆｅｎｇｙｃｉｎ￣ｔｙｐｅ ｃｙｃｌｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＸＦ￣１ ａｇａｉｎｓｔ Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａ ｂｒａｓｓｉ￣
ｃａｅ [Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ
２０１３ꎬ ２３(３):３１３－３２１.
[５] Ｈａｏ Ｋꎬ Ｈｅ Ｐꎬ Ｂｌｏｍ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｐｌａｎｔ
ｇｒｏｗｔｈ￣ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｕｂｓｐ.
ｐｌａｎｔａｒｕｍ ｓｔｒａｉｎ ＹＡＵ Ｂ９６０１￣Ｙ２ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ ｇｅｎｅ
ｃｌｕｓｔｅｒ ｆｏｒ ｍｅｒｓａｃｉｄｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ [ Ｊ ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙꎬ ２０１２ꎬ １９４(１２):３２６４－３２６５.
责任编辑:李晖
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