全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４４(４): ４０５￣４１３(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣１０￣０６ꎻ 修回日期: ２０１４￣０３￣１４
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(３１００００７１)ꎻ 第 ４３批“留学回国人员科研启动基金”项目
通讯作者: 邹丽芳ꎬ副教授ꎬ主要从事分子植物病理学研究ꎻ Ｔｅｌ: ０２１￣３４２０５８７３ꎬ Ｆａｘ: ０２１￣３４２０５８７３ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｚｏｕｌｉｆａｎｇ２０２０１８＠ｓｊｔｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
第一作者: 熊 鹂ꎬ 女ꎬ 江苏苏州人ꎬ 硕士研究生ꎬ 主要从事分子植物病理学研究ꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０４.００９
ｈｒｐ基因关键调控因子 ＨｒｐＧ在水稻白叶枯病菌和
条斑病菌中的交叉互补性研究
熊 鹂ꎬ 刘之洋ꎬ 邹华松ꎬ 邹丽芳∗ꎬ 陈功友
(上海交通大学农业与生物学院ꎬ上海 ２００２４０)
摘要:水稻白叶枯病菌(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅꎬ Ｘｏｏ)和条斑病菌(Ｘ. ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａꎬ Ｘｏｃ)在非寄主烟草上产生过
敏反应(ＨＲ)和在寄主水稻上具有致病性ꎬ是由 ｈｒｐ致病岛决定的ꎬ其中 ＨｒｐＧ为关键调控因子ꎮ Ｘｏｏ和 Ｘｏｃ侵染水稻途径和
在水稻上产生病害症状的不同ꎬ是否与 ｈｒｐＧ基因有关ꎬ还不清楚ꎮ 本研究利用反向遗传学方法获得了 Ｘｏｏ和 Ｘｏｃ的 ｈｒｐＧ突
变体 ＰΔｈｒｐＧ和 ＲΔｈｒｐＧꎬ并用 ｈｒｐＧＸｏｏ基因和 ｈｒｐＧＸｏｃ基因分别互补上述 ２个突变体ꎬ获得了相应的互补菌株ꎮ 致病性测定结
果显示ꎬＰΔｈｒｐＧ和 ＲΔｈｒｐＧ突变体丧失了在水稻上的致病性和在非寄主烟草上产生 ＨＲ的能力ꎬ而 ｈｒｐＧＸｏｏ基因和 ｈｒｐＧＸｏｃ基
因可分别互补上述突变体至野生型水平ꎮ 利用 ＧＵＳ报告基因检测基因启动子活性发现ꎬｈｒｐＧＸｏｏ和 ｈｒｐＧＸｏｃ的启动子活性没有
显著差别ꎻＲＴ－ＰＣＲ和 Ｗｅｓｔｅｒｎ 杂交结果显示ꎬｈｒｐＧ 基因交叉互补菌株中 ＨｒｐＧ 调控的下游基因 ｈｒｐＸ、ｈｐａＲ、ｈｒｃＴ、ｈｐａ２ 和
ｈｒｐＤ６的表达没有差异ꎬ且 ＩＩＩ型分泌系统分泌蛋白 Ｈｐａ２的分泌性没有受到影响ꎮ 这些结果表明ꎬ稻黄单胞菌 ｈｒｐＧ基因可在
Ｘｏｏ和 Ｘｏｃ中交叉互置ꎬ位于其上游和下游的调控途径可能相似ꎬ而决定 Ｘｏｏ和 Ｘｏｃ在水稻上的侵染途径以及所致病害症状
差异可能与 ｈｒｐＧ基因位点无关ꎮ
关键词:水稻白叶枯病菌ꎻ 水稻条斑病菌ꎻ ｈｒｐＧ基因ꎻ 功能互补ꎻ 致病性
ＨｒｐＧꎬ ａ ｍａｊｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｈｒｐ ｇｅｎｅｓꎬ ｉｓ ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅａｂｌｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ ａｎｄ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａ ＸＩＯＮＧ Ｌｉꎬ ＬＩＵ Ｚｈｉ￣ｙａｎｇꎬ ＺＯＵ Ｈｕａ￣ｓｏｎｇꎬ ＺＯＵ Ｌｉ￣ｆａｎｇꎬ
ＣＨＥＮ Ｇｏｎｇ￣ｙｏｕ (Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏ Ｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２４０ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｏｎ ｎｏｎｈｏｓｔ ｔｏｂａｃｃｏ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｎ ｈｏｓｔ ｒｉｃｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ.
ｏｒｙｚａｅ (Ｘｏｏ) ａｎｄ Ｘ. ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａ (Ｘｏｃ) ａｒｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｈｒｐ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｓｌａｎｄꎬ ｉｎ ｗｈｉｃｈ ＨｒｐＧ ｉｓ ａ
ｍａｊｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ. Ｉｔ ｉｓ ｓｔｉｌｌ ｕｎｃｌｅａｒ ｔｈａｔ ｗｈｅｔｈｅｒ ｔｈｅ ｈｒｐＧ ｇｅｎｅ ｉｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ａｎｄ
ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｘｏｏ ａｎｄ Ｘｏｃ ｏｎ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｌｅａｆ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ｗｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ Ｘｏｏ ｈｒｐＧ ｍｕｔａｎｔ ＰΔｈｒｐＧ ａｎｄ
Ｘｏｃ ｈｒｐＧ ｍｕｔａｎｔ ＲΔｈｒｐＧ ｂｙ ａ ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ＰΔｈｒｐＧ ａｎｄ
ＲΔｈｒｐＧ ｂｙ ｈｒｐＧＸｏｏ ａｎｄ ｈｒｐＧＸｏｃꎬ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ
ｏｂｖｉｏｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｈｒｐＧＸｏｏ ａｎｄ ｈｒｐＧＸｏｃ ｇｅｎｅｓ. Ｔｈｅ ＲＴ￣ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ
ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ｈｒｐＸꎬ ｈｐａＲꎬ ｈｒｃＴꎬ ｈｐａ２ ａｎｄ ｈｒｐＤ６ꎬ ｔｈｅ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｈｒｐＧ ｉｎ ｔｈｅ ｈｒｐＧ ｃｒｏｓｓ￣ｃｏｍ￣
ｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｓｔｒａｉｎｓꎬ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｃｈａｎｇｅｄ ｗｈｅｎ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅｉｒ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎｓ. Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎꎬ ｔｈｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｓ￣
ｓａｙ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｐａ２ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ｎｏｔ ａｆｆｅｃｔｅｄ. Ｔｈｅｓｅ ｅｖｉｄｅｎｃｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ
ｔｈａｔ ｔｈｅ ｈｒｐＧ ｇｅｎｅｓ ａｒｅ ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅａｂｌｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｘｏｏ ａｎｄ Ｘｏｃꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｒ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐａｔｈ￣
ｗａｙ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｓｉｍｉｌａｒ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｔｈｅ ｈｒｐＧ ｇｅｎｅ ｉｓｎ’ｔ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ａｎｄ
ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｉｎ ｒｉｃｅ ｌｅａｆ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｘｏｏ ａｎｄ Ｘｏｃ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅꎻ Ｘ. ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａꎻ ｈｒｐＧ ｇｅｎｅꎻ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔꎻ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ
中图分类号: Ｓ４３５ １１１ ４７ꎻ Ｓ４３５ １１１ ４９ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０４￣０４０５￣０９
植物病理学报 ４４卷
水稻白叶枯病菌 Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ.
ｏｒｙｚａｅ (Ｘｏｏ)和条斑病菌(Ｘ. ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａꎬ
Ｘｏｃ) 是水稻上的 ２个模式病原菌[１]ꎮ Ｘｏｏ 从水稻
叶尖和叶缘的水孔以及伤口进入水稻组织内ꎬ侵染
维管组织ꎬ形成叶枯症状[１]ꎻＸｏｃ 从叶片气孔或伤
口侵入ꎬ定殖于薄壁细胞间ꎬ沿叶脉上下扩展ꎬ形成
狭长的条斑形症状[１]ꎮ 这种侵入途径和在水稻上
所产生的症状学差异ꎬ一般认为是病原菌中组织特
异性的基因产物所决定的ꎮ 例如ꎬＸｏｃ 具有胞外蛋
白水解酶活性ꎬ而 Ｘｏｏ 则不具备这种活性[２]ꎮ 然
而ꎬ有关这种组织特异性的差异机制仍知之甚少ꎮ
Ｘｏｏ和 Ｘｏｃ均为革兰氏阴性植物病原细菌ꎬ在
非寄主烟草上产生过敏反应 ( ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅ￣
ｓｐｏｎｓｅꎬ ＨＲ)和在水稻上具有致病性(ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉ￣
ｔｙ)ꎬ是由Ⅲ型分泌系统分泌( ｔｙｐｅ￣ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓ￣
ｔｅｍꎬ Ｔ３ＳＳ)的效应蛋白(Ｔ３ＳＳ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓꎬ Ｔ３ＳＥｓ)
决定的ꎻ而 Ｔ３ＳＳ的结构蛋白是由 ｈｒｐ 致病岛中的
某些 ｈｒｐ基因编码的ꎬ如 ９个 ｈｒｃ基因以及 ｈｒｐＥ和
ｈｒｐＦ决定的[３]ꎮ 大部分 ｈｒｃ基因的表达受到 ｈｒｐＧ
和 ｈｒｐＸ ２个关键基因的调控[３]ꎮ ｈｐａ２的表达不受
ＨｒｐＸ调控ꎬ受 ＨｒｐＧ 调控ꎬＨｐａ２ 蛋白还是 ＨｒｐＦ 转
位装置的互作因子ꎬ可通过 Ｔ３ＳＳ 分泌[４]ꎮ ＨｒｐＧ
属于双组分信号传导系统( ｔｗｏ￣ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｓｉｇｎａｌ
ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍꎬ ＴＣＳＴｓ)ＯｍｐＲ 家族的感应调
控因子ꎬＨｒｐＧ调控 ＨｒｐＸ[５]ꎮ ＨｒｐＸ是 ＡｒａＣ类的转
录激活子ꎬ调控 ｈｒｐ 基因的表达[６]ꎮ ＨｒｐＸ 可在白叶
枯病菌和野油菜黄单胞菌(Ｘ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃａｍｐｅｓ￣
ｔｒｉｓ)中交叉互补致病性[７]ꎬ并且也可在 Ｘｏｏ 和 Ｘｏｃ
中交叉互补致病性[８]ꎬ但未见 ＨｒｐＧ 在植物病原
黄单胞菌不同种或致病变种中交叉互补的报道ꎮ
为了揭示 Ｘｏｏ 和 Ｘｏｃ 侵染水稻组织的特异性
是否与 ｈｒｐ 基因有关ꎬ本研究通过反向遗传学途
径ꎬ对 ｈｒｐＧ基因位点以及其调控基因的表达水平
和 Ｔ３ＳＳ的分泌进行了比较研究ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 菌株和质粒
所用菌株和质粒见表 ｌꎮ 大肠杆菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ
Ｓｔｒａｉｎ ｏｒ ｐｌａｓｍｉｄ Ｒｅｌｅｖａｎｔ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Ｓｏｕｒｃｅ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＤＨ５α Φ９０ꎬ Ｌａｃ ＺꎬΔＭ１５ꎬ ｒｅｃＡ１ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
Ｘ. ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ
ＰＸＯ９９Ａ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅꎬ Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅ ｒａｃｅ ６ [９]
ＰΔｈｒｐＧ ｔｈｅ ｈｒｐＧ ｉｎｓｅｒｔ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＰＸＯ９９Ａꎻ Ｋｍｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＣＰΔｈｒｐＧＸｏｏ Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｐΔｈｒｐＧ ｗｉｔｈ ｐＨＭ１ｈｒｐＧＸｏｏꎻ Ｋｍｒꎬ Ｓｐｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＣＰΔｈｒｐＧＸｏｃ Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｐΔｈｒｐＧ ｗｉｔｈ ｐＨＭ１ｈｒｐＧＸｏｃꎻ Ｋｍｒꎬ Ｓｐｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｘ. ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａ
ＲＳ１０５ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｒａｃｅ ２ꎻ Ｒｉｆ ｒ ꎬ Ｔｈｉｓ ｌａｂ
ＲΔｈｒｐＧ ｔｈｅ ｈｒｐＧ ｉｎｓｅｒｔ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＲＳ１０５ꎻ Ｋｍｒꎬ Ｒｉｆ ｒ ꎬ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＣＲΔｈｒｐＧＸｏｃ Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ＲΔｈｒｐＧ ｗｉｔｈ ｐＨＭ１ｈｒｐＧＸｏｃꎻ Ｋｍｒꎬ Ｓｐｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＣＲΔｈｒｐＧＸｏｏ Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ＲΔｈｒｐＧ ｗｉｔｈ ｐＨＭ１ｈｒｐＧＸｏｏꎻ Ｋｍｒꎬ Ｓｐｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｐｌａｓｍｉｄｓ
ｐＮＧ Ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ ｖｅｃｔｏｒꎬ ｇｕｓＡꎻ Ｋｍｒ Ｔｈｉｓ ｌａｂ
ｐＨＭ１ ＩｎｃＷꎬ ｍｏｂꎬ ＬａｃＩＰ＋ꎬ ＰＫ２ ｒｅｐｌｉｃｏｎꎬ ｃｏｓｍｉｄꎻ Ｓｐｒ [９]
ｐＫ１８ｍｏｂＧＩＩ ｐＵＣ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅꎬ ｐＵＣ１８ ｐｏｌｙｌｉｎｋｅｒꎬ ｍｏｂꎬ ｏｒｉＶꎻ Ｋｍｒ Ｔｈｉｓ ｌａｂ
ｐＫ１８ｍｏｂｈｒｐＧＸｏｏ Ｐａｒｔｉａｌ ｈｒｐＧＸｏｏ ｆｒａｇｅｍｅｎｔ ｌｉｇａｔｅｄ ｉｎ ｐＫ１８ｍｏｂＧＩＩ ｆｏｒ ｉｎｓｅｒｔ ｍｕｔａｔꎻ Ｋｍｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＫ１８ｍｏｂｈｒｐＧＸｏｃ Ｐａｒｔｉａｌ ｈｒｐＧＸｏｃ ｆｒａｇｅｍｅｎｔ ｌｉｇａｔｅｄ ｉｎ ｐＫ１８ｍｏｂＧＩＩ ｆｏｒ ｉｎｓｅｒｔ ｍｕｔａｔꎻ Ｋｍｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＨＭ１ｈｒｐＧＸｏｏ Ｔｈｅ ｈｒｐＧＸｏｏｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｉｇａｔｅｄ ｉｎ ｐＨＭ１ꎻ Ｓｐｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＨＭ１ｈｒｐＧＸｏｃ Ｔｈｅ ｈｒｐＧＸｏｃｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｉｇａｔｅｄ ｉｎ ｐＨＭ１ꎻ Ｓｐｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＮＧ￣ｈｒｐＧＸｏｏ Ｔｈｅ ｈｒｐＧＸｏｏ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｉｇａｔｅｄ ｉｎ ｐＮＧꎻ Ｋｍｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＮＧ￣ｈｒｐＧＸｏｃ Ｔｈｅ ｈｒｐＧＸｏｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｉｇａｔｅｄ ｉｎ ｐＮＧꎻ Ｋｍｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＨＭ１ｈｐａ２ｍｙｃ Ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｈｐａ２::ｃＭｙｃ ｌｉｇａｔｅｄ ｉｎ ｐＨＭ１ꎻ Ｓｐｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
６０４
４期 熊 鹂ꎬ等:ｈｒｐ基因关键调控因子 ＨｒｐＧ在水稻白叶枯病菌和条斑病菌中的交叉互补性研究
ｃｏｌｉ)在 ＬＢ 培养基中 ３７°Ｃ 培养ꎬＸｏｏ 和 Ｘｏｃ 在丰
富培养基 ＮＢ (Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ)和 ＮＡ (Ｎｕｔｒｉｅｎｔ
Ａｇａｒ)中 ２８°Ｃ培养ꎮ 培养基中相应的抗生素种类
及浓度为:壮观霉素 ( ＳｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎꎬＳｐ) ５０ μｇ /
ｍＬ、卡那霉素(ＫａｎａｍｙｃｉｎꎬＫｍ)２０ μｇ / ｍＬ、利福平
(ＲｉｆａｍｐｉｃｉｎꎬＲｉｆ)７５ μｇ / ｍＬꎮ
１.２ 引物设计与合成
根据 ＮＣＢＩ 上登录的 Ｘｏｏ ＰＸＯ９９Ａ(ＧｅｎＢａｎｋ:
ＣＰ０００９６７.１)和 Ｘｏｃ ＲＳ１０５(ＧｅｎＢａｎｋ: ＡＦ２７２８８６.
１)的 ｈｒｐＧ 序列设计突变体、启动子、功能互补构
建的引物ꎬ所有引物的合成均在生工生物工程(上
海)有限公司进行ꎮ 引物序列见表 ２ꎮ
１.３ ｈｒｐＧ突变体及功能互补子的构建
以 ｈｒｐＧ￣Ｆ和 ｈｒｐＧ￣Ｒ 为引物ꎬ分别以 ＰＸＯ９９Ａ
和 ＲＳ１０５的基因组 ＤＮＡ 为模版ꎬＰＣＲ 扩增出 ４１８
ｂｐ的条带ꎬ通过 ＢａｍＨ Ｉ和 Ｓａｌ Ｉ酶切位点ꎬ连接在
ｐＫ１８ｍｏｂＧＩＩ 载 体 上ꎬ 获 得 重 组 的 克 隆
ｐＫ１８ｍｏｂｈｒｐＧＸｏｏ和 ｐＫ１８ｍｏｂｈｒｐＧＸｏｃꎮ 提取重组克
隆的质粒ꎬ电转化导入 ＰＸＯ９９Ａ和 ＲＳ１０５ 的感受态
细胞中ꎬ在 ＮＡ ＋ Ｋｍ 的平板上筛选到转化子ꎬ
经过 ＰＣＲ验证获得正确的插入突变体(图 １)ꎬ分别
命名为 ＰΔｈｒｐＧ 和 ＲΔｈｒｐＧꎮ 以 ｈｒｐＧｐ￣Ｆ 和 ｈｒｐＧ
ｃｏｍ￣Ｒ为引物ꎬ分别以 ＰＸＯ９９Ａ和 ＲＳ１０５ 的基因
组 ＤＮＡ为模版ꎬ ＰＣＲ 扩增出 １ ３００ ｂｐ 的条带ꎬ
通过 Ｋｐｎ Ｉ和 Ｓａｌ Ｉ 酶切位点ꎬ连在 ｐＨＭ１ 载体上ꎬ
获得重组克隆 ｐＨＭｈｒｐＧＸｏｏ和 ｐＨＭｈｒｐＧＸｏｃꎬ分别电
转化进入 ＰΔｈｒｐＧ和ＲΔｈｒｐＧ 中ꎬ获得功能互补
子 ＣＰΔ ｈｒｐＧＸｏｏ和ＣＲΔｈｒｐＧＸｏｃ与交叉功能互补子
ＣＰΔｈｒｐＧＸｏｃ和ＣＲΔｈｒｐＧＸｏｏꎮ
１.４ 启动子构建以及 ＧＵＳ活性测定
通过 ｈｒｐＧｐ￣Ｆ 和 ｈｒｐＧｐ￣Ｒ 引物ꎬ以 ＰＸＯ９９Ａ
和 ＲＳ１０５的基因组 ＤＮＡ 为模版ꎬ获得 ｈｒｐＧＸｏｏ
和 ｈｒｐＧＸｏｃ的 ４９０ ｂｐ启动子片段ꎬ该片段通过 Ｋｐｎ
Ｉ和 Ｓａｌ Ｉ 酶切后ꎬ连接在 ｐＮＧ 载体上ꎬ获得重
组质粒ｐＮＧ￣ｈｒｐＧＸｏｏ和 ｐＮＧ￣ｈｒｐＧＸｏｃꎬ分别将重组质
粒电转化导入 ＰＸＯ９９Ａ和 ＲＳ１０５的感受态细胞中ꎬ
获得重组子 ＰＸＯ９９Ａ ( ｐＮＧ￣ｈｒｐＧＸｏｏ )、 ＰＸＯ９９Ａ
( ｐＮＧ￣ｈｒｐＧＸｏｃ)、 ＲＳ１０５ ( ｐＮＧ￣ｈｒｐＧＸｏｏ ) 和 ＲＳ１０５
(ｐＮＧ￣ｈｒｐＧＸｏｃ)ꎮ
Ｔａｂｌｅ ２ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ５′－３′
ｈｒｐＧ￣Ｆ ＴＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＣＡＴＣＣＣＴＴＧＣＣＣ
ｈｒｐＧ￣Ｒ ＴＣＴＧＴＣＧＡＣＧＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＧＣＣＡＣＣ
ｈｒｐＧｐ￣Ｆ ＴＡＡＧＧＴＡＣＣＧＡＣＡＡＣＧＴＣＴＧＣＧＡＡＣＧ
ｈｒｐＧｐ￣Ｒ ＴＣＴＧＴＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧＴＧＣＡＡＧＧＧＧＧＣＡＡ
ｈｒｐＧ ｃｏｍ￣Ｒ ＴＣＴＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＣＡＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＣＧＡ
ｈｒｐＸ￣Ｆ ＡＡＧＡＡＧＡＧＧＣＣＧＡＡＧＡＣＧＣＧＴＡ
ｈｒｐＸ￣Ｒ ＧＧＣＧＧＡＡＡＴＡＴＣＧＴＣＧＧＡＧＡ
ｈｐａＲ￣Ｆ ＡＡＧＣＡＣＡＣＡＣＧＧＧＡＧＣＧＣＧＡＡＡＡＧＧ
ｈｐａＲ￣Ｒ ＣＣＧＧＴＧＣＣＡＡＧＡＴＡＡＧＣＡＡＧＴＣＧＴＣ
ｈｒｃＴ￣Ｆ ＣＴＡＣＧＴＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＴＴＣＡＴＣＧ
ｈｒｃＴ￣Ｒ ＧＧＧＴＴＧＧＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＡＴＴＧＴＴＧ
ｈｐａ２￣Ｆ ＡＧＣＡＧＡＡＴＣＧＡＡＴＧＡＡＴＧＧＣＡＴＧＣＧ
ｈｐａ２￣Ｒ ＣＧＴＧＣＧＴＣＡＧＴＧＴＧＴＡＴＧＴＡＧＣＡＧＣ
ｈｒｐＤ６￣Ｆ ＴＧＡＧＣＡＡＧＡＴＴＣＴＡＣＡＧＡＣＣＡＡＧＧＣ
ｈｒｐＤ６￣Ｒ ＡＡＴＣＴＧＴＴＧＣＧＣＡＧＴＧＧＣＡＴＣＧＡＧＣ
Ｎｏｔｅ:Ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｃｕｔｔｉｎｇ ｓｉｔｅｓ.
７０４
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. １ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｒｐＧ ｍｕｔａｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ＨｒｐＧ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｘｏｏ ａｎｄ Ｘｏｃ
Ａ: Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＨｒｐＧ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｘｏｏ ａｎｄ Ｘｏｃ. Ｂ: Ｓｋｅｔｃｈ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｒｐＧ ｍｕｔａｎｔｓꎻ
Ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ｃａｂｌｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｎｇｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｒｐＧ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｉｇａｔｅｄ ｉｎ ｐＫ１８ｍｏｂＧＩＩ ａｎｄ Ｘｏｏ ｏｒ Ｘｏｃ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ.
Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｒｅ ｓｈｏｗｎ ａｓ ｂｌａｃｋ ａｒｒｏｗｓ. Ｃ: ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｘｏｃ ｈｒｐＧ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｈｒｐＧ ｍｕｔａｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ
ｐａｒｅｎｔａｌ ｓｔｒａｉｎ ＲＳ１０５ꎻ Ｆ: Ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｈｒｐＧ￣Ｆ ａｎｄ ｔｈｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒ(Ｍ１３￣４７ ｏｒ ＲＶ￣Ｍ) ｉｎ ｐＫ１８ｍｏｂＧＩＩꎻ
Ｒ: Ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｈｒｐＧ￣Ｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒ (Ｍ１３￣４７ ｏｒ ＲＶ￣Ｍ ) .
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４期 熊 鹂ꎬ等:ｈｒｐ基因关键调控因子 ＨｒｐＧ在水稻白叶枯病菌和条斑病菌中的交叉互补性研究
将这 ４种重组子菌株接种在含相应抗生素的 ＮＢ
液体培养基中培养至 ＯＤ６００ ＝１.５ꎬ将菌体收集用无菌
水清洗后调整菌体浓度一致ꎬ并取菌悬液转接至含相
应抗生素的诱导培养基 ＸＯＭ３中培养 ４ ｈ后ꎬ收集菌
体ꎬ调整 ＯＤ６００至 １.０ꎬ取 ５００ μＬ 菌液加入 ５００ μＬ
Ｓｏｎｉｃ Ｂｕｆｆｅｒ(２０ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ、１０ ｍｍｏｌ / Ｌ β￣巯基
乙醇、５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＥＤＴＡ和 １％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ￣１００)ꎬ液氮反
复冻融 ３~５次ꎬ１２ ０００ ｒ / ｍｉｎꎬ４℃离心 １５ ｍｉｎ后ꎬ取 ５
μＬ 上清加入 ５０ μＬ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ ( ５０ ｍｍｏｌ / Ｌ
Ｎａ３ＰＯ４、１ ｍｍｏｌ / Ｌ ４￣ＭＵＧ、１０ ｍｍｏｌ / Ｌ β￣巯基乙醇
和 ０.１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ￣１００)ꎬ３７℃放置 １ ｈꎬ加入 ９４５ μＬ
Ｎａ２ＣＯ３(０ ２ ｍｏｌ / Ｌ)溶液终止反应ꎬ并在 ＵＶ下检测吸
光度ꎬ根据标准曲线公式Ｘ＝(测量值＋１ ６７０.５) / ４１４.７１ꎬ
Ｘ为酶活性值ꎬ计算出酶活性ꎬ单位为Ｕ/ ＯＤ６００ / ｈꎮ
１.５ 水稻的致病性及烟草过敏反应的检测
将待测菌株在含有相应抗生素的 ＮＢ培养基中
培养至 ＯＤ６００ ＝ １.０ꎬ收集菌体ꎬ并用无菌水洗涤一次
后ꎬ调整菌体浓度为 ＯＤ６００ ＝０.６ꎮ 用无针头注射器将
菌液注入感病水稻品种 ＩＲ２４水稻叶片中ꎬ保持叶片
湿度ꎮ 接种 ３ ｄ后观察水渍状病斑形成与否ꎮ 同样ꎬ
将上述 ＯＤ６００ ＝０.３的菌液ꎬ注入非寄主本氏烟(Ｎｉｃｏｔｉ￣
ａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ)叶片中ꎬ１ ｄ后观察过敏反应形成ꎮ
１.６ ＲＴ￣ＰＣＲ
将待测菌株在含有相应抗生素的 ＮＢ 培养基
中培养至菌体浓度达到 ＯＤ６００ ＝ ２.０ꎬ无菌水洗涤后
调整 ＯＤ６００ ＝１.０ꎮ 取 １００ μＬ菌悬液中转接至１ ｍＬ
ＸＯＭ３中培养 ６ ｈ后ꎬ１２ ０００ ｒ / ｍｉｎ 离心 ５ ｍｉｎꎬ收
集菌体ꎮ 用 ＲＮＡｉｓｏ ｐｌｕｓ(ＴａＫａＲａꎬ大连ꎬ中国)提
取细菌总 ＲＮＡꎬ经 ＤＮａｓｅＩ 充分消化ꎬ去除污染的
基因组 ＤＮＡꎮ 取 ｌ μｇ ＲＮＡ 用 ＡＭＶ(ＴａＫａＲａꎬ大
连ꎬ中国)反转录成 ｃＤＮＡꎬ随后用表 １ 中引物通过
ｑＲＴ￣ＰＣＲ对其下游基因 ｈｐａＲ、ｈｒｃＴ、ｈｒｐＸ、ｈｐａ２ 以
及 ｈｒｐＤ６的表达水平进行检测ꎮ
１.７ Ｗｅｓｔｅｒｎ 杂交
将含有 ｐＨＭ１ｈｐａ２ｍｙｃ质粒的待测菌株在 ＮＢ
培养基中培养至 ＯＤ６００ ＝ ２.０ꎬ将菌体收集ꎬ用无菌
水清洗后ꎬ用 ＸＯＭ３ 调整菌体浓度至 ＯＤ６００ ＝ １.０ꎬ
诱导培养 ４ ｈ后ꎬ１２ ０００ ｒ / ｍｉｎꎬ４℃离心 １０ ｍｉｎꎬ收
集菌体和上清液ꎬ用以制备总蛋白及上清蛋白ꎮ 标
签抗体使用华安公司的一抗 ｃＭｙｃ￣ｔａｇ 以及二抗
ａｎｔｉ￣Ｒａｂｂｉｔꎮ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ步骤详见文献[１０]ꎮ
２ 结果
２.１ Ｘｏｏ和 Ｘｏｃ的 ｈｒｐＧ突变体的构建
根据 Ｘｏｏ菌株 ＰＸＯ９９Ａ和 Ｘｏｃ菌株 ＲＳ１０５的 ｈｒ￣
ｐＧ序列ꎬ将其编码的氨基酸序列进行同源性比较ꎬ结
果显示ꎬＨｒｐＧＸｏｏ和 ＨｒｐＧＸｏｃ都含有 ２６２个氨基酸ꎬ具
有 ９８.０９ ％的一致性(ｉｄｅｎｔｉｔｙ)ꎬ但在第 ３、２２、２９、２２６、
２５２ 位存在 ５个氨基酸的差异 (图 １￣Ａ)ꎮ
本研究利用 ｐＫ１８ｍｏｂＧＩＩ 载体介导的缺失突
变体 系[ １１ ]ꎬ 选 取 ｈｒｐＧ 的 部 分 片 段 构 建 于
ｐＫ１８ｍｏｂＧＩＩ 上ꎬ获得重组载体 ｐＫ１８ｍｏｂｈｒｐＧ (图
１￣Ｂ )ꎮ 将重组载体电转进入 ＰＸＯ９９Ａ和 ＲＳ１０５ 野
生型菌株中ꎬ与其染色体上的 ｈｒｐＧ 基因发生同源
重组ꎬ筛选获得单交换子ꎬ分别命名为 ＰΔｈｒｐＧ、
ＲΔｈｒｐＧꎮ ＰＣＲ扩增结果证实ꎬＰＸＯ９９Ａ和 ＲＳ１０５ 的
ｈｒｐＧ基因被成功突变(图 １￣Ｃ )ꎮ
２.２ Ｘｏｏ和 Ｘｏｃ ｈｒｐＧ突变体丧失在水稻上致病
性和烟草上 ＨＲ反应
将 ｈｒｐＧ突变体 ＰΔｈｒｐＧ和ＲΔｈｒｐＧ接种感病水
稻品种 ＩＲ２４ 和非寄主烟草ꎬ接种试验结果显示ꎬ
ＰΔｈｒｐＧ和ＲΔｈｒｐＧ均不能在水稻叶片上形成水渍状
病斑ꎬ丧失了在水稻上的致病性 (图 ２￣Ａ)ꎬ同时在
非寄主烟草上也丧失了激发 ＨＲ 的能力(图２￣Ｂ)ꎮ
分别将来源于 ＰＸＯ９９Ａ和 ＲＳ１０５ 的 ｈｒｐＧ 功能互补
片段 ｈｒｐＧＸｏｏ和 ｈｒｐＧＸｏｃ回补各自的突变体菌株
ＰΔ ｈｒｐＧ和 ＲΔｈｒｐＧꎬ得到互补菌株ＣＰΔｈｒｐＧＸｏｏ和
ＣＲΔｈｒｐＧＸｏｃꎮ 接种试验结果显示ꎬ互补菌株在水稻
上的致病性和在烟草上激发 ＨＲ反应的能力能够恢
复至野生型水平 (图 ２￣Ａ、图 ２￣Ｂ)ꎮ 以上结果表明ꎬ
ｈｒｐＧ基因是 Ｘｏｏ 和 Ｘｏｃ 在水稻上致病性和在烟草
上激发 ＨＲ所必需的ꎮ
２.３ ｈｒｐＧＸｏｏ和 ｈｒｐＧＸｏｃ能够交叉功能互补
同源性比较揭示 ＨｒｐＧＸｏｏ和 ＨｒｐＧＸｏｃ存在 ５ 个
氨基酸的差异 (图 １)ꎬ为了验证 Ｘｏｃ 和 Ｘｏｏ 的
ＨｒｐＧ是否能够交叉功能互补ꎬ分别将 Ｘｏｃ 的
ｈｒｐＧＸｏｃ互补于 Ｘｏｏ 的 ｈｒｐＧ 突变体 ＰΔｈｒｐＧꎬ得到
交叉互补菌株 ＣＰΔｈｒｐＧＸｏｃꎬ将 Ｘｏｏ 的 ｈｒｐＧＸｏｏ互补
于 Ｘｏｃ 的 ｈｒｐＧ 突变体 ＲΔｈｒｐＧꎬ得到交叉互补菌
株ＣＲΔｈｒｐＧＸｏｏꎮ 接种试验结果显示ꎬ交叉互补菌
９０４
植物病理学报 ４４卷
株同自身互补菌株一样ꎬ均能恢复突变体在水稻上
的致病性和在烟草上激发 ＨＲ 反应的能力 (图 ２￣
Ａ、图 ２￣Ｂ)ꎮ 以上结果暗示ꎬ来源于 Ｘｏｏ 和 Ｘｏｃ 的
ｈｒｐＧ基因可以在 ２ 种菌株之间进行交叉功能互
补ꎬ两者的 ｈｒｐＧ基因可能具有相似的功能ꎮ
为了检测 ｈｒｐＧ 基因的表达在交叉互补菌株
中是否存在差异ꎬ将 ｈｒｐＧＸｏｏ和 ｈｒｐＧＸｏｃ的启动子片
段与 ｇｕｓＡ 基因进行融合ꎬ获得重组菌株 ｐＮＧ￣
ｈｒｐＧＸｏｏ和 ｐＮＧ￣ｈｒｐＧＸｏｃꎬ将这 ２ 种构建导入 Ｘｏｏ 和
Ｘｏｃ的野生型菌株 ＰＸＯ９９Ａ和 ＲＳ１０５ 中ꎮ ＧＵＳ 活
性定量测定的结果显示ꎬ在 ＰＸＯ９９Ａ和 ＲＳ１０５ 中ꎬ
这 ２种启动子的活性没有明显差异(图 ３)ꎬ暗示
Ｘｏｏ和 Ｘｏｃ中 ｈｒｐＧ 基因上游的调控机制可能一
致ꎮ
Ｆｉｇ. ２ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｘｏｏ ａｎｄ Ｘｏｃ ｈｒｐＧ ｍｕｔａｎｔｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ
ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ｈｏｓｔ ｒｉｃｅ ａｎｄ ｎｏｎ￣ｈｏｓｔ ｔｏｂａｃｃｏ
Ａ: Ｗａｔｅｒ￣ｓｏａｋｉｎｇ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｒｉｃｅ ｃｕｌｔｉｖａｒ ＩＲ２４ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ １ꎬ ＲＳ１０５ꎻ ２ꎬ ＣＲΔｈｒｐＧＸｏｃꎻ
３ꎬ ＣＲΔｈｒｐＧＸｏｏꎻ ４ꎬ ＲΔｈｒｐＧꎻ ５ꎬ ＲΔｈｒｃＶꎻ ６ꎬ ＰＸＯ９９Ａꎻ ７ꎬ ＣＰΔｈｒｐＧＸｏｃꎻ ８ꎬ ＣＰΔｈｒｐＧＸｏｏꎻ ９ꎬ ＰΔｈｒｐＧꎻ １０ꎬ ＲΔｈｒｃＵꎻ
Ｔｈｅ ｐｉｃｔｕｒｅ ｗａｓ ｔａｋｅｎ ３ ｄ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ(ＯＤ６００ ＝ ０.６ ) .
Ｂ: ＨＲ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｎｏｎ￣ｈｏｓｔ ｔｏｂａｃｃｏ ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｎ. ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ １ꎬ ＲＳ１０５ꎻ ２ꎬ ＣＲΔｈｒｐＧＸｏｃꎻ
３ꎬ ＣＲΔｈｒｐＧＸｏｏꎻ ４ꎬ ＲΔｈｒｐＧꎻ ５ꎬ ＲΔｈｒｃＶꎻ ６ꎬ ＰＸＯ９９Ａꎻ ７ꎬ ＣＰΔｈｒｐＧＸｏｃꎻ ８ꎬ ＣＰΔｈｒｐＧＸｏｏꎻ ９ꎬ ＰΔｈｒｐＧꎻ １０: ＲΔｈｒｃＵꎻ
Ｔｈｅ ｐｉｃｔｕｒｅ ｗａｓ ｔａｋｅｎ ２ ｄ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ (ＯＤ６００ ＝ ０.３ ) .
Ｆｉｇ. ３ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ｏｆ ｈｒｐＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ Ｘｏｏ (Ａ) ａｎｄ Ｘｏｃ (Ｂ)
Ａ: Ｇｕｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ｏｆ ｈｒｐＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ ＰＸＯ９９Ａꎻ Ｂ: Ｇｕｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ｏｆ ｈｒｐＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ ＲＳ１０５.
０１４
４期 熊 鹂ꎬ等:ｈｒｐ基因关键调控因子 ＨｒｐＧ在水稻白叶枯病菌和条斑病菌中的交叉互补性研究
２.４ ｈｒｐＧ 的交叉互置不影响下游 ｈｒｐ 基因的
表达
在黄单胞菌中ꎬＨｒｐＧ 调控 ｈｒｐＸ 基因的表达ꎬ
ＨｒｐＸ调控启动子区域含有 ＰＩＰ￣ｂｏｘ(ｐｌａｎｔ￣ｉｎｄｕｃｉｎｇ
ｐｒｏｍｏｔｅｒꎬ ＴＴＣＧＣ￣Ｎ１５￣ＴＴＣＧＣ)的基因[６]ꎮ 为了
检测功能交叉互补菌株中ꎬｈｒｐＧ 下游基因的表达
是否有影响ꎬ本研究对 ｈｒｐＸ 、ｈｐａＲ、ｈｒｃＴ、ｈｐａ２ 和
ｈｒｐＤ６基因的表达进行了检测ꎬＲＴ￣ＰＣＲ 的结果显
示ꎬ这 ５个基因的表达在野生型菌株、互补菌株和
交叉互补菌株中没有明显差异(图 ４)ꎬ表明 Ｘｏｏ和
Ｘｏｃ的 ｈｒｐＧ基因交叉互补后并不影响其调控的下
游基因 ｈｐａＲ、ｈｒｃＴ、ｈｒｐＸ、ｈｐａ２以及 ｈｒｐＤ６的表达ꎬ
这些证据暗示 Ｘｏｏ 和 Ｘｏｃ 的 ｈｒｐＧ 基因在调控其
下游 ｈｒｐ基因的表达上具有相似性ꎮ
２.５ ｈｒｐＧ的交叉互置不影响 Ｈｐａ２蛋白的分泌
ＨｒｐＧ调控编码 Ｔ３ＳＳ ｈｒｐ 基因的表达[１２]ꎬ为检
测 ｈｒｐＧ交叉互置后是否影响 Ｔ３ＳＳ 对效应蛋白的
分泌ꎮ 本研究检测了 Ｔ３ＳＳ 效应蛋白 Ｈｐａ２ 在交叉
互补菌株中的分泌ꎬＷｅｓｔｅｒｎ 杂交试验结果显示:在
突变体 ＰΔｈｒｐＧ 和 ＲΔｈｒｐＧ 中ꎬ在总蛋白和上清液
中不能检测到 Ｈｐａ２蛋白ꎻ在野生型、功能互补和交
叉互补菌株中ꎬ在总蛋白和上清液中都能够检测到
Ｈｐａ２蛋白(图 ５)ꎮ 这表明ꎬ在 Ｘｏｏ 和 Ｘｏｃ 中 ｈｒｐＧ
的交叉互置不影响 Ｔ３ＳＳ对 Ｈｐａ２蛋白的分泌ꎮ
３ 讨论
本研究构建了 Ｘｏｏ 和 Ｘｏｃ 的 ｈｒｐＧ 突变体ꎬ证
明在这２个致病变种中ꎬｈｒｐＧ基因可以进行功能
Ｆｉｇ. ４ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｒｐ ｃｌｕｓｔｅｒ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｘｏｏ ａｎｄ Ｘｏｃ ｈｒｐＧ ｍｕｔａｎｔｓ ａｎｄ
ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｉｎｓ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＲＴ￣ＰＣＲ
Ｆｉｇ. ５ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｐａ２ ｉｎ Ｘｏｏ ａｎｄ Ｘｏｃ ｈｒｐＧ
ｍｕｔａｎｔｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ
１１４
植物病理学报 ４４卷
的交叉互补ꎬ在互置菌株中ꎬＨｒｐＧ调控的下游基因
ｈｒｐＸ、ｈｐａＲ、ｈｒｃＴ、ｈｐａ２ 和 ｈｒｐＤ６ 的表达没有差异ꎬ
并且 Ｈｐａ２ 蛋白通过 ＩＩＩ 型分泌系统的分泌性也没
有受到影响ꎮ
Ｘｏｏ 和 Ｘｏｃ 与寄主水稻的互作依赖于 ｈｒｐ 基
因编码的 Ｔ３ＳＳꎬｈｒｐ 基因的表达受 ＨｒｐＧ 和 ＨｒｐＸ
调控[５]ꎮ ＨｒｐＧ 属于双组分信号传导系统 ＯｍｐＲ
家族的感应调控因子ꎬＨｒｐＧ 调控 ＨｒｐＸ[５]ꎬＨｒｐＸ
调节启动子区域含有 ＰＩＰ￣ｂｏｘ 结构域的基因[１３]ꎬ
因此推测 ＨｒｐＧ 是一种直接与寄主互作的应答因
子ꎮ Ｘｏｏ 和 Ｘｏｃ以不同的途径侵染寄主水稻ꎬ造成
不同症状类型的病害ꎬ这种组织侵染的特异性是否
与 ｈｒｐ 基因有关ꎬ一直处于未知阶段ꎮ 本研究以
ｈｒｐＧ基因为切入点ꎬ比较了 Ｘｏｏ 和 Ｘｏｃ 的 ＨｒｐＧ
蛋白序列ꎬ发现 ＨｒｐＧＸｏｏ和 ＨｒｐＧＸｏｃ存在 ５个氨基酸
的差异ꎬ交叉互补试验证明这 ５个氨基酸的差别并
不影响其在寄主水稻上的致病性和在非寄主烟草
上激发 ＨＲ 反应的能力ꎮ 这些证据暗示 Ｘｏｏ 和
Ｘｏｃ侵染寄主水稻组织的特异性不依赖于 ｈｒｐＧ基
因ꎬ可能存在 ｈｒｐＧ 基因调节的下游或者 Ｘｏｏ 与
Ｘｏｃ基因组中有差别的基因ꎮ 先前的研究显示
Ｘｏｃ的 ＥｃｐＡ 蛋白酶是一个组织特异性的毒性因
子ꎬ该蛋白为 Ｘｏｃ 所特有ꎬ并不受 ＨｒｐＧ 调控[２] ꎮ
比较基因组学研究结果显示ꎬＸｏｏ和 Ｘｏｃ 在一些涉
及胞外多糖合成和转运的基因位点存在较大的差
异[１]ꎮ 这些差异的基因是否受 ＨｒｐＧ调控ꎬ以及这
些基因是否决定侵染水稻组织的特异性有待于进
一步研究ꎮ
ｈｒｐ基因是病原菌与植物接触时诱导表达的ꎬ
多种环境因素(温度、营养组分和 ｐＨ值)都能够影
响 ｈｒｐ 基因的表达[１４]ꎮ 在这些 ｈｒｐ 基因中ꎬｈｒｐＧ
是第一个被活化的基因[１５]ꎮ 同源性比较结果发
现ꎬｈｒｐＧＸｏｏ和 ｈｒｐＧＸｏｃ基因上游 ３９７ ｂｐ 的启动子存
在 １８个碱基的差异ꎬ启动子活性测定结果显示ꎬ在
Ｘｏｏ和 Ｘｏｃ中ꎬ这 ２ 个启动子活性没有明显差异ꎬ
这暗示ꎬＸｏｏ和 Ｘｏｃ 中 ｈｒｐＧ 基因上游的调控机制
可能一致ꎮ 在 Ｘｏｏ 中已鉴定了 ２ 个 ｈｒｐＧ 的调控
因子 ＬｒｐＸ(负调控子) [１６]和 Ｔｒｈ(正调控子) [１７]ꎬ
但在 Ｘｏｃ中ꎬ这 ２个调控因子对 ｈｒｐＧ 是否也具有
相似的调控作用ꎬ还需要进一步的证据ꎮ
在辣椒斑点病菌(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ. ｐｖ.
ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａꎬ Ｘｃｖ)中发现 ＨｒｐＧ的点突变能够使 ｈｒｐ
基因在抑制的环境条件下组成型表达[１８]ꎮ 本研究
发现ꎬ在 Ｘｏｏ 和 Ｘｏｃ 的 ｈｒｐＧ 交叉功能互补菌株
中ꎬｈｒｐＧ 下游调控的基因 ｈｒｐＸ、 ｈｐａＲ[１９]、 ｈｒｃＴ、
ｈｐａ２[４]和 ｈｒｐＤ６[１０]的表达没有受到影响ꎬ这表明
Ｘｏｏ和 Ｘｏｃ的 ｈｒｐＧ基因在调控其下游 ｈｒｐ 基因的
表达上具有相似性ꎬ氨基酸有差异的 ５ 个位点ꎬ可
能不是决定 ＨｒｐＧ构象的主要位点ꎮ
随着 Ｘｏｏ 和 Ｘｏｃ 与水稻互作研究的发展ꎬ与
组织特异性侵染相关基因的研究将越来越受关注ꎬ
本研究的结果将为后续揭示 Ｘｏｏ 和 Ｘｏｃ 组织和病
害症状特异性所需的功能基因提供科学线索ꎮ
参考文献
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２１４
４期 熊 鹂ꎬ等:ｈｒｐ基因关键调控因子 ＨｒｐＧ在水稻白叶枯病菌和条斑病菌中的交叉互补性研究
ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｖｉｒｕｌｅｎｔ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ
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Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] .
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ｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ａｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ [ Ｊ ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ
Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ １９９２ꎬ ５(６):４５１－４５９.
[１０] ＬｉＹ Ｒꎬ Ｚｏｕ Ｈ Ｓꎬ Ｃｈｅ Ｙ Ｚꎬ ｅｔ ａｌ. Ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ
ｒｏｌｅ ｏｆ ＨｒｐＤ６ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｈｒｐ￣ｈｒｃ￣ｈｐａ ｇｅｎｅｓ ｉｎ
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａ [ Ｊ ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ ２０１１ꎬ ２４(９):１０８６－１１０１.
[１１] Ｚｏｕ Ｌ Ｆꎬ Ｚｈｏｕ Ｄꎬ Ｌｉｕ Ｚ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅ￣
ｓｉｓ ｉｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)[Ｊ] . Ａｃｔａ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ (植物
病理学报)ꎬ ２０１２ꎬ ４２(２):１７６－１８５.
[１２] Ｗｅｎｇｅｌｎｉｋ Ｋꎬ Ｖａｎ ｄｅｎ Ａｃｋｅｒｖｅｋｅｎ Ｇꎬ Ｂｏｎａｓ Ｕ.
ＨｒｐＧꎬ ａ ｋｅｙ ｈｒｐ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ ｉｓ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ｔｗｏ￣ｃｏｍ￣
ｐｏｎｅｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ [ Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉ￣
ｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ １９９６ꎬ ９(８):７０４－７１２.
[１３] Ｆｕｒｕｔａｎｉ Ａꎬ Ｎａｋａｙａｍａ Ｔꎬ Ｏｃｈｉａｉ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ＨｒｐＸｏ ｒｅｇｕｌｏｎｓ ｐｒｅｃｅｄｅｄ ｂｙ ｔｗｏ
ｃｉｓ￣ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓꎬ ａ ｐｌａｎｔ￣ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｂｏｘ ａｎｄ
ａ￣１０ ｂｏｘ￣ｌｉｋｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅꎬ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ [Ｊ] . ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ￣
ｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓꎬ ２００６ꎬ ２５９(１):１３３－１４１.
[１４] Ｒａｈｍｅ Ｌ Ｇꎬ Ｍｉｎｄｒｉｎｏｓ Ｍ Ｎꎬ Ｐａｎｏｐｏｕｌｏｓ Ｎ Ｊ. Ｐｌａｎｔ
ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓｅｎｓｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｓ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓ￣
ｓｉｏｎ ｏｆ ｈｒｐ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｐｈａｓｅ￣
ｏｌｉｃｏｌａ [Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙꎬ １９９２ꎬ １７４(１１):
３４９９－３５０７.
[１５] Ｌｉｎｄｇｒｅｎ Ｐ Ｂ. Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｒｐ ｇｅｎｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｐｌａｎｔ￣ｂａｃ￣
ｔｅｒｉａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ [Ｊ] . Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ￣
ｏｇｙꎬ １９９７ꎬ ３５:１２９－１５２.
[１６] Ｉｓｌａｍ Ｍ Ｒꎬ Ｈｉｒａｔａ Ｈꎬ Ｔｓｕｇｅ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｅｌｆ￣ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆ ａ ｎｅｗ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｌｅｕｃｉｎｅ￣
ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬｒｐＸ ｉｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ
[Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００９ꎬ ７５: ５６
－６５
[１７] Ｔｓｕｇｅ Ｓꎬ Ｎａｋａｙａｍａ Ｔꎬ Ｔｅｒａｓｈｉｍａ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｇｅｎｅ
ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｒｐ ｒｅｇｕｌａ￣
ｔｏｒｙ ｇｅｎｅ ｈｒｐＧ ｉｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ [Ｊ] .
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙꎬ ２００６ꎬ １８８(１１):４１５８－４１６２.
[１８] Ｗｅｎｇｅｌｎｉｋ Ｋꎬ Ｒｏｓｓｉｅｒ Ｏꎬ Ｂｏｎａｓ Ｕ. Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ
ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅ ｈｒｐＧ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ.
ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｌｌ ｈｒｐ
ｇｅｎｅｓ [Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙꎬ １９９９ꎬ １８１(２１):
６８２８－６８３１.
[１９] Ｗｅｉ Ｋꎬ Ｔａｎｇ Ｄ ꎬ Ｈｅ Ｙ Ｑꎬ ｅｔ ａｌ. ｈｐａＲꎬ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ
ｍａｒＲ ｆａｍｉｌｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒꎬ ｉｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ
ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ＨｒｐＧ ａｎｄ ＨｒｐＸ ａｎｄ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐａ￣
ｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓꎬ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅꎬ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
ｐｒｏｔｅａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐａｔｈｏ￣
ｖａｒ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙꎬ ２００７ꎬ
１８９(５): ２０５５－２０６２.
责任编辑:于金枝
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