全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４４(５): ５０４￣５１１(２０１４)
收稿日期: ２０１４￣０１￣０５ꎻ 修回日期: ２０１４￣０５￣２０
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(３１００００７１)ꎻ 公益性行业(农业)科研专项(２０１３０３０１５)
通讯作者: 邹丽芳ꎬ 副教授ꎬ 主要从事分子植物病理学研究ꎻ Ｔｅｌ: ０２１￣３４２０５８７３ꎬ Ｆａｘ: ０２１￣３４２０５８７３ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｚｏｕｌｉｆａｎｇ２０２０１８＠ｓｊｔｕ.ｅｄｕ. ｃｎ
第一作者: 赵征慧ꎬ 女ꎬ 上海人ꎬ 本科生ꎬ 主要从事分子植物病理学研究ꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０５.００８
２个适于水稻条斑病菌致病相关基因
转录表达分析的启动子探针载体的构建
赵征慧ꎬ 熊 鹂ꎬ 沈春伟ꎬ 孙奇博ꎬ 邹丽芳∗ꎬ 陈功友
(上海交通大学农业与生物学院ꎬ上海 ２００２４０)
摘要:水稻条斑病菌(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａꎬ Ｘｏｃ)为稻黄单胞菌种下的致病变种ꎬ引起细菌性条斑病(ｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｌｅａｆ ｓｔｒｅａｋꎬ ＢＬＳ)ꎬ对水稻安全生产构成严重威胁ꎮ 为准确在水稻条斑病菌中进行致病相关基因的转录表达和调控分析ꎬ本
研究构建了包含终止子、ｇｕｓＡ报道基因和多克隆位点等启动子探针元件的载体 ｐＵＴＧ０１和 ｐＵＴＧ１４ꎮ 选取 Ｘｏｃ的 ｈｒｐＦ启
动子ꎬ构建在 ｐＵＴＧ０１载体上ꎬ将其导入 ｈｒｐＸ突变体 ＲΔｈｒｐＸ中ꎬＧＵＳ活性测定结果显示ꎬｈｒｐＦ基因的表达显著减低ꎬ验证
了 ｈｒｐＦ受 ＨｒｐＸ正调控ꎬ证实该载体可有效进行基因的转录表达分析ꎻ通过双质粒兼容共存策略ꎬ在 ｈｒｐＸ突变体中同时实
现了 ｈｒｐＸ基因的功能互补和通过 ＧＵＳ活性定量测定 ｈｒｐＦ基因的转录表达分析ꎮ 该载体系统的建立ꎬ为后续分析稻黄单
胞菌致病相关基因的表达调控提供了有效的工作系统ꎮ
关键词:水稻条斑病菌ꎻ ｇｕｓＡ基因ꎻ ｈｒｐＦ基因ꎻ 基因表达ꎻ 转录融合
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｍｏｔｅｒ￣ｐｒｏｂｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａ ＺＨＡＯ Ｚｈｅｎｇ￣ｈｕｉꎬ ＸＩＯＮＧ Ｌｉꎬ
ＳＨＥＮ Ｃｈｕｎ￣ｗｅｉꎬ ＳＵＮ Ｑｉ￣ｂｏꎬ ＺＯＵ Ｌｉ￣ｆａｎｇꎬ ＣＨＥＮ Ｇｏｎｇ￣ｙｏｕ ( Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏ
Ｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２４０ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａ (Ｘｏｃ)ꎬ ａ ｐａｔｈｏｖａｒ ｏｆ Ｘ. ｏｒｙｚａｅꎬ ｃａｕｓｅｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｅａｆ ｓｔｒｅａｋ
(ＢＬＳ) ｏｆ ｒｉｃｅ (Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ)ꎬ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｔｈｒｅａｄ ｔｏ ｒｉｃｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ. Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅ￣
ｎｉｃｉｔｙ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｃｃｕｒａｔｅｌｙꎬ ｔｗｏ ｐｒｏｍｏｔｅｒ￣ｐｒｏｂｅ ｖｅｃｔｏｒｓꎬ ｐＵＴＧ０１ ａｎｄ ｐＵＴＧ１４ꎬ
ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ. Ｅａｃｈ ｏｆ ｔｈｅｍ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ￣ｐｒｏｂｅ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｔｈａｔ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｏｆ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓꎬ ｕｎｉｑｕｅ ｒｅｓｔｒｉｃ￣
ｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ａｎｄ ａ ｇｕｓＡ ｒｅｐｏｒｔｅｒ. Ｔｏ ｖｅｒｉｆｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓꎬ ｈｒｐＦ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ Ｘｏｃ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＵＴＧ０１ꎬ
ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｈｒｐＸ ｍｕｔａｎｔ ＲΔｈｒｐＸ ｏｆ Ｘｏｃ ＲＳ１０５ ｓｔｒａｉｎ. ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ａｓｓａｙ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｈｒｐＦ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗａｓ ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｄｕｃｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｈｒｐＸ ｍｕｔａｎｔꎬ ｂｅｉｎｇ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ
ｐｒｅｖｉｏｕｓ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｒｐＦ ｗａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ＨｒｐＸ. Ｔｈｉｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ
ｐｒｏｍｏｔｅｒ￣ｐｒｏｂｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗｅｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ. Ｆｉｎａｌｌｙꎬ ｂｙ
ｕｓｉｎｇ ａ ｔｗｏ￣ｐｌａｓｍｉｄ￣ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｓｔｒａｔｅｇｙꎬ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｒｐＸ ｍｕｔａｎｔ ｗｉｔｈ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｒｐＸ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ
ａｎｄ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｗａｓ ａｃｃｏｍｐｌｉｓｈｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｈｒｐＦ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎ￣
ｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ. Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅꎬ ｔｈｅｓｅ ｔｗｏ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｏｕｌｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｕｐｐｏｒｔ ｔｏ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅ￣
ｎｉｃｉｔｙ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｘ. ｏｒｙｚａｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａꎻ ｇｕｓＡ ｇｅｎｅꎻ ｈｒｐＦ ｇｅｎｅꎻ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎻ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｆｕｓｉｏｎ
中图分类号: Ｓ４３２. ４２ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０５￣０５０４￣０８
５期 赵征慧ꎬ等:２个适于水稻条斑病菌致病相关基因转录表达分析的启动子探针载体的构建
细菌性条斑病菌(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚ￣
ｉｃｏｌａꎬ Ｘｏｃ)为稻黄单胞菌种下的致病变种ꎬ引起细
菌性条斑病(ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｅａｆ ｓｔｒｅａｋꎬ ＢＬＳ)ꎬ是水稻上重
要的细菌病害[１]ꎮ 该病原菌从水稻叶片的气孔侵入
水稻组织ꎬ在组织中繁殖和扩增ꎬ表现明显的病害症
状ꎬ整个病程(ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ)需要表达各种毒性相关
的因子ꎬ依靠一个可调控的毒性网络进行协调[２ꎬ３]ꎮ
毒性调控网络的解析需要灵敏和高效的基因转录融
合表达体系ꎬ以揭示基因表达和调控的机制ꎮ
启动子探针载体(ｐｒｏｍｏｔｅｒ￣ｐｒｏｂｅ￣ｖｅｃｔｏｒ)是研
究基因转录融合表达的遗传操作工具[４]ꎮ 这类载
体包含一些相同的元件:(１)不含有启动子的报道
基因ꎬ其表达容易进行定量检测[４]ꎻ(２)启动子上游
具有多克隆位点ꎬ已知启动子或者一些未知功能的基
因组片段能够克隆在该区域[４]ꎻ(３)多克隆位点上游
含有终止子片段ꎬ能够消除载体旁侧序列通读转录
(ｒｅａｄ￣ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ)造成报道基因高背景水
平的表达[４~６]ꎮ 另外ꎬ高效的基因转录融合表达体系
需要启动子探针载体在宿主菌中能够稳定复制[４]ꎮ
目前ꎬ已有的启动子探针载体大多数以 ｌａｃＺ
或 ｇｆｐ为报道基因ꎬ仅能在 Ｅ. ｃｏｌｉ 中复制ꎬ不能在
稻黄单胞菌中使用[６]ꎬ一些具有广泛宿主(ｂｒｏａｄ￣
ｈｏｓｔ￣ｒａｎｇｅ)的启动子载体如 ｐＰＲＯＢＥ 系列[４]ꎬ以
ｇｆｐ为报道基因ꎬ能够成功导入 Ｘｏｃ 中ꎬ但是在没
有抗生素选择压力下ꎬ不能够稳定遗传ꎬＧＦＰ 的荧
光定量测定容易受细菌胞外黄色素的干扰ꎮ
ｐＬＡＦＲ１载体以 ｇｕｓＡ 为报道基因ꎬ适合于野油菜
黄单胞菌ꎬ但不能有效转移至稻黄单胞菌中[７ꎬ８]ꎮ
一些克隆载体如 ｐＵＦＲ０３４、ｐＨＭ１、ｐＭＬ１２３ 和 ｐＢ￣
ＢＲ１ＭＣＳ系列在稻黄单胞菌中能够稳定复制ꎬ但
是这些载体不具备转录融合元件[９~１２]ꎮ
为了整合上述启动子探针载体所需的重要特
点ꎬ本研究利用 ｇｕｓＡ为报道基因ꎬ构建了启动子探
针载体ꎬ成功建立了一套适用于 Ｘｏｃ的基因融合转
录表达的体系ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 菌株和质粒
本研究所用的质粒和菌株见表 １ꎮ 大肠杆菌
Ｔａｂｌｅ １ Ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄ Ｒｅｌｅｖａｎｔ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ Ｓｏｕｒｃｅ
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ.ｏｒｙｚａｅ
ＲＳ１０５ Ｘｏｃ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｒａｃｅ ２ꎻ Ｒｉｆ ｒ Ｔｈｉｓ ｌａｂ
ＲΔｈｒｐＸ Ｔｈｅ ｈｒｐＸ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＲＳ１０５ꎻ Ｋｍｒ Ｔｈｉｓ ｌａｂ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＥＣ１００Ｄ＋ ＥＣ１００ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅꎬ ｐｉｒ＋ Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｐｌａｓｍｉｄｓ
ｐＭＤ１８￣Ｔ ｓｉｍｐｌｅ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒꎬ ｐＵＣ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅꎻ Ａｐｒ ＴａＫａＲａ
ｐＵＦＲ０３４ ＩｎｃＷꎬ ｍｏｂ＋ꎬ ｌａｃＺａ＋ꎻ Ｋｍｒ [９]
ｐＵＦＲｇｕｓ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｌｅｓｓ ｇｕｓＡ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ ｐＵＦＲ０３４ ｂｙ ＥｃｏＲ Ｉ ａｎｄ Ｋｐｎ Ｉ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｔ￣Ｔ０Ｔ１ｇｕｓ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｔ０Ｔ１￣ＭＣＳ￣ｇｕｓＡ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ ｐＭＤ１８￣Ｔ ｓｉｍｐｌｅꎻ Ａｐｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｔ￣Ｔ１４ｇｕｓ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ ｃａｓｓｅｔｔｅ (Ｔ１) ４ ￣ＭＣＳ￣ｇｕｓＡ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ ｐＭＤ１８￣Ｔ ｓｉｍｐｌｅꎻ Ａｐｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｔ￣ｇｕｓ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｌｅｓｓ ｇｕｓＡ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ ｐＭＤ１８￣Ｔ ｓｉｍｐｌｅꎻ Ａｐｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｔｓ￣Ｔ０Ｔ１ｇｕｓ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｔ０Ｔ１￣ＭＣＳ￣ｇｕｓＡ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ ｐＭＤ１８￣Ｔ ｓｉｍｐｌｅꎻ Ａｐｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｔｓ￣Ｔ１４ｇｕｓ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ ｃａｓｓｅｔｔｅ (Ｔ１) ４ ￣ＭＣＳ￣ｇｕｓＡ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ ｐＭＤ１８￣Ｔ ｓｉｍｐｌｅꎻ Ａｐｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＰＲＯＢＥ￣ＮＴ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ￣ＧＦＰ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄꎻ Ｋｍｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＵＴＧ０１ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｔ０Ｔ１￣ＭＣＳ￣ｇｕｓＡ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ ｐＵＦＲ０３４ꎻ Ｋｍｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＵＴＧ￣ｈｒｐＦ Ｔｈｅ ｈｒｐＦ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ ｐＵＴＧ０１ꎻ Ｋｍｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＵＦＧ￣ｈｒｐＦ Ｔｈｅ ｈｒｐＦ::ｇｕｓ ｆｒｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ ｐＵＦＲ０３４ꎻ Ｋｍｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＵＴＧ１４ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ ｃａｓｓｅｔｔｅ (Ｔ１) ４ ￣ＭＣＳ￣ｇｕｓＡ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ ｐＵＦＲ０３４ꎻ Ｋｍｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＵＣ１８Ｔ￣ｍｉｎｉ￣Ｔｎ７Ｔ￣Ｇｍ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｔ０Ｔ１ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒꎻ Ｇｍｒ [１４]
ｐＭＬｈｒｐＸｏｃ Ｔｈｅ ｈｒｐＸ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ ｐＭＬ１２３ ｂｙ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ａｎｄ Ｘｈｏ Ｉꎻ Ｇｍｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＮＧ Ｔｈｅ ｇｕｓＡ ｇｅｎｅ ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｔｈｅ ｇｆｐ ｇｅｎｅ ｉｎ ｐＰＲＯＢＥ￣ＮＴ ｂｙ Ｎｄｅ Ｉ ｓｉｔｅꎻ Ｋｍｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
５０５
植物病理学报 ４４卷
ＥＣ１００Ｄ＋置于 ＬＢ 培养基中生长ꎬ最适宜生长温度
为 ３７℃ꎬ黄单胞菌株于 ＮＡ、ＮＢ 或者 ＸＯＭ３[１３]培
养基中生长ꎬ最适生长温度为 ２８℃ꎮ 相应的抗生
素浓度: ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ ( Ａｐ１００ μｇ / ｍＬ )、 ｋａｎａｍｙｃｉｎ
(Ｋｍ ２０ μｇ / ｍＬ)和 ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ (Ｇｍ １０ μｇ / ｍＬ)ꎮ
本研究所用的限制性内切酶、 ＥＸ￣Ｔａｑ 酶和
Ｔ４￣ＤＮＡ连接酶均购于 ＴａＫａＲａ 公司 ( Ｄａｌｉａｎꎬ
Ｃｈｉｎａ)ꎮ
１.２ 引物设计与合成
根据 Ｘｏｃ ＲＳ１０５ 菌株 ｈｒｐ 基因簇序列(Ｇｅｎ￣
Ｂａｎｋ: ＡＹ８７５７１４)设计 ｈｒｐＦ 启动子的引物ꎬ所有
引物的合成均在生工生物工程(上海)有限公司进
行ꎮ 引物序列见表 ２ꎮ
１.３ 启动子探针元件的构建
以 ｇｕｓＮ￣Ｆ 和 ｇｕｓＮ￣Ｒ 为引物ꎬ以 ｐＫ１８ｍｏｂＧＩＩ
质粒 ＤＮＡ 为模版ꎬＰＣＲ 扩增出 １.８ ｋｂ 的 ｇｕｓＡ 基
因片段ꎬ经 Ｎｄｅ Ｉ酶切后克隆在经过相同酶处理的
ｐＰＲＯＢＥ￣ＮＴ 载体上ꎬ获得重组载体 ｐＮＧꎮ 以
Ｔ０Ｔ１￣Ｆ和 Ｔ０Ｔ１￣Ｒ 为引物ꎬ以载体 ｐＵＣ１８Ｔ￣ｍｉｎｉ￣
Ｔｎ７Ｔ￣Ｇｍ 的质粒 ＤＮＡ 为模版[１４]ꎬ ＰＣＲ 扩增出
３０８ ｂｐ的终止子片段 Ｔ０Ｔ１ꎬ以 Ｔ１￣Ｆ 和 Ｔ１￣Ｒ 为引
物ꎬ以载体 ｐＰＲＯＢＥ￣ＮＴ的质粒 ＤＮＡ 为模版ꎬＰＣＲ
扩增出 ９３４ ｂｐ 的终止子片段(Ｔ１) ４ꎮ 将 Ｔ０Ｔ１ 和
(Ｔ１) ４片段分别与 ｐＮＧ 的 ２. １ ｋｂ 的 Ｈ￣ｇｕｓ￣Ｈ 片
段ꎬ通过 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 酶切位点进行融合ꎬ获得融合片
段 Ｔ０Ｔ１∷ｇｕｓ和(Ｔ１) ４∷ｇｕｓ(图 １￣Ｂ)ꎮ 以 Ｔ０Ｔ１￣Ｆ
和 ｇｕｓ￣Ｒ为引物ꎬ以 Ｔ０Ｔ１∷ｇｕｓ融合片段作为 ＰＣＲ
的模版ꎬ获得 ＰＣＲ 产物ꎬ克隆在 ｐＭＤ１８￣Ｔ ｓｉｍｐｌｅ
载体上ꎬ获得重组载体 Ｔ￣Ｔ０Ｔ１ｇｕｓꎻ以 Ｔ１￣Ｆ 和 ｇｕｓ￣
Ｒ为引物ꎬ以 Ｔ１４∷ｇｕｓ 融合片段作为 ＰＣＲ 的模
版ꎬ ＰＣＲ 产物克隆在 ｐＭＤ１８￣Ｔ ｓｉｍｐｌｅ 载体上ꎬ获
得 Ｔ￣Ｔ１４ｇｕｓꎮ Ｔ￣Ｔ０Ｔ１ ｇｕｓ 和 Ｔ￣Ｔ１４ｇｕｓ 包括转录
载体所需的基本元件(图 １￣Ｂ)ꎮ
１.４ 启动子探针载体的构建
利用 ｇｕｓ￣Ｆ 和 ｇｕｓ￣Ｒ 为引物ꎬ以 ｐＰＲＯＢＥ￣ＮＴ
的质粒 ＤＮＡ为模版ꎬＰＣＲ扩增出不含有 ＥｃｏＲ Ｉ和
Ｋｐｎ Ｉ位点的 ｇｕｓＡ基因片段ꎬ通过 Ｓｍａ Ｉ 和 Ｋｐｎ Ｉ
位点替换 Ｔ￣Ｔ０Ｔ１ ｇｕｓ 和 Ｔ￣Ｔ１４ｇｕｓ 载体上相应的
ｇｕｓＡ基因片段ꎬ获得新的转录表达元件载体
Ｔ￣Ｔ０Ｔ１ ｇｕｓ和 Ｔｓ￣Ｔ１４ｇｕｓꎮ 利用 ＥｃｏＲ Ｉ和 Ｋｐｎ Ｉ酶
切位点ꎬ将 Ｔｓ￣Ｔ０Ｔ１ｇｕｓ 和 Ｔｓ￣Ｔ１４ｇｕｓ 的转录元件
克隆在 ｐＵＦＲ０３４ 载体上ꎬ获得启动子探针载体
ｐＵＴＧ０１和 ｐＵＴＧ１４ꎮ
１.５ ＧＵＳ活性的测定
待测菌株单菌落接种于 ５ ｍＬ 含相应抗生素
的 ＮＢ液体ꎬ振荡培养至 ＯＤ６００>１.０ꎻ１０％转接至新
鲜的 ＮＢ培养液中ꎬ振荡培养至 ＯＤ６００约 １.５ꎬ收集
２ ｍＬ 菌液ꎬ１０ ０００ ｒ / ｍｉｎ离心 １ ｍｉｎꎬ去除培养液ꎬ
Ｔａｂｌｅ ２ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ５′￣３′ ( ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ)
Ｔ０Ｔ１￣Ｆ ＡＧＡＧＡＡＴＴＣＧＡＣＴＣＣＴＧＴＴＧＡＴＡＧＡＴＣＣＡＧ
Ｔ０Ｔ１－Ｒ ＡＧＴＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＧＡＴＴＴＧＴＣＣＴＡＣＴＣＡＧ
Ｔ１￣Ｆ ＡＣＴＧＡＡＴＴＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧ
Ｔ１￣Ｒ ＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＧＡＴＣＣＣＣＡＡＴＴＣＣＴＧ
ｇｕｓＮ￣Ｆ ＡＡＡＣＡＴＡＴＧＡＴＧＴＴＡＣＧＴＣＣＴＧＴＡＧＡＡＡＣ
ｇｕｓＮ￣Ｒ ＡＡＣＣＡＴＡＴＧＴＣＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴ
ｇｕｓ￣Ｆ ＡＴＡＣＣＣＧＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＡＣＴＡＡＡＧＡＴＴＡＡ
ｇｕｓ￣Ｒ ＡＡＣＧＧＴＡＣＣＴＣＡＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴ
ｈｒｐＦｐ￣Ｆ ＡＴＡＧＣＡＴＧＣＡＴＣＧＣＧＴＴＧＡＴＴＣＡＧＴＧＣ
ｈｒｐＦｐ￣Ｒ ＧＣＧＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣＣＡＴＣＧＴＣＧＡＴＧＧＣ
ｈｒｐＸｏｃ ｃｏｍ￣Ｆ ＡＧＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡＴＴＧ
ｈｒｐＸｏｃ ｃｏｍ￣Ｒ ＧＴＴＣＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡＴＣＡＴＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡ
６０５
５期 赵征慧ꎬ等:２个适于水稻条斑病菌致病相关基因转录表达分析的启动子探针载体的构建
Ｆｉｇ. １ Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ ｃａｓｓｅｔｔｅ
Ａ: Ｓｋｅｔｃｈ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ ｃａｓｓｅｔｔｅ. Ｔｈｅ ｇｒａｙ ｂｏｘｅｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ (Ｔｅｒ)ꎬ ｂｌａｃｋ ｌｉｎｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈｅ
ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ (ＭＣＳ)ꎬ ｔｈｅ ｇｒａｙ ｓｍａｌｌ ｃｉｒｃｌｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ (ＲＢＳ)ꎬ ｔｈｅ ｗｈｉｔｅ ａｒｒｏｗ
ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｌｅｓｓ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ (Ｒｅｐ ｇｅｎｅ)ꎻ Ｂ: Ｓｋｅｔｃｈ ｍａｐ ｏｆ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｏｆ Ｔ￣Ｔ０Ｔ１ｇｕｓ ａｎｄ
Ｔ￣Ｔ１４ｇｕｓ. Ｔ０ ａｎｄ Ｔ１ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｌａｍｂｄａ Ｔ０ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ａｎｄ Ｅ. ｃｏｌｉ ｒｒｎＢ Ｔ１ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒꎬ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｌｙꎻ
Ｃ: Ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐＵＣ１８ ｐｏｌｙｌｉｎｋｅｒ ｉｎ Ｔｓ￣Ｔ０Ｔ１ｇｕｓ ａｎｄ Ｔｓ￣Ｔ１４ｇｕｓ. Ｔｈｅ ＥｃｏＲ Ｉ ａｎｄ Ｋｐｎ Ｉ ｓｉｔｅｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｄｅｌｅｔｅｄꎻ
Ｄ: Ｔｈｅ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｓ￣Ｔ０Ｔ１ｇｕｓ ａｎｄ Ｔｓ￣Ｔ１４ｇｕｓ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ Ｈｉｎｄ ＩＩＩꎬ
ＥｃｏＲ Ｉ ａｎｄ Ｋｐｎ Ｉ. Ｍ: Ｔｈｅ λ￣ＥｃｏＴ１４Ｉ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ (ＴａＫａＲａ)ꎬ Ｌａｎｅ １: Ｔｓ￣Ｔ０Ｔ１ｇｕｓꎬ Ｌａｎｅ ２ : Ｔｓ￣Ｔ１４ｇｕｓ.
ｄｄＷ洗涤沉淀 １次后收集菌体ꎮ ５００ μＬ ＸＯＭ３悬
浮ꎬ调菌液 ＯＤ６００至 ０.３ꎬ 诱导培养 ４ ｈꎬ然后加 ５００
μＬ 的 ２ × ｓｏｎｉｃ ｂｕｆｆｅｒ ( ２０ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ、 １０
ｍｍｏｌ / Ｌ β￣巯基乙醇、 ５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＥＤＴＡ 和 １％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ￣１００)振荡混匀ꎻ液氮中反复冻融 ５ 次ꎬ以
完全裂解细胞ꎬ４℃１２ ０００ ｒ / ｍｉｎ 离心 １５ ｍｉｎꎻ 取
５ μＬ上清液加入 ４５ μＬ ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ(５０ ｍｍｏｌ / Ｌ
Ｎａ３ＰＯ４、１ ｍｍｏｌ / Ｌ ４￣ＭＵＧ、１０ ｍｍｏｌ / Ｌ β￣巯基乙
醇和 ０.１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ￣１００)ꎬ３７℃反应 １ ｈꎻ取 １０ μＬ
反应液加入 ９０ μＬ Ｎａ２ＣＯ３(０.２ ｍｏｌ / Ｌ)终止反应ꎬ
在荧光光度分析仪中测定吸光值ꎬ根据标准曲线公
式 Ｘ＝(测量值＋１６７０.５) / ４１４.７１ꎬＸ 为酶活性值ꎬ
计算出酶活性ꎬ单位为 Ｕ / ＯＤ６００ / ｈꎮ
２ 结果
２.１ 转录融合表达元件的构建
转录融合表达元件是进行基因表达和调控研
究最基本的工具[４]ꎬ主要包括转录终止子( ｔｅｒｍｉ￣
ｎａｔｏｒꎬ Ｔｅｒ)、多克隆位点 (ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅꎬ
ＭＣＳ)、核糖体结合位点 ( ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅꎬ
ＲＢＳ)和不含有启动子的报道基因 ( ｐｒｏｍｏｔｅｒｌｅｓｓ
ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅꎬ Ｒｅｐ ｇｅｎｅ)四部分(图 １￣Ａ)ꎬＲＢＳ 位
于起始密码子 ＡＴＧ 上游的序列ꎬ是核糖体 ＲＮＡ
识别和结合的位点ꎮ
本研究以 ｇｕｓＡ 为报道基因ꎬ与启动子探针载
体 ｐＰＲＯＢＥ￣ＡＴ[４]的多克隆位点融合ꎬ分别在多克
隆位点上游与 Ｔ０Ｔ１ 和 ４ 个拷贝的 Ｔ１ 终止子
(Ｔ１) ４连接ꎬ构建了 ２ 种类型的转录融合表达元
件ꎬ克隆在 ｐＭＤ１８￣Ｔ ｓｉｍｐｌｅ(ＴａＫａＲａ)载体上ꎬ获
得 ２ 种 ＴＡ 型启动子探针载体 Ｔ￣Ｔ０Ｔ１ｇｕｓ 和
Ｔ￣Ｔ１４ｇｕｓ(图 １￣Ｂ)ꎮ 为便于将转录融合表达元件
克隆在水稻黄单胞菌常用的 ｐＵＦＲ０３４ 载体上ꎬ去
除了多克隆位点中的 ＥｃｏＲ Ｉ 和 Ｋｐｎ Ｉ 位点ꎬ获得
重组的 ＴＡ 型启动子探针载体 Ｔｓ￣Ｔ０Ｔ１ｇｕｓ 和 Ｔｓ￣
Ｔ１４ｇｕｓꎬ多克隆位点如图 １￣Ｃ 所示ꎬ通过 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、
７０５
植物病理学报 ４４卷
ＥｃｏＲ Ｉ和 Ｋｐｎ Ｉ ３ 种限制性内切酶酶切验证ꎬ电泳
后ꎬＴｓ￣Ｔ０Ｔ１ｇｕｓ得到载体片段(２.７ ｋｂ)、ｇｕｓＡ 基因
片段(１.８ ｋｂ)和 Ｔ０Ｔ１ 终止子片段(０.３ ｋｂ)(图 １￣
Ｄꎬ Ｌａｎｅ１)ꎬＴｓ￣Ｔ１４ｇｕｓ得到载体片段(２.７ ｋｂ)、ｇｕ￣
ｓＡ基因片段(１.８ ｋｂ)和(Ｔ１) ４终止子片段(０.９ ｋｂ)
(图 １￣Ｄꎬ Ｌａｎｅ２)ꎬ证明这 ２种载体构建正确ꎮ
２.２ 终止子的功能验证
为了确定本研究中构建的终止子是否能够消
除 ｇｕｓＡ 基因旁侧启动子对其转录表达的影响ꎬ将
不含有终止子元件的 ｇｕｓＡ 基因构建在 ｐＭＤ１８￣Ｔ
ｓｉｍｐｌｅ 载体上ꎬ获得重组载体 Ｔ￣ｇｕｓꎮ 分别将
Ｔ￣Ｔ０Ｔ１ｇｕｓ、Ｔ￣Ｔ１４ｇｕｓ 和 Ｔ￣ｇｕｓ 的构建ꎬ转入不含
有 ＧＵＳ活性的大肠杆菌 ＥＣ１００Ｄ＋中ꎬ进行 ＧＵＳ活
性的定量测定ꎬ测定结果显示ꎬＴ￣ｇｕｓ 菌株具有较
高的 ＧＵＳ 活性ꎬ说明载体上的启动子( ｌａｃＺ)对
ｇｕｓＡ基因的表达有启动作用ꎬ含有终止子元件的菌
株 Ｔ￣Ｔ０Ｔ１ｇｕｓ、Ｔ￣Ｔ１４ｇｕｓ 和对照菌株 ＥＣ１００Ｄ＋一
样ꎬ仅有极微弱的 ＧＵＳ活性(图 ２)ꎬ表明终止子元
件 Ｔ０Ｔ１和 Ｔ１能够有效消除载体上 ｌａｃＺ启动子对
ｇｕｓ基因表达的影响ꎬ证明本研究构建策略可行ꎮ
Ｆｉｇ. ２ Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｄ￣ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣
ｔｉｏｎ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ ｔｈｅ ｇｕｓＡ ｇｅｎｅ ｉｎ
ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｂｙ ｔｈｅ Ｔ０Ｔ１
ａｎｄ (Ｔ１) ４ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｔｈｅ ｇｕｓＡ ｇｅｎｅ ｉｎ ＥＣ１００Ｄ＋ ｓｔｒａｉｎｓ
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｔ￣Ｔ０Ｔ１ｇｕｓꎬ Ｔ￣Ｔ０Ｔ１ｇｕｓ ａｎｄ Ｔ￣ｇｕｓ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ
ｂｙ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. ＥＣ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈｅ ＥＣ１００Ｄ＋ .
Ｓｉｍｉｌａｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｗｏ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｅｘｐｅｒｉ￣
ｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ.
２.３ 启动子探针载体 ｐＵＴＧ０１和 ｐＵＴＧ１４的构建
为了实现转录融合表达元件在稻黄单胞菌体
系中的应用ꎬ利用 ＥｃｏＲ Ｉ 和 Ｋｐｎ Ｉ 酶切位点ꎬ将
Ｔｓ￣Ｔ０Ｔ１ｇｕｓ和 Ｔｓ￣Ｔ１ｇｕｓ相应的转录表达元件克隆
在 ｐＵＦＲ０３４载体上ꎬ获得 Ｘｏｏ 和 Ｘｏｃ 通用的启动
子探针载体 ｐＵＴＧ０１ 和 ｐＵＴＧ１４ꎮ 将不含有 Ｔ０Ｔ１
终止子元件的 ｇｕｓＡ 基因克隆在 ｐＵＦＲ０３４ 载体上ꎬ
获得重组载体 ｐＵＦＲｇｕｓꎮ 将 ｐＵＴＧ０１ 和 ｐＵＦＲｇｕｓ
导入 Ｘｏｃ野生型菌株 ＲＳ１０５ 中ꎬＧＵＳ 活性定量测
定结果显示ꎬ含有 ｐＵＦＲｇｕｓ 的 Ｘｏｃ 菌株的 ＧＵＳ 活
性比含有 ｐＵＴＧ０１ 高(图 ３)ꎬ暗示在 ｐＵＦＲ０３４ 载
体上ꎬ其他具有启动子活性的片段会干扰 ｇｕｓＡ 基
因的表达ꎬ在 ｐＵＴＧ０１载体上ꎬＴ０Ｔ１终止子元件能
够有效消除其他启动子对 ｇｕｓＡ基因转录表达的影
响ꎮ
Ｆｉｇ. ３ Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｄ￣ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣
ｔｉｏｎ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ ｔｈｅ ｇｕｓＡ ｇｅｎｅ ｉｎ
ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ ｖｅｃｔｏｒ ｐＵＴＧ０１ ｂｙ ｔｈｅ
Ｔ０Ｔ１ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｔｈｅ ｇｕｓＡ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｘｏｃ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎｓ
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐＵＦＲｇｕｓ ａｎｄ ｐＵＴＧ０１ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ＧＵＳ
ａｃｔｉｖｉｔｙꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｓｉｍｉｌａｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ
ｔｗｏ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ.
Ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ｍｅａｎ ａｒｅ ａｎ ａｖｅｒａｇｅ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｒｅｅ
ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ ( ＳＤ) . Ａｓｔｅｒｉｓｋ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ
ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ
ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ＲＳ１０５ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐＵＦＲｇｕｓ ａｎｄ ｐＵＴＧ０１
(Ｐ < ０.０１ꎬ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ) .
８０５
５期 赵征慧ꎬ等:２个适于水稻条斑病菌致病相关基因转录表达分析的启动子探针载体的构建
２.４ 水稻黄单胞菌 ｈｒｐ基因转录表达体系的建立
选取 Ｘｏｃ 的 ｈｒｐＦ 启动子ꎬ构建在 ｐＵＴＧ０１ 的
多克隆位点上ꎬ获得重组构建 ｐＵＴＧ￣ｈｒｐＦꎬ同时将
不含有终止元件的 ｈｒｐＦ∷ｇｕｓＡ融合片段也构建在
ｐＵＦＲ０３４上ꎬ获得重组构建 ｐＵＦＧ￣ｈｒｐＦꎮ 在 ｈｒｐ 诱
导培养基 ＸＯＭ３中诱导表达 ４ ｈꎬＧＵＳ活性测定的
结果显示ꎬＸＯＭ３能够显著诱导 ｈｒｐＦ基因表达ꎬ不
含有终止子元件的 ｐＵＦＧ￣ｈｒｐＦ 构建中ꎬｈｒｐＦ 基因
的表达比在含有终止子元件的 ｐＵＴＧ￣ｈｒｐＦ 构建中
提高了 ５ 倍(图 ４￣Ａ)ꎬ这暗示在 ＸＯＭ３ 诱导条件
下ꎬ终止子元件能够有效消除外围启动子对 ｈｒｐＦ
基因的表达ꎮ
在植物病原黄单胞菌中ꎬｈｒｐ 调控子 ＨｒｐＸꎬ能
够特异性调控启动子区含有 ＰＩＰ￣ｂｏｘ (ｐｌａｎｔ ｉｎｄｕｃｉ￣
ｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｂｏｘ)的基因[１５]ꎮ ｈｒｐＦ 基因启动子区
含有完整的 ＰＩＰ￣ｂｏｘ 结构域[１６]ꎬ为了验证本研究
构建的启动子探针载体的有效性ꎬ将 ｐＵＴＧ￣ｈｒｐＦ
的构建导入 Ｘｏｃ 的 ｈｒｐＸ 突变体 ＲΔｈｒｐＸ 中ꎬＧＵＳ
活性定量测定的结果显示ꎬｈｒｐＦ 基因的 ＧＵＳ 活性
在 ｈｒｐＸ 突变体 ＲΔｈｒｐＸ 中显著下降(图 ４￣Ｂ)ꎬ同
时荧光定量 ＰＣＲ 的结果也显示ꎬ ｈｒｐＦ 基因的
ｍＲＮＡ在 ｈｒｐＸ 突变体也显著降低(图 ４￣Ｃ)ꎬ以上
证明 ＨｒｐＸ 正调控 ｈｒｐＦ 基因的表达ꎬ与已有的研
究结果一致ꎬ表明本研究中构建的启动子探针载体
在水稻黄单胞菌中可以有效利用ꎮ
２.５ 双质粒兼容共存的功能互补策略
在基因表达、调控和功能研究中ꎬ功能互补构
建是重要的遗传操作ꎬ为了同时在突变体菌株中实
现功能互补和基因表达水平的定量检测ꎬ本研究将
含有 ｈｒｐＸ 的功能片段ꎬ构建在广泛宿主( ｂｒｏａｄ￣
ｈｏｓｔ￣ｒａｎｇｅ ) 载 体 ｐＭＬ１２３ 上ꎬ 获 得 重 组 载 体
ｐＭＬ￣ｈｒｐＸｏｃꎬ将其构建导入含有 ｐＵＴＧ￣ｈｒｐＦ 质粒
的 ＲΔ ｈｒｐＸ中ꎬ在 ＮＡ＋Ｋｍ＋Ｇｍ的平板上能够筛选
到转化子ꎬ说明这 ２ 种质粒具有兼容性ꎬ能够在
Ｘｏｃ 菌株中共存ꎮ 在 ＸＯＭ３ 诱导培条件下ꎬＧＵＳ
活性定量测定结果显示ꎬｐＭＬ￣ｈｒｐＸｏｃ构建的导入ꎬ
能够恢复 ｈｒｐＦ 基因的 ＧＵＳ 活性ꎬ且 ＧＵＳ 活性较
野生型菌株增加了 ３倍(图 ５￣Ａ)ꎬ同时将互补菌株
注射接种于感病水稻 ＩＲ２４ 的叶片中ꎬ能够恢复
ｈｒｐＸ突变体的表型至野生型水平(图 ５￣Ｂ)ꎬ说明在
Ｘｏｃ菌株中导入 ２种质粒的策略可行ꎬ证明本研究
ｈｒｐ基因转录表达体系能够有效运行ꎬ为后续水稻
黄单胞菌 ｈｒｐ调控网络的解析提供了技术支持ꎮ
Ｆｉｇ. ４ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｒｐＦ ｉｎ ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ ＲＳ１０５ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｒｐＸ ｍｕｔａｎｔ ＲΔｈｒｐＸ ｉｎ ＸＯＭ３
Ａ: ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｒｐＦ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｔ１ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｉｎ ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ. Ａｓｔｅｒｉｓｋ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ＲＳ１０５ (ｈｒｐＦ::ｇｕｓ) ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｔ０ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ (Ｐ< ０.０１ꎬ
Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ). Ｂ: ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｒｐＦ ｉｎ ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｒｐＸ ｍｕｔａｎｔ ＲΔｈｒｐＸ ｉｎ ｈｒｐ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｍｅｄｉｕｍ
ＸＯＭ３. Ｃ: Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ ｈｒｐＦ ｍＲＮＡ ｉｎ ｔｈｅ ｈｒｐＸ ｍｕｔａｎｔ ＲΔｈｒｐＸ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｉｎ ｒｉｃｅ ｔｉｓｓｕｅ ｂｙ
ＲＴ￣ＰＣＲ. Ａｓｔｅｒｉｓｋ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ＲＳ１０５ ａｎｄ ｔｈｅ
ｈｒｐＸ ｍｕｔａｎｔ ＲΔｈｒｐＸ (Ｐ< ０.０１ꎬ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ).Ｓｉｍｉｌａｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｗｏ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ
ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ. Ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ｍｅａｎ ａｒｅ ａｎ ａｖｅｒａｇｅ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ (ＳＤ).
９０５
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. ５ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｒｐＸ ｍｕｔａｎｔ ｕｓｉｎｇ ａ ｔｗｏ￣ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｓｔｒａｔｅｇｙ
Ａ: Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｒｐＦ ｉｎ ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ ＲＳ１０５ꎬ ｔｈｅ ｈｒｐＸ ｍｕｔａｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｒｐＸ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ ＸＯＭ３. Ｔｒａｎ￣
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｔｈｅ ｇｕｓＡ ｇｅｎｅ ｉｎ ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ ＲＳ１０５ꎬ ｔｈｅ ｈｒｐＸ ｍｕｔａｎｔ ＲΔｈｒｐＸ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｒｐＸ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ
ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｓｉｍｉｌａｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｗｏ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｒｅｅ
ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ. Ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ｍｅａｎ ａｒｅ ａｎ ａｖｅｒａｇｅ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ (ＳＤ) . Ａｓｔｅｒｉｓｋ ｉｎｄｉ￣
ｃａｔｅｓ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ＲＳ１０５ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ
(Ｐ< ０.０１ꎬ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ) . Ｂ: Ｗａｔｅｒ ｓｏａｋｅｄ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｒｉｃｅ ｃｕｌｔｉｖａｒ ＩＲ２４ ａｆｔｅｒ
ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｒｐＸ ｍｕｔａｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｒｐＸ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｓｔｒａｉｎ.
３ 讨论
本研究利用 ｇｕｓＡ 为报道基因ꎬ构建了 ２ 个适
用于水稻黄单胞菌的启动子探针载体ꎬ将 Ｘｏｃ 的
ｈｒｐＦ 基 因 启 动 子 构 建 在 启 动 子 探 针 载 体
ｐＴ０Ｔ１ｇｕｓ上ꎬ能够验证 ｈｒｐＦ 基因的表达受 ＨｒｐＸ
正调控ꎬ通过双质粒兼容共存的策略ꎬ能够同时在
ｈｒｐＸ突变体中实现 ｈｒｐＸ 基因的功能互补和通过
ＧＵＳ活性定量测定其下游调控基因的转录表达ꎬ
建立了一套适用于 Ｘｏｃ的基因转录表达的体系ꎮ
解析基因转录表达和调控的机制ꎬ具有转录融
合元件的启动子探针载体是重要的遗传操作工
具[４]ꎬ稻黄单胞菌存在严格的限制性修饰系统ꎬ仅
限一些广泛宿主载体 (如 ｐＵＦＲ０３４、 ｐＨＭ１、
ｐＭＬ１２３、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ系列)能够成功导入ꎬ稳定复
制ꎬ且这些载体为克隆载体ꎬ不具备转录融合元
件[９~１２]ꎮ 启动子探针载体 ｐＰＲＯＢＥ￣ＡＴ 以 ｇｆｐ 为
报道基因ꎬ已在 Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ ３９３７ 成功应用于
ｈｒｐＬ、 ｈｒｐＳ 和 ｈｒｐＡ 的调控子筛选[１５ꎬ１７ꎬ１８]ꎬ 因
ｐＰＲＯＢＥ￣ＡＴ含有 Ｃｂ 抗性基因ꎬ而大多数 Ｘｏｃ 菌
株(如 ＲＳ１０５)携带 Ｃｂ 抗性基因ꎬ不能实现在 Ｘｏｃ
的应用ꎮ 本研究选取了具有 Ｋｍ 抗性基因的
ｐＰＲＯＢＥ￣ＮＴ载体[４]ꎻ该载体能够导入 Ｘｏｃ 中ꎬ但
是不能够稳定复制ꎬ在 ＸＯＭ３ 培养条件下ꎬ质粒容
易丢失(未公布资料)ꎮ 为了获得适用于 Ｘｏｃ 的启
动子探针载体ꎬ本研究分别将来自 ｐＵＣ１８Ｔ￣ｍｉｎｉ￣
Ｔｎ７Ｔ￣Ｇｍ载体的 Ｔ０Ｔ１ 终止子和来自 ｐＰＲＯＢＥ￣
ＮＴ的(Ｔ１) ４终止子与多克隆位点和 ｇｕｓＡ 报道基
因融合ꎬ构建了转录融合表达元件ꎬ将这个元件构
建在 ｐＵＦＲ０３４ 载体上ꎬ获得了启动子探针载体
ｐＴ０Ｔ１ｇｕｓ和 ｐＴ１４ｇｕｓꎬ这些载体保留了 ｐＵＦＲ０３４
载体的遗传特性ꎬ在稻黄单胞菌中能稳定复制ꎻ具
备了启动子探针载体必须的各要素ꎻ报道基因 ｇｕ￣
ｓＡ的表达能够定量测定ꎬ简化了操作程序ꎮ
启动子探针载体终止子元件的作用在于消除
报道基因上游区域造成的通读转录( ｒｅａｄ￣ｔｈｒｏｕｇｈ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ)影响[４]ꎮ 首先ꎬ将转录融合元件克
隆在 ＴＡ载体上ꎬ在没有 ＧＵＳ 活性背景的 Ｅ. ｃｏｌｉ
和 Ｘｏｃ菌株中ꎬ通过 ＧＵＳ活性的定量测定ꎬ观察到
Ｔ０Ｔ１和(Ｔ１) ４终止子能够有效消除载体上 ｌａｃＺ启
动子对下游 ｇｕｓＡ 基因的转录表达(图 ２)ꎻ将 Ｘｏｃ
的 ｈｒｐＦ启动子构建在 ｐＴ０Ｔ１ｇｕｓ载体上ꎬ导入 Ｘｏｃ
野生型中ꎬ在 ｈｒｐ 诱导条件下ꎬ也观察到 Ｔ０Ｔ１ 终
止子能够降低 ｈｒｐＦ 基因的背景表达ꎬ这些证据暗
示本研究构建的启动子探针载体策略正确ꎮ 将含
有 ｈｒｐＦ启动子的探针载体导入 ｈｒｐＸ 突变体 ＲΔ
ｈｒｐＸ中ꎬＧＵＳ活性测定结果显示ꎬｈｒｐＦ 基因的表达
在 ＲΔｈｒｐＸ中显著减低ꎬ验证了 ｈｒｐＦ受 ＨｒｐＸ正调
控ꎬ证明该载体可有效实现基因的转录表达ꎮ 另
外ꎬ双质粒兼容共存的策略能够实现基因的功能互
０１５
５期 赵征慧ꎬ等:２个适于水稻条斑病菌致病相关基因转录表达分析的启动子探针载体的构建
补和通过 ＧＵＳ 活性定量测定目的基因的转录表
达ꎬ为后续解析毒性相关基因调控网络的机制提供
了简便和有效的技术方法ꎮ
在选择合适的启动子探针载体时ꎬ报道基因的
敏感性也是一个主要的考虑因素ꎬ需要杜绝宿主菌
株的背景表达造成报道基因的检测干扰[４]ꎮ 如
Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ ３９３７ 含有 ｌａｃＺ 基因ꎬ不能以其作
为报道基因ꎻ稻黄单胞菌胞外的黄色素容易干扰
ＧＦＰ荧光定量测定(未发表资料)ꎮ 载体的拷贝数
会影响报道基因的检测结果ꎬ如载体为低拷贝时ꎬ
微弱的待测启动子可能造成报道基因的表达落在
能够定量检测的水平以下[４]ꎮ
随着毒性功能基因的挖掘ꎬ毒性调控因子的筛
选在绘制整个毒性调控网络中起重要的作用ꎮ 在
本研究的基础上ꎬ利用构建的启动子探针载体ꎬ构
建融合表达体系ꎬ在 Ｘｏｏ 菌株中成功筛选到多个
ｈｒｐ调控子(另文发表)ꎬ为后续毒性调控网络的解
析ꎬ提供了新的基因资源ꎮ
参考文献
[１] Ｎｉｎｏ￣Ｌｉｕ Ｄ Ｏꎬ Ｒｏｎａｌｄ Ｐ Ｃꎬ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ Ａ Ｊ.
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐａｔｈｏｖａｒｓ: ｍｏｄｅｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｏｆ ａ
ｍｏｄｅｌ ｃｒｏｐ [ Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００６ꎬ ７
(５):３０３－３２４.
[２] Ｂｕｔｔｎｅｒ Ｄꎬ Ｂｏｎａｓ Ｕ. Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ ｓ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ [ Ｊ ] . ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏ￣
ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓꎬ ２０１０ꎬ ３４ (２):１０７－１３３.
[３] Ｍｏｌｅ Ｂ Ｍꎬ Ｂａｌｔｒｕｓ Ｄ Ａꎬ Ｄａｎｇｌ Ｊ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｇｌｏｂａｌ
ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｉｎ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅ￣
ｒｉａ [Ｊ] . Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００７ꎬ １５ (８):３６３－
３７１.
[４] Ｍｉｌｌｅｒ Ｗ Ｇꎬ Ｌｅｖｅａｕ Ｊ Ｈꎬ Ｌｉｎｄｏｗ Ｓ Ｅ. Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｇｆｐ
ａｎｄ ｉｎａＺ ｂｒｏａｄ￣ｈｏｓｔ￣ｒａｎｇｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ￣ｐｒｏｂｅ ｖｅｃｔｏｒｓ [Ｊ] .
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ ２０００ꎬ １３ (１１):
１２４３－１２５０.
[５] Ｓｉｍｏｎ Ｒꎬ Ｑｕａｎｄｔ Ｊꎬ Ｋｌｉｐｐ Ｗ. Ｎｅｗ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓ￣
ｐｏｓｏｎ Ｔｎ５ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃｏｎｓꎬ ｇｅｎｅ￣
ｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｐｅｒｏｎ ｆｕｓｉｏｎｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｇｒａｍ￣
ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ [Ｊ] . Ｇｅｎｅꎬ １９８９ꎬ ８０ (１):１６１－１６９.
[６] Ｓｉｍｏｎｓ Ｒ Ｗꎬ Ｈｏｕｍａｎ Ｆꎬ Ｋｌｅｃｋｎｅｒ Ｎ. Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｉｎｇｌｅ
ａｎｄ ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ ｌａｃ￣ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ
ｏｐｅｒｏｎ ｆｕｓｉｏｎｓ [Ｊ] . Ｇｅｎｅꎬ １９８７ꎬ ５３ (１):８５－９６.
[７] Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ａ Ｍꎬ Ｌｏｎｇ Ｓ Ｒꎬ Ｂｒｏｗｎ Ｓ Ｅꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｏｎ￣
ｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂｒｏａｄ ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ ｃｏｓｍｉｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ
ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｕｔａｎｔｓ
[Ｊ] . Ｇｅｎｅꎬ １９８２ꎬ １８ (３):２８９－２９６.
[８] Ｄａｎｉｅｌｓ Ｍ Ｊꎬ Ｂａｒｂｅｒ Ｃ Ｅꎬ Ｔｕｒｎｅｒ Ｐ Ｃꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｌｏｎｉｎｇ
ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｂｒｏａｄ ｈｏｓｔ ｒａｎｇｅ
ｃｏｓｍｉｄ ｐＬＡＦＲ１ [ Ｊ] . Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌꎬ １９８４ꎬ ３
(１３):３３２３－３３２８.
[９] ＤｅＦｅｙｔｅｒ Ｒꎬ Ｋａｄｏ Ｃ Ｉꎬ Ｇａｂｒｉｅｌ Ｄ Ｗ. Ｓｍａｌｌꎬ ｓｔａｂｌｅ
ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ [ Ｊ] . Ｇｅｎｅꎬ
１９９０ꎬ ８８ (１):６５－７２.
[１０] Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｃ Ｍꎬ Ｗｈｉｔｅ Ｆ Ｆꎬ Ｃｈｏｉ Ｓ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ￣
ｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ａｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ [ Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅ￣
ｒａｃｔｉｏｎｓꎬ １９９２ꎬ ５ (６):４５１－４５９.
[１１] Ｌａｂｅｓ Ｍꎬ Ｐｕｈｌｅｒ Ａꎬ Ｓｉｍｏｎ Ｒ. Ａ ｎｅｗ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ
ＲＳＦ１０１０￣ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｌａｃ￣ｆｕｓｉｏｎ ｂｒｏａｄ￣ｈｏｓｔ￣
ｒａｎｇｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｒａｍ￣ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ [ Ｊ] . Ｇｅｎｅꎬ
１９９０ꎬ ８９ (１):３７－４６.
[１２] Ｋｏｖａｃｈ Ｍ Ｅꎬ Ｅｌｚｅｒ Ｐ Ｈꎬ Ｈｉｌｌ Ｄ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｆｏｕｒ ｎｅｗ
ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒｏａｄ￣ｈｏｓｔ￣ｒａｎｇｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ
ｐＢＢＲ１ＭＣＳꎬ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｃａｓｓｅｔｔｅｓ [Ｊ] . Ｇｅｎｅꎬ １９９５ꎬ １６６ (１):１７５－１７６.
[１３] Ｌｉ Ｙ Ｒꎬ Ｃｈｅ Ｙ Ｚꎬ Ｚｏｕ Ｈ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｈｐａ２ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｂｙ
ＨｒｐＦ ｔｏ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ
ａｃｔｉｖａｔｏｒ￣ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｉｎｔｏ ｒｉｃｅ ｆｏｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ[ Ｊ] .
Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２０１１ꎬ ７７
(１１):３８０９－３８１８.
[１４] Ｃｈｏｉ Ｋ Ｈꎬ Ｇａｙｎｏｒ Ｊ Ｂꎬ Ｗｈｉｔｅ Ｋ Ｇꎬ ｅｔ ａｌ. Ａ Ｔｎ７￣
ｂａｓｅｄ ｂｒｏａｄ￣ｒａｎｇｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓ￣
ｔｅｍ [Ｊ] . Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓꎬ ２００５ꎬ ２ (６):４４３－４４８.
[１５] Ｆｕｒｕｔａｎｉ Ａꎬ Ｎａｋａｙａｍａ Ｔꎬ Ｏｃｈｉａｉ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ￣
ｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ＨｒｐＸｏ ｒｅｇｕｌｏｎｓ ｐｒｅｃｅｄｅｄ ｂｙ ｔｗｏ
ｃｉｓ￣ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓꎬ ａ ｐｌａｎｔ￣ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｂｏｘ ａｎｄ
ａ￣１０ ｂｏｘ￣ｌｉｋｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅꎬ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ [Ｊ] . ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ￣
ｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓꎬ ２００６ꎬ ２５９ (１):１３３－１４１.
[１６] Ｚｏｕ Ｌ Ｆꎬ Ｗａｎｇ Ｘ Ｐꎬ Ｘｉａｎｇ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ｈｒｐ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａ
ｔｈａｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｎｏｎｈｏｓｔ
ｔｏｂａｃｃｏ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｈｏｓｔ ｒｉｃｅ [ Ｊ] .
Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００６ꎬ ７２
(９):６２１２－６２２４.
[１７] Ｚｏｕ Ｌꎬ Ｚｅｎｇ Ｑꎬ Ｌｉｎ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ. ＳｌｙＡ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｙｐｅ ＩＩＩ
ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ( Ｔ３ＳＳ) ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｐａｒａｌｌｅｌ ｗｉｔｈ ｔｈｅ
Ｔ３ＳＳ ｍａｓｔｅｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ＨｒｐＬ ｉｎ Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ ３９３７
[Ｊ] . Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２０１２ꎬ
７８ (８):２８８８－２８９５.
[１８] Ｚｅｎｇ Ｑꎬ Ｉｂｅｋｗｅ Ａ Ｍꎬ Ｂｉｄｄｌｅ Ｅꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ
ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｅｘｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＰＮＰａｓｅ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ
ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｏｎ Ｔ３ＳＳ ｏｆ Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ [ Ｊ ] .
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ. ２０１０ꎬ ２３ (１０):
１３４５－１３５５.
责任编辑:于金枝
１１５