全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４５(２): １３０￣１３８(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０４￣１５ꎻ 修回日期: ２０１４￣１２￣２０
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(３１３７１９０５)ꎻ 公益性行业(农业)科研专项(２０１３０３０１５￣０２)
通讯作者: 邹丽芳ꎬ 副教授ꎬ 主要从事分子植物病理学研究ꎻ Ｔｅｌ: ０２１￣３４２０５８７３ꎬ Ｆａｘ: ０２１￣３４２０５８７３ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｚｏｕｌｉｆａｎｇ２０２０１８＠ｓｊｔｕ. ｅｄｕ. ｃｎ
第一作者: 王淼啸ꎬ 男ꎬ 四川人ꎬ 本科生ꎬ 主要从事分子植物病理学研究ꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０２.００３
水稻白叶枯病菌 ｈｒｐＧ调控基因的鉴定
王淼啸ꎬ 刘之洋ꎬ 董启超ꎬ 邹丽芳∗ꎬ 陈功友
(上海交通大学农业与生物学院ꎬ上海 ２００２４０)
摘要:水稻白叶枯病菌(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅꎬ Ｘｏｏ)引起的白叶枯病(ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｅａｆ ｂｌｉｇｈｔꎬ ＢＬＢ)是水稻上最严重的细
菌病害之一ꎮ Ｘｏｏ与寄主水稻的互作依赖由 ｈｒｐ 基因编码的 ＩＩＩ 型分泌系统(Ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍꎬ Ｔ３ＳＳ)ꎬ将效应蛋白
(Ｔ３ＳＳ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓꎬ Ｔ３ＳＥｓ)注射入水稻细胞ꎬ引起 ＢＬＢ症状的扩展ꎮ ＨｒｐＧ是 ｈｒｐ基因转录表达的主要调控因子ꎮ 为了鉴定未
知的 ｈｒｐＧ调控子ꎬ本研究在以 ｈｒｐＧ∷ｇｕｓＡ为报道基因构建的转座子突变体库中ꎬ筛选获得 ４个候选的 ｈｒｐＧ负调控子突变体
Ｇ２４￣４６、Ｇ４８￣２２、Ｇ１９￣１４和 Ｇ５７￣４１ꎮ ＧＵＳ活性测定、荧光定量 ＰＣＲ 以及烟草组织的 ＧＵＳ 染色试验均显示ꎬ在这些突变体中
ｈｒｐＧ的表达显著增加ꎮ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果显示ꎬ突变体中转座子均为单一位点的插入ꎮ 插入位点分析结果显示ꎬ在 Ｇ２４￣４６、
Ｇ４８￣２２、Ｇ５７￣４１和 Ｇ１９￣１４中转座子分别插入在 ｍｉｎＤ、 ｐｉｌＡ、ｍｅｔＢ和 ｗｘｏＢ基因中ꎮ 毒性测定结果显示ꎬ这 ４个突变体在水稻
上的毒性显著降低ꎮ 这些 ｈｒｐＧ调控子基因的鉴定为进一步解析稻黄单胞菌 ｈｒｐＧ上游调控网络提供了新的科学线索ꎮ
关键词:水稻白叶枯病菌ꎻ ｈｒｐＧ基因ꎻ ｇｕｓＡ基因ꎻ 基因调控ꎻ ｈｒｐ基因
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｈｒｐＧ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ.
ｏｒｙｚａｅ ＷＡＮＧ Ｍｉａｏ￣ｘｉａｏꎬ ＬＩＵ Ｚｈｉ￣ｙａｎｇꎬ ＤＯＮＧ Ｑｉ￣ｃｈａｏꎬ ＺＯＵ Ｌｉ￣ｆａｎｇꎬ ＣＨＥＮ Ｇｏｎｇ￣ｙｏｕ ( Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏ Ｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００２４０ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ (Ｘｏｏ)ꎬ ｃａｕｓｅｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｅａｆ ｂｌｉｇｈｔ (ＢＬＢ) ｉｎ ｒｉｃｅ (Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ)ꎬ
ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｓｅｒｉｏｕｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｉｎ ｒｉｃｅ. Ｔｈｅ Ｘｏｏ￣ｒｉｃｅ ｐａｔｈｏｓｙｓｔｅｍ ｍａｉｎｌｙ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ａ ｔｙｐｅ ＩＩＩ
ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ (Ｔ３ＳＳ) ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ａ ｈｒｐ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｔｏ ｉｎｊｅｃｔ Ｔ３ＳＳ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ (Ｔ３ＳＥｓ) ｉｎｔｏ ｒｉｃｅ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ＢＬＢ
ｄｉｓｅａｓｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ. ＨｒｐＧ ｉｓ ａ ｍａｊｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｒｐ ｇｅｎｅｓ. Ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｕｎｋｎｏｗｎ
ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｒｐＧꎬ ｆｏｕｒ ｍｕｔａｎｔｓ Ｇ２４￣４６ꎬ Ｇ４８￣２２ꎬ Ｇ１９￣１４ ａｎｄ Ｇ５７￣４１ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ
ｆｒｏｍ ａ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ￣ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｘｏｏ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｈｒｐＧ∷ｇｕｓＡ ｆｕｓｉｏｎ ａｓ ａ ｒｅｐｏｒｔｅｒ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ＧＵＳ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙｓꎬ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ａｎ ｉｎ ｓｉｔｕ ＧＵＳ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｈｒｐＧ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｆｏｕｒ ｍｕｔａｎｔｓ ｗａｓ ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｗｈｅｎ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ. Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｗａｓ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎ ｍｉｎＤꎬ ｐｉｌＡꎬ ｍｅｔＢ ａｎｄ ｗｏｘＢ
ｇｅｎｅｓꎬ ｉｎ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔｓ Ｇ２４￣４６ꎬ Ｇ４８￣２２ꎬ Ｇ５７￣４１ ａｎｄ Ｇ１９￣１４ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ａｓｓａｙｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ
ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｆｏｕｒ ｇｅｎｅｓ ｌｅｄ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｌｅｓｓ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｉｎ ｒｉｃｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ. Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅꎬ ｉｄｅｎｔｉｆｉ￣
ｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｈｒｐＧ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｇｅｎｅｓ ｗｏｕｌｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｓｏｍｅ ｎｅｗ ｔｈｒｅａｄｓ ｔｏ ｅｌｕｃｉｄａｔｅ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋ ｕｐ￣
ｓｔｒｅａｍ ｔｈｅ ｈｒｐＧ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｘ. ｏｒｙｚａｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ ꎻ ｈｒｐＧ ｇｅｎｅꎻ ｇｕｓＡ ｇｅｎｅꎻ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎꎻ ｈｒｐ ｇｅｎｅ
中图分类号: Ｓ４３２.４２ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０２￣０１３０￣０９
水稻白叶枯病菌 ( Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ.
ｏｒｙｚａｅꎬ Ｘｏｏ)ꎬ从水稻叶尖和叶缘的水孔或伤口处
侵染水稻ꎬ进入维管束进行繁殖扩展危害ꎬ形成典
型的白叶枯症状ꎬ产生水稻白叶枯病(ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｅａｆ
２期 王淼啸ꎬ等:水稻白叶枯病菌 ｈｒｐＧ调控基因的鉴定
ｂｌｉｇｈｔꎬ ＢＬＢ)ꎮ ＢＬＢ 是水稻上最严重的细菌病害
之一[１]ꎮ Ｘｏｏ在与植物互作时主要依赖 ＩＩＩ 型分泌
系统(Ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍꎬ Ｔ３ＳＳ)ꎬ将效应蛋
白(Ｔ３ＳＳ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓꎬ Ｔ３ＳＥｓ)注入植物细胞中ꎬ从而
导致病原菌在非寄主和抗病寄主上产生过敏反应
(ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅꎬ ＨＲ)ꎬ在感病寄主水稻上
具有致病性(ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ) [２]ꎮ 形成 Ｔ３ＳＳ 装置的
蛋白由成簇存在的 ｈｒｐ基因编码[３]ꎮ
植物病原黄单胞菌的 ｈｒｐ 基因在与植物互作
时被诱导表达ꎬＨｒｐＧ 和 ＨｒｐＸ 是 ｈｒｐ 基因表达的
关键调控子[４]ꎮ ＨｒｐＧ 属双组分信号传导系统
( ｔｗｏ￣ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍꎬ ＴＣ￣
ＳＴｓ)ＯｍｐＲ家族的感应调控因子ꎬ可调控 ｈｒｐＸ 和
ｈｒｐ基因簇中 ｈｒｐＡ转录单元的转录表达[５]ꎮ ＨｒｐＸ
是 ＡｒａＣ类转录因子ꎬ主要调控启动子区域含有保
守基序 ＰＩＰ￣ｂｏｘ(ｐｌａｎｔ￣ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒꎬ ＴＴＣＧＣ￣
Ｎ１５￣ＴＴＣＧＣ) 的 ｈｒｐ 基因以及编码 Ｔ３ＳＥ 的基
因[６]ꎮ 在辣椒斑点病菌(Ｘ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｖｅｓｉｃａ￣
ｔｏｒｉａꎬ Ｘｃｖ)中发现 ＨｒｐＧ的点突变能够使 ｈｒｐ 基因
在抑制的环境条件下组成型表达ꎬ认为 ＨｒｐＧ 的构
象改变对 ｈｒｐ 基因的调节起重要作用[７]ꎮ 在柑橘
溃疡病菌(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ. ｃｉｔｒｉꎬ Ｘａｃ)
中发现ꎬＨｒｐＧ 能够与双组分调控系统的感应激酶
(ｓｅｎｓｏｒ ｋｉｎａｓｅ) 互作[８]ꎮ 在甘蓝黑腐病菌 ( Ｘ.
ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓꎬ Ｘｃｃ)中发现双组分受体
激酶 ＨｐａＳ 能够影响 ＨｒｐＧ 的磷酸化水平以及
ＨｐａＲ１能够负调控 ｈｒｐＧ 的转录表达[９ꎬ １０]ꎮ 由于
不同植物黄单胞菌寄生危害不同的寄主植物ꎬ可能
感受的植物信号分子不同ꎬ因而可能在调控 ＨｒｐＧ
转录表达的上游调控网络不同ꎮ 在 Ｘｏｏ 中仅鉴定
了 ２个 ｈｒｐＧ的调控因子 ＬｒｐＸ(负调控子) [１１ꎬ １２]和
Ｔｒｈ(正调控子) [５]ꎮ 推测ꎬ除这些因子外ꎬ还有一
些未知因子在水稻黄单胞菌中对 ＨｒｐＧ 转录表达
具有调控作用ꎮ
为鉴定新的 ｈｒｐＧ调控子ꎬ本研究以 ｈｒｐＧ∷ｇｕ￣
ｓＡ为报道基因ꎬ利用转座子的随机插入ꎬ构建了高
通量的 Ｘｏｏ突变体库ꎬ从中获得 ４个负调控 ｈｒｐＧ表
达的突变体ꎬ并对插入位点的基因进行了鉴定ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 菌株和质粒
本研究所用质粒和菌株见表 １ꎮ 大肠杆菌
Ｔａｂｌｅ １ Ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄ Ｒｅｌｅｖａｎｔ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ Ｓｏｕｒｃｅ
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ.ｏｒｙｚａｅ
ＰＸＯ９９Ａ Ｘｏｏ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎꎬ Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅ ｒａｃｅ ６ [１４]
Ｇ１９￣１４ Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＰＸＯ９９Ａ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｇ２４￣２６ Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＰＸＯ９９Ａ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｇ４８￣２２ Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＰＸＯ９９Ａ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｇ５７￣４１ Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＰＸＯ９９Ａ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＥＣ１００Ｄ＋ ＥＣ１００ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅꎬ ｐｉｒ＋ Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｐｌａｓｍｉｄｓ
ｐＰＲＯＢＥ￣ＮＴ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ￣ＧＦＰ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｌａｓｍｉｄꎻ Ｋｍｒ [１５]
ｐＮＧ Ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ ｖｅｃｔｏｒꎬ ｇｕｓＡꎻ Ｋｍｒ Ｔｈｉｓ ｌａｂ
ｐＮＧ￣ｈｒｐＧ Ｔｈｅ ｈｒｐＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ ｐＮＧꎻ Ｋｍｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＨＭ１ ＩｎｃＷꎬ ｍｏｂꎬ ＬａｃＩＰ＋ꎬ ＰＫ２ ｒｅｐｌｉｃｏｎꎬ ｃｏｓｍｉｄꎻ Ｓｐｒ [１４]
ｐＨＧ￣ｈｒｐＧ Ｔｈｅ ｈｒｐＧ∷ｇｕｓ ｆｒｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ ｐＨＭ１ꎻ Ｋｍｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＨＧ２ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｏｂｅ ｃａｓｓｅｔｔｅ (Ｔ１) ４ ￣ＭＣＳ￣ｇｕｓＡ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ ｐＨＭ１ꎻ Ｓｐｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐＨＧ２￣ｈｒｐＧ Ｔｈｅ ｈｒｐＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ ｐＨＧ２ꎻ Ｓｐｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ｐｍｉｎｉＨｉｍａｒ ＲＢ１ Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ ｇｅｎｅꎬ Ｒ６Ｋ ｒｅｐｌｉｃｏｎꎻ Ｋｍｒ [１６]
１３１
植物病理学报 ４５卷
ＥＣ１００Ｄ＋置于 ＬＢ 培养基中生长ꎬ最适生长温度为
３７℃ꎬＸｏｏ菌株于 ＮＡ、ＮＢ或者 ＸＯＭ３[１３]培养基中
生长ꎬ最适生长温度为 ２８℃ꎮ 所用质粒通过电转
化方式导入相应的宿主菌中ꎮ 抗生素浓度:卡那霉
素 (Ｋｍ) ２０ μｇ / ｍＬꎬ壮观霉素( Ｓｐ) ２０ μｇ / ｍＬꎮ
限制性内切酶、ＥＸ￣Ｔａｑ 酶和 Ｔ４￣ＤＮＡ 连接酶均购
于 ＴａＫａＲａ公司(Ｄａｌｉａｎꎬ Ｃｈｉｎａ)ꎮ
１.２ ｐＨＧ￣ｈｒｐＧ和 ｐＨＧ２￣ｈｒｐＧ 载体构建
根据 Ｘｏｏ ＰＸＯ９９Ａ菌株的全基因组序列(Ｇｅｎ￣
Ｂａｎｋ: ＮＣ＿０１０７１７.１)设计 ｈｒｐＧ 启动子引物ꎬ所有
引物的合成均在生工生物工程(上海)有限公司进
行ꎮ 以 ｈｒｐＧｐ￣Ｆ (Ｓａｌ Ｉ) ５′￣ＧＧＡＧＴＣＧＡＣＧＣＡＧＧ￣
ＴＡＧＴＣＧＧＡＣＡＡＣＧ￣３′和 ｈｒｐＧｐ￣Ｒ ( ＥｃｏＲ Ｉ) ５′￣
ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＴＧＡＡＧＧＧＧＡＧＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣ￣３′
为引物ꎬ以 ＰＸＯ９９Ａ基因组 ＤＮＡ为模版ꎬＰＣＲ扩增
出 ８６０ ｂｐ的启动子片段ꎬ通过 Ｓａｌ Ｉ和 ＥｃｏＲ Ｉ位点
克隆在 ｐＮＧ 载体相应的位点上ꎬ获得 ｐＮＧ￣ｈｒｐＧ
载体ꎮ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ酶切 ｐＮＧ￣ｈｒｐＧ质粒获得 ２.９ ｋｂ的
ｈｒｐＧ∷ｇｕｓ 片段ꎬ连在经过 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 酶切处理的
ｐＨＭ１载体上获得 ｐＨＧ￣ｈｒｐＧꎮ
以 Ｔ１４￣Ｆ ( ５′￣ＡＣＴＧＡＡＴＴＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧ
ＧＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧ￣３′)和 Ｔ１４￣Ｒ (５′￣ＧＧＣＡＴＧＣＡＡ
ＧＣＴＴＣＣＧＡＴＣＣＣＣＡＡＴＴＣＣＴＧ￣３′) 为引物ꎬ以载
体 ｐＰＲＯＢＥ￣ＮＴ的质粒 ＤＮＡ 为模版ꎬＰＣＲ 扩增出
９３４ ｂｐ 的终止子片段(Ｔ１) ４ꎮ ＥｃｏＲ Ｉ 和 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
酶切的(Ｔ１) ４片段与从 ｐＮＧ 载体上经 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 酶
切下来的 ｇｕｓ片段连在经 ＥｃｏＲ Ｉ 和 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 酶切
的 ｐＨＭ１载体上ꎬ获得 ｐＨＧ２ꎮ ＥｃｏＲ Ｉ 和 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
酶切的(Ｔ１) ４片段与 ｐＮＧ￣ｈｒｐＧ 载体上经 Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
酶切下来的 ｈｒｐＧ∷ ｇｕｓ 片段连在经 ＥｃｏＲ Ｉ 和
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ酶切的 ｐＨＭ１载体上ꎬ获得 ｐＨＧ２￣ｈｒｐＧꎮ
１.３ 突变体中外源质粒的去除
将突变体单菌落接种在 ２０ ｍＬ ＮＢ培养中ꎬ培
养 ２４ ｈ后ꎬ以 １０％转接入新鲜的 ＮＢ培养基中ꎬ连
续转代 ３次培养ꎮ 吸取 ２ μＬ菌液稀释后涂布不含
有抗生素的 ＮＡ 培养基上ꎬ培养 ２ ~ ３ ｄ 获得单菌
落ꎮ 用牙签将单菌落同时点在 ＮＡ和 ＮＡ＋Ｓｐ的培
养基上ꎬ观察菌落生长ꎮ 在 ＮＡ 培养基上能生长ꎬ
在 ＮＡ＋Ｓｐ的培养基上不能生长的菌落ꎬ即为丢失
了外源质粒ꎮ
１.４ 突变体中转座子拷贝数和插入位点的分析
提取突变体 ｇＤＮＡ后进行 Ｐｓｔ Ｉ酶切ꎬ以 ｎｐｔＩＩ￣
Ｆ ( ５′￣ＡＴＧＡＴＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣ￣３′)
和 ｎｐｔＩＩ￣Ｒ ( ５′￣ＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧ￣
ＧＣ￣３′)为引物组合ꎬ扩增得到转座子中 ｎｐｔＩＩ 抗性
基因的 ＤＮＡ片段作为探针ꎬ通过 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交分
析ꎬ明确转座子插入的拷贝数ꎮ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交中探
针标记和信号检测ꎬ参见 Ｒｏｃｈｅ (德国)ＤＩＧ￣Ｈｉｇｈ
Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ Ｉ 试
剂盒ꎮ
取 ２ μＬ突变体 ｇＤＮＡꎬ建立 ２０ μＬ 的酶切体
系ꎬ经 ＢａｍＨ Ｉ 酶切后ꎬ以 Ｔ４￣ＤＮＡ 连接酶进行连
接反应ꎬ连接反应液热转化入 ＥＣ１００Ｄ＋菌株的感
受态细胞中ꎬ在 ＬＢ＋Ｋｍ 平板上获得转化子ꎬ提取
转化子质粒ꎬ利用 ｈｉｍａｒ１和 ６１５引物[１６]ꎬ进行测序
分析ꎮ
１.５ ＧＵＳ活性定量测定
待测菌株单菌落接种于 ５ ｍＬ 含相应抗生素
的 ＮＢ液体ꎬ振荡培养至 ＯＤ６００>１.０ꎻ１０％转接至新
鲜的 ＮＢ培养液中ꎬ振荡培养至 ＯＤ６００约 １.５ꎬ收集
２ ｍＬ 菌液 １０ ０００ ｒ / ｍｉｎ 离心 １ ｍｉｎꎬ ｄｄＷ 洗涤沉
淀 １次后收集菌体ꎮ ５００ μＬ ＸＯＭ３ 悬浮ꎬ调菌液
ＯＤ６００至 ０.５ꎬ 诱导培养 ４ ｈꎬ然后加 ５００ μＬ ２×ｓｏｎｉｃ
ｂｕｆｆｅｒ(２０ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ、１０ ｍｍｏｌ / Ｌ β￣巯基乙
醇、５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＥＤＴＡ 和 １％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ￣１００)振荡混
匀ꎻ液氮中反复冻融 ５ 次ꎬ以完全裂解细胞ꎬ４℃
１２ ０００ ｒ / ｍｉｎ离心 １５ ｍｉｎꎻ 取 ５ μＬ 上清液加入 ４５
μＬ ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ(５０ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｎａ３ＰＯ４、１ ｍｍｏｌ / Ｌ ４￣
ＭＵＧ、１０ ｍｍｏｌ / Ｌ β￣巯基乙醇和 ０. １％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ￣
１００)ꎬ３７℃反应 １ ｈꎻ取 １０ μＬ 反应液加入 ９０ μＬ
Ｎａ２ＣＯ３(０.２ ｍｏｌ / Ｌ)终止反应ꎬ在荧光光度分析仪
中测定吸光值ꎬ根据标准曲线公式 Ｘ ＝ (测量值＋
１６７０.５) / ４１４.７１ꎬ计算出酶活性ꎬＸ 为酶活性值ꎬ
酶活性单位为 Ｕ / ＯＤ６００ / ｈꎮ
１.６ 烟草组织中 ＧＵＳ染色
待测菌株单菌落接种于 ５ ｍＬ 含相应抗生素
的 ＮＢ液体ꎬ振荡培养 １２ ｈꎻ１０％转接至新鲜的 ＮＢ
培养液中ꎬ振荡培养至 ＯＤ６００约 １.５ꎬ收集 ２ ｍＬ 菌
液 １０ ０００ ｒ / ｍｉｎ 离心 １ ｍｉｎꎬ ｄｄＷ 洗涤沉淀 １ 次
后ꎬ调菌液 ＯＤ６００至 １.０ꎮ 用注射器将菌液注入烟
２３１
２期 王淼啸ꎬ等:水稻白叶枯病菌 ｈｒｐＧ调控基因的鉴定
草叶片中ꎬ记录注射的时间ꎬ选取 ０.３、１、４、６ 和 ８ ｈ
时间点ꎬ用打孔器将叶片取出浸在 ＧＵＳ染色液(５０
ｍｍｏｌ / Ｌ Ｎａ２ ＨＰＯ４、 ５０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮａＨ２ ＰＯ４、 ０. １％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ￣１００、２ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｋ３ Ｆｅ (ＣＮ) ６、２ ｍｍｏｌ / Ｌ
Ｋ４[Ｆｅ(ＣＮ) ６] ３ Ｈ２Ｏ、 １０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＥＤＴＡ 和 １０
ｍｍｏｌ / Ｌ Ｘ￣Ｇｌｕｃ)中 １０ ｈꎬ取出叶片ꎬ在无水乙醇中
脱色 ８ ｈꎬ取出叶片进行拍照ꎮ
１.７ 毒性测定
感病水稻品种 ＩＲ２４种植于上海交通大学农业
与生物学院温室大棚内ꎬ水稻生长 ２个月后用于接
种试验ꎮ 待测菌株单菌落接种于 ２０ ｍＬ ＮＢ 培养
液中ꎬ２８℃振荡培养 １２ ｈ 后ꎬ按 １％的比例转接入
新鲜 ＮＢ培养基中再过夜培养ꎬ接种前水洗 ２ 次ꎬ
统一 ＯＤ６００值为 ０.８ꎬ 在 ＩＲ２４水稻叶上进行剪叶接
种ꎬ每个菌株接种 ３张叶片ꎬ１５ ｄ后统计病斑长度ꎮ
２ 结果
２.１ 水稻白叶枯病菌 ｈｒｐＧ调控子突变体的筛选
为了筛选 Ｘｏｏ 的 ｈｒｐＧ 调控子ꎬ以 ｇｕｓＡ 为报
道基因ꎬ与 ｈｒｐＧ基因启动子区域融合(图 １￣Ａ)ꎬ构
建融合表达载体 ｐＨＧ￣ｈｒｐＧꎬ将该载体导入 Ｘｏｏ 野
生型菌株 ＰＸＯ９９Ａ中ꎮ 以转座子ｍｉｎｉＨｉｍａｒ ＲＢ１随
机插入构建高通量的突变体库ꎬ在含有 Ｘ￣ｇｌｕｃ 的
ＮＡ＋Ｓｐ＋Ｋｍ 培养基上ꎬ筛选了 ５ ０００ 个突变体ꎮ
根据菌落蓝色的深浅ꎬ与野生型菌株 ＰＸＯ９９Ａ相
比ꎬ获得 １９个 ＧＵＳ活性显著增强的突变体ꎮ 利用
ｈｒｐ诱导培养基 ＸＯＭ３ꎬ对上述 １９ 个突变体的
ＧＵＳ活性进行定量分析ꎬ结果显示:与野生型菌株
相比ꎬ４个突变体的 ＧＵＳ 活性明显增加ꎬ差异性均
达到显著水平(表 ２)ꎮ
上述 ４ 个突变体均含有外源质粒 ｐＨＧ￣ｈｒｐＧꎬ
为了便于后续的遗传操作ꎬ本研究尝试利用转代连
续培养的方法ꎬ获得不含有外源质粒的突变体(见
材料与方法)ꎬ分别命名为 Ｇ２４￣４６、Ｇ４８￣２２、Ｇ１９￣１４
和 Ｇ５７￣４１ꎮ
为了排除 ｐＨＧ￣ｈｒｐＧ 载体上含有旁侧启动子
(如 ｌａｃＩ启动子)元件对 ｈｒｐＧ转录表达的影响ꎬ将
含有 ４个拷贝的 Ｔ１终止子元件构建在 ｈｒｐＧ 启动
子的上游ꎬ获得新的转录融合表达载体 ｐＨＧ２￣ｈｒｐＧ
(图 １￣Ａ)ꎮ 将该载体导入上述不含有外源质粒的
突变体中ꎬ利用ｈｒｐ诱导培养基ＸＯＭ３ꎬ进行ＧＵＳ
Ｔａｂｌｅ ２ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｒｐＧ ｉｎ ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ (ＷＴ) ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ
ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ ｈｒｐ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｍｅｄｉｕｍ ＸＯＭ３
Ｓｔｒａｉｎ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ(Ｕ / ＯＤ６００ / ｈ) Ｒａｔｉｏ(Ｓｔｒａｉｎ / ＷＴ)
ＷＴ (ｐＨＧ￣ｈｒｐＧ) ａ ３０９５.２３± １４０.４９ １.００
Ｇ１９￣１４ (ｐＨＧ￣ｈｒｐＧ) ７３８８.０７± ５８９.２１∗ ２.３９
ＷＴ (ｐＨＧ￣ｈｒｐＧ) ｂ ４２４３.１３± ５６３.４５ １.００
Ｇ２４￣４６ (ｐＨＧ￣ｈｒｐＧ) ２２２８９.５５±１９６４.３０∗ ５.２５
Ｇ４８￣２２ (ｐＨＧ￣ｈｒｐＧ) ２０２７９.４０± ５３９.５０∗ ４.７８
Ｇ５７￣４１ (ｐＨＧ￣ｈｒｐＧ) １４０５１.０３±１０８０.６０∗ ３.３１
ＷＴ (ｐＨＧ２￣ｈｒｐＧ) ａ １９３２.９２± １５１.４４ １.００
Ｇ１９￣１４ (ｐＨＧ２￣ｈｒｐＧ) ４２１０.７１± ３４７.５９∗ ２.１７
Ｇ２４￣４６ (ｐＨＧ２￣ｈｒｐＧ) ３６０７.７６± ３６３.０９∗ １.８７
Ｇ４８￣２２ (ｐＨＧ２￣ｈｒｐＧ) ４０６２.６５± ９３.７６∗ ２.１０
Ｇ５７￣４１ (ｐＨＧ２￣ｈｒｐＧ) ２９５４.３９± ５９５.８２∗ １.５３
ＷＴ (ｐＨＧ２) １２０.３２± ３５.３３ ０.０６
Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｔ ４ ｈ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ＸＯＭ３ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ. Ｖａｌｕｅｓ ａｒｅ ａｎ ａｖｅｒａｇｅ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ
ｗｉｔｈ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ (ＳＤ) . Ｓｉｍｉｌａｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｗｏ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ. Ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ. Ａｓｔｅｒｉｓｋｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ａｖｅｒａｇｅ ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ＷＴ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｍｕ￣
ｔａｎｔｓ (Ｐ< ０.０５ꎬ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ) . Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ＯＤ６００ ＝０.５ ( ａ) ｏｒ ＯＤ６００ ＝０.３( ｂ) .
３３１
植物病理学报 ４５卷
活性的定性和定量测定(图 １￣Ｂ、表 ２)ꎮ 结果显
示ꎬ定性和定量测定结果一致ꎬ与野生型菌株相比ꎬ
Ｇ２４￣４６、Ｇ４８￣２２、Ｇ１９￣１４ 和 Ｇ５７￣４１ 的 ＧＵＳ 活性明
显增加(表 ２)ꎮ 同时ꎬ荧光定量 ＰＣＲ 的结果也显
示ꎬｈｒｐＧ的 ｍＲＮＡ在这 ４个突变体中也显著增加
(图 １￣Ｃ)ꎮ
２.２ 突变体与非寄主烟草互作时ꎬｈｒｐＧ的诱导表
达情况
在植物病原黄单胞菌中已证实 ｈｒｐ 基因是病
原菌与植物接触时诱导表达的[４ꎬ ８]ꎮ 为验证调控
子突变体与非寄主植物互作时ꎬ ｈｒｐＧ 基因的表达
是否增加ꎬ将 Ｇ２４￣４６、Ｇ４８￣２２、Ｇ１９￣１４和 Ｇ５７￣４１携
带 ｐＨＧ２￣ｈｒｐＧ质粒的突变体菌液注射到非寄主烟
草叶片中ꎬ选取不同的时间段(０.３、１、４、６ 和 ８ ｈ)ꎬ
利用叶碟染色法ꎬ观察 ｈｒｐＧ 的表达情况ꎮ 结果显
示ꎬ在选取的 ５ 个不同时间点ꎬ根据叶片蓝色深浅
判断ꎬ与野生型菌株相比ꎬｈｒｐＧ在 ４ 个突变体中的
表达明显增强(图 ２)ꎻ所有待测菌株中ꎬｈｒｐＧ的表
达在互作 １~３ ｈ之间逐渐增强ꎬ在互作４~６ ｈ后达
到最高值ꎬ第 ８ ｈ 时ꎬ表达略有下降(图 ２)ꎮ 表明
在不同诱导条件下(如碳源和植物源信号)ꎬ与野
生型菌株相比ꎬ ｈｒｐＧ 的表达在 Ｇ２４￣４６、Ｇ４８￣２２、
Ｇ１９￣１４和 Ｇ５７￣４１中都明显增强ꎬ进一步证明 ４ 个
突变体中是因转座子的插入而导致 ｈｒｐＧ 基因转
录表达发生改变ꎮ
２.３ ｈｒｐＧ调控子突变体中转座子插入位点分析
通过电转化方式将 ｍｉｎｉＨｉｍａｒ ＲＢ１ 转座子随
机插入细菌的染色体 ＤＮＡ 中ꎬ可能造成多个位点
的插入ꎬ为了明确转座子是否为单一位点插入ꎬ提
取这 ４个突变体的 ｇＤＮＡꎬ经过 Ｐｓｔ Ι 酶切ꎬ以转座
子中编码 ｎｐｔＩＩ抗性基因的 ＤＮＡ片段为探针ꎬ进行
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析ꎮ 结果显示ꎬ所有突变体中转座
子都以单一位点形式插入染色体中(图 ３￣Ａ)ꎬ表明
这 ４个突变体是单一位点插入造成的突变ꎮ
Ｆｉｇ. １ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｒｐＧ ｉｎ ＷＴ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ ＸＯＭ３
Ａ: Ｓｋｅｔｃｈ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｈｒｐＧ∷ｇｕｓＡ ｗｉｔｈ ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ (Ｔ１) ４ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ. Ｔｈｅ ｂｌａｃｋ ｂｏｘｅｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ Ｔ１ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒꎬ
ｔｈｅ ｇｒａｙ ｂｏｘｅｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ ｈｒｐＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒꎻ Ｂ: ＧＵＳ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｒｐＧ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＷＴ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ
ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ＸＯＭ３ ｂｙ Ｘ￣ｇｌｕｃ ｓｔａｉｎｉｎｇ. Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ＸＯＭ３ ｆｏｒ ４ ｈꎬ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｘ￣ｇｌｕｃ ｗａｓ ａｄｄｅｄ
ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ａｔ ｆｉｎａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ０.１ ｍｇ / ｍＬ. Ｔｈｅ ｐｉｃｔｕｒｅ ｗａｓ ｔａｋｅｎ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｔｕｂｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｉｎ ３７℃ ｆｏｒ １ ｈ.
Ｃ: Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒａｔｉｏｓ ｏｆ ｈｒｐＧ ｍＲＮＡｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ＷＴ. Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ
ｇｒｏｗｎ ｉｎ ＸＯＭ３ ｆｏｒ ４ ｈ. Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｏｆ ｈｒｐＧ ｇｅｎｅｓ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＲＴ￣ＰＣＲ.
Ａｓｔｅｒｉｓｋｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ
ｏｆ ｔｈｅ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ (Ｐ<０.０１) . Ｓｉｍｉｌａｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｗｏ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ.
４３１
２期 王淼啸ꎬ等:水稻白叶枯病菌 ｈｒｐＧ调控基因的鉴定
Ｆｉｇ. ２ Ｄｙｎａｍｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｒｐＧ ｉｎ ＷＴ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ
ｍｕｔａｎｔｓ ｗｈｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｎｏｎｈｏｓｔ ｔｏｂａｃｃｏ
ＷＴ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ＮＢ ｍｅｄｉｕｍ ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ａｎｄ ｒｅｓｕｓｐｅｎｄｅｄ ｉｎ ｗａｔｅｒ ｔｏ ＯＤ６００ ＝ １ꎬ
ｔｈｅｎ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｔｏｂａｃｃｏ ｌｅａｖｅｓ ｂｙ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ. Ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｈｏｕｒｓ ｐｏｓｔ￣ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎꎬ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｌｅａｆ ｄｉｓｋｓ
(０.８ ｃｍ ｉｎ ｄｉａｍｅｔｅｒ) ｗｅｒｅ ｓｔａｉｎｅｄ ｕｓｉｎｇ ｉｎ ｓｉｔｕ ＧＵＳ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ. Ｆｏｒ ｅａｃｈ ｓｔｒａｉｎꎬ ｔｈｒｅｅ ｌｅａｆ ｄｉｓｋｓ ｗｅｒｅ ｃｈｏｓｅｎ
ｆｏｒ ＧＵＳ ｓｔａｉｎｉｎｇꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｄｉｓｋ ｗａｓ ｓｈｏｗｎ ｈｅｒｅ. Ｓｉｍｉｌａｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｗｏ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ.
Ｆｉｇ. ３ Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ
Ａ: Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｐｙ ｏｆ Ｔｎ５ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｉｎ ｍｕｔａｎｔｓ. Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡｓ ｏｆ ｔｈｅ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ
ｍｕｔａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ Ｐｓｔ Ｉꎬ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ａｎｄ ｆｉｘｅｄ ｏｎ ａ ｎｙｌｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ. Ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｗａｓ ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ
ｎｐｔＩＩ ＤＮＡ ａｓ ｔｈｅ ｐｒｏｂｅ. Ｌａｎｅ ＷＴ: Ｔｈｅ ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ＰＸＯ９９Ａꎻ Ｌａｎｅ Ｍ: ＥｃｏＴ１４λ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ (ＴａＫａＲａ) ꎻ
Ｂ: Ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔｓ. Ｂｌａｃｋ ｔｒｉａｎｇｌｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈｅ ｌｏｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔｓ.
Ａｒｒｏｗｓ ａｂｏｖｅ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｐｔＩＩ ｇｅｎｅ.
Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＰＸＯ９９Ａ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ.
５３１
植物病理学报 ４５卷
为了明确转座子插入位点ꎬ根据 ｍｉｎｉＨｉｍａｒ
ＲＢ１能从染色体中分离的特性[１６]ꎬ将获得的突变
体进行基因组 ＢａｍＨ Ι 酶切和自环化ꎬ获得转座子
带有旁侧序列的克隆ꎮ 通过序列测定ꎬ利用已公布
的 ＰＸＯ９９Ａ基因组信息进行分析(ＧｅｎＢａｎｋ: ＮＣ＿
０１０７１７.１)ꎬ明确突变体中转座子的插入位点(图 ３￣
Ｂ)ꎮ 突变体 Ｇ１９￣１４中转座子插入在 ｗｘｏＢ基因的
第 ８０１个碱基处ꎬｗｘｏＢ编码糖基转移酶 (ｇｌｙｃｏｓｙｌ￣
ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ)ꎬ 与脂多糖的合成有关[１７]ꎮ 突变体
Ｇ２４￣４６中ꎬ转座子插入 ｍｉｎＤ基因的第 ３９９ 个碱基
处ꎬｍｉｎＤ 基因与细胞的分裂有关[１８]ꎮ 突变体
Ｇ４８￣２２中ꎬ转座子插入在 ｐｉｌＡ 基因的第 ３９１ 个碱
基处ꎬ该基因编码 ＩＶ型鞭毛的基体部分[１９~２１]ꎮ 突
变体 Ｇ５７￣４１中ꎬ转座子插入在 ｍｅｔＢ 基因的第 １８５
个碱基处ꎬ该基因编码一种胱硫醚￣γ￣裂合酶ꎬ参与
半胱氨酸的合成[２２ꎬ ２３]ꎮ 在稻黄单胞菌中ꎬ这些基
因负调控 ｈｒｐＧ基因的转录表达ꎬ属首次报道ꎮ 这
些新的调控子基因的鉴定ꎬ将为进一步解析稻黄单
胞菌 ｈｒｐ调控网络提供新的线索ꎮ
２.４ ｈｒｐＧ调控子突变体在水稻上的毒性测定
ｈｒｐＧ 为主要的 ｈｒｐ 调控基因ꎬＨｒｐＧ 正调控
ｈｒｐＸ基因的表达ꎬＨｒｐＸ 调控编码 ＩＩＩ 型分泌系统
核心组分 ｈｒｃ￣ｈｒｐ￣ｈｐａ 基因的表达ꎬｈｒｐＧ 基因缺
失ꎬＸｏｏ丧失在寄主水稻上的致病性[５ꎬ ６]ꎮ 为了检
测 Ｇ２４￣４６、Ｇ４８￣２２、Ｇ１９￣１４ 和 Ｇ５７￣４１ 突变体在水
稻上的毒性ꎬ通过剪叶接种法将这 ４个突变体接种
在感病水稻品种 ＩＲ２４ 上ꎬ２ 周后统计病斑长度ꎮ
结果显示ꎬ４ 个突变体在水稻上的毒性显著降低
(图 ４)ꎬ其中 Ｇ４８￣２２、Ｇ１９￣１４和 Ｇ５７￣４１在 ＩＲ２４ 上
的病斑长度不足野生型菌株引起病斑长度的
２５％ꎬ根据这些结果推测 ｈｒｐＧ 表达的增高可能会
影响 Ｘｏｏ菌株在水稻上的毒性ꎬ在 Ｘｏｏ 中 ｈｒｐＧ 基
因的表达可能存在一个精细的调控模式ꎬ其表达水
平需要维持在限定的范围ꎬ表达的增加或者降低都
会显著影响下游 ｈｒｐ基因的表达ꎬ从而影响病原菌
在寄主水稻上的毒性ꎮ
３ 讨论
本研究利用 ｈｒｐＧ∷ｇｕｓＡ 为报道基因ꎬ构建了
转座子突变体库ꎬ筛选获得 ４ 个候选 ｈｒｐＧ 负调控
子突变体ꎮＧＵＳ活性测定和荧光定量ＰＣＲ结果
Ｆｉｇ. ４ Ｌｅｓｉｏｎ ｌｅｎｇｔｈ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ＷＴ ａｎｄ
ｍｕｔａｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｒｉｃｅ ＩＲ２４
Ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ＩＲ２４ ｗｅｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＷＴ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔｓ ｂｙ
ｌｅａｆ￣ｃｌｉｐｐｉｎｇ. Ｔｈｅ ｌｅｓｉｏｎ ｌｅｎｇｔｈｓ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｉｎ ｃｅｎｔｉｍｅｔｅｒ
ａｔ １５ ｄａｙｓ ｐｏｓｔ￣ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ. Ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ. Ａｓｔｅｒｉｓｋｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｌｅｓｉｏｎ ｌｅｎｇｔｈ ｂｅｔｗｅｅｎ ＷＴ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌｅｖａｎｔ
ｍｕｔａｎｔ (Ｐ < ０.０１ꎬ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ) .
均显示ꎬ这些突变体中 ｈｒｐＧ 表达显著增强ꎮ 在
Ｇ２４￣４６、Ｇ４８￣２２、Ｇ５７￣４１和Ｇ１９￣１４中ꎬ转座子分别插
入在 ｍｉｎＤ、 ｐｉｌＡ、ｍｅｔＢ 和 ｗｘｏＢ 基因中ꎮ 在稻黄单
胞菌中ꎬ这些基因涉及对 ｈｒｐＧ的转录表达ꎬ为解析
稻黄单胞菌 ｈｒｐＧ上游调控网络提供了新的线索ꎮ
进行基因转录表达研究ꎬ启动子探针载体
(ｐｒｏｍｏｔｅｒ￣ｐｒｏｂｅ￣ｖｅｃｔｏｒ ) 是重要的遗传操作工
具[１５]ꎬ在这些载体的多克隆位点上游一般含有终
止子片段ꎬ其能够消除载体旁侧序列通读转录
( ｒｅａｄ￣ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ)造成报道基因高背景
水平表达的干扰[１５ꎬ ２４ꎬ ２５]ꎮ 本研究最初利用 ｐＨＧ￣
ｈｒｐＧ载体筛选突变体ꎬ通过蓝色的深浅筛选 ＧＵＳ
活性显著变化的菌落ꎬ获得候选的突变体ꎮ 在
ｐＨＧ￣ｈｒｐＧ载体上ꎬ ｈｒｐＧ∷ｇｕｓＡ 融合元件直接构
建在 ｐＨＭ１ 载体的多克隆位点处ꎬｈｒｐＧ 启动子可
能存在通读转录的干扰ꎮ 为了消除这个干扰ꎬ本研
究在 ｈｒｐＧ启动子的上游连入(Ｔ１) ４终止片段ꎬ获
得 ｐＨＧ２￣ｈｒｐＧ 载体ꎮ ｈｒｐＧ 启动子活性测定的结
果显示(表 ２)ꎬ在相同菌液浓度下ꎬ与含有 ｐＨＧ￣
ｈｒｐＧ 质粒的菌株(野生型或突变体)相比ꎬ含有
ｐＨＧ２￣ｈｒｐＧ质粒的菌株 ＧＵＳ活性明显降低ꎬ暗示ꎬ
ｐＨＧ￣ｈｒｐＧ载体的 ｈｒｐＧ启动子上游存在通读转录
的干扰ꎬｐＨＧ２￣ｈｒｐＧ载体上的(Ｔ１) ４终止元件能有
６３１
２期 王淼啸ꎬ等:水稻白叶枯病菌 ｈｒｐＧ调控基因的鉴定
效消除这个干扰ꎮ
利用不含有抗生素的 ＮＢ 培养基对突变体进
行连续 ３代的培养ꎬ发现大部分突变体 １０％以上的
细胞均能丧失抗性ꎬ有些菌株(如 Ｇ２４￣４６)丧失抗
性的比率达 ３８％(未发表)ꎮ 这表明ꎬＸｏｏ 菌株在
无选择压力的情况下ꎬ能够丢失外源质粒ꎬ这一发
现为进行含有外源质粒的稻黄单胞菌遗传操作ꎬ提
供了新的参考点ꎮ
植物病原黄单胞菌 ｈｒｐ 基因一般受植物源信
号诱导表达[４ꎬ ８]ꎮ 本研究中ꎬ非寄主烟草细胞能够
有效诱导 ｈｒｐＧ的表达ꎬ且表达随时间延续呈现动
态变化ꎮ 对于野生型菌株ꎬ与烟草细胞互作的 １ ｈ
~ ３ ｈ之间ꎬｈｒｐＧ的表达逐渐增加ꎬ在 ４ ｈ~６ ｈ之间
ｈｒｐＧ的表达达到最高值ꎬ在 ６ ｈ~８ ｈ之间ꎬｈｒｐＧ的
表达逐渐减弱ꎮ 对于突变体菌株ꎬ与烟草细胞互作
２０ ｍｉｎ后ꎬｈｒｐＧ的表达明显比野生型菌株增强ꎻ在
互作 １ ｈ后ꎬ增强更加明显ꎻ但是在 ４ ｈ ~ ６ ｈ 之间ꎬ
没有观察到明显的增加ꎮ 这暗示ꎬ在与非寄主植物
互作时ꎬｈｒｐ基因可能在前期(１ ｈ~ ３ ｈ)诱导表达ꎬ
编码 ＩＩＩ 型分泌系统ꎬ分泌效应蛋白ꎬ激发随后的
ＨＲ反应ꎻ在互作的后期ꎬ随着 ｈｒｐ 基因表达的减
弱ꎬＩＩＩ型分泌系统的效用也可能随之降低ꎮ Ｐｅｎｇ
等[２６]也认为ꎬＤｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ ３９３７ 的 Ｔ３ＳＳ 在与
寄主植物的早期互作中起主要作用ꎬ在后期的软腐
过程中不是必需的[２６]ꎮ
根据转座子插入的位点分析ꎬ在 Ｇ２４￣４６、Ｇ４８￣
２２、Ｇ５７￣４１ 和 Ｇ１９￣１４ 中ꎬ转座子都是单一位点插
入ꎬ分别插入在 ｍｉｎＤ、 ｐｉｌＡ、ｍｅｔＢ和 ｗｘｏＢ 基因中ꎬ
这表明在 Ｘｏｏ中 ｍｉｎＤ、 ｐｉｌＡ、ｍｅｔＢ和 ｗｘｏＢ基因的
突变能够增加 ｈｒｐＧ 基因的表达ꎮ ｍｅｔＢ 基因编码
一种胱硫醚￣γ￣裂合酶ꎬ 参与半胱氨酸的 合
成[２２ꎬ ２３]ꎮ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ 结果显示ꎬｍｅｔＢ 基因突
变ꎬｈｒｐＧ ｍＲＮＡ的水平较野生型菌株提高了 ７倍ꎬ
但是 ＧＵＳ定量测定结果显示ꎬｍｅｔＢ 基因突变ꎬｈｒ￣
ｐＧ 的转录表达仅提高了 ０.５ 倍ꎬ推测 ｍｅｔＢ 基因可
能通过转录后机制影响 ｈｒｐＧ 的 ｍＲＮＡ 水平ꎮ 在
Ｇ１９￣１４中ꎬ转座子插入在 ｗｘｏＢ基因中ꎬｗｘｏＢ 基因
与脂多糖的合成有关[１７]ꎮ 在 Ｇ１９￣１４ 和 Ｇ５７￣４１ 突
变体中 ｈｒｐＧ基因的表达较野生型菌株明显增加ꎬ
且这 ２个突变体在感病水稻 ＩＲ２４上的毒性明显减
弱ꎮ 前期工作显示ꎬ在野生型 Ｘｏｏ 菌株中过量表
达 ｈｒｐＧ基因造成病原菌在感病水稻 ＩＲ２４ 上的毒
性下降(未发表)ꎬ因此我们推测高表达 ｈｒｐＧ 可能
影响一些 ＨｒｐＧ 负调控的 ｈｒｐ 基因(如 ｈｒｃＣ、ｈｒｃＴ
等)ꎬ从而影响 Ｔ３ＳＳ 的组装和效应蛋白的分泌ꎮ
ＭｅｔＢ和ＷｘｏＢ涉及的代谢途径是否直接影响病菌
的毒性ꎬ ｈｒｐＧ 的高表达是否能够引起病原菌的毒
性下降ꎬ有待于进一步探究ꎮ 本研究首次报道了
ｍｉｎＤ和 ｐｉｌＡ功能已知的基因与 Ｘｏｏ 的 ｈｒｐ 调控网
络有关ꎮ ｍｉｎＤ和 ｐｉｌＡ分别涉及细菌的分裂和 ＩＶ型
鞭毛(ＩＶ ｔｙｐｅ ｆｉｍｂｒｉａｅ)的形成[１８~２１]ꎬ这些基因的突
变如何引起 ｈｒｐＧ表达的增加ꎬ有待于进一步研究ꎮ
在 Ｇ２４￣４６、Ｇ４８￣２２、Ｇ５７￣４１ 和 Ｇ１９￣１４ 中ꎬ转座子的
插入是否会造成极性影响ꎬ需要通过构建无标记缺
失的突变体和功能互补试验进行进一步的确定ꎮ
参考文献
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(５):３０３－３２４.
[２] Ｓｕｇｉｏ Ａꎬ Ｙａｎｇ Ｂꎬ Ｗｈｉｔｅ Ｆ Ｆ. Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ
ｈｒｐＦ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｐｅｎｉｎｓｕｌａ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ
ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ [Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ
２００５ꎬ １８９(６):５４６－５５４.
[３] Ｔｉａｎ Ｄꎬ Ｙｉｎ Ｚ. Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ａｖｒＸａ２７ ｉｎ ｒｉｃｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｒ ｇｅｎｅ Ｘａ２７ ｃｏｎｆｅｒｓ ｅｎ￣
ｈａｎｃｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ
ｓｔｒａｉｎｓ [ Ｊ ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００９ꎬ １０
(１):２９－３９.
[４] Ｂüｔｔｎｅｒ Ｄꎬ Ｂｏｎａｓ Ｕ. Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｘａｎ￣
ｔｈｏｍｏｎａｓ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ [ Ｊ] . ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
Ｒｅｖｉｅｗｓꎬ ２０１０ꎬ ３４ (２):１０７－１３３.
[５] Ｔｓｕｇｅ Ｓꎬ Ｎａｋａｙａｍａ Ｔꎬ Ｔｅｒａｓｈｉｍａ Ｓ. Ｇｅｎｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｒｐ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅ ｈｒ￣
ｐＧ ｉｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙꎬ ２００６ꎬ １８８ (１１):４１５８－４１６２.
[６] Ｔｓｕｇｅ Ｓꎬ Ｔｅｒａｓｈｉｍａ Ｓꎬ Ｆｕｒｕｔａｎｉ Ａ. Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ
ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｂａｓｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｉｓ￣ａｃｔｉｎｇ
ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ ｏｆ ＨｒｐＸｏ ｒｅｇｕｌｏｎｓ ｉｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ [Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙꎬ ２００５ꎬ
１８７ (７):２３０８－２３１４.
[７] Ｗｅｎｇｅｌｎｉｋ Ｋꎬ Ｒｏｓｓｉｅｒ Ｏꎬ Ｂｏｎａｓ Ｕ. Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ
ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅ ｈｒｐＧ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ.
ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｌｌ ｈｒｐ
ｇｅｎｅｓ [Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙꎬ １９９９ꎬ １８１ (２１):
７３１
植物病理学报 ４５卷
６８２８－６８３１.
[８] Ｍｏｌｅ Ｂ Ｍꎬ Ｂａｌｔｒｕｓ Ｄ Ａꎬ Ｄａｎｇｌ Ｊ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｇｌｏｂａｌ
ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｉｎ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ
ｂａｃｔｅｒｉａ [Ｊ] . Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００７ꎬ １５ (８):
３６３－３７１.
[９] Ａｎ Ｓ Ｑꎬ Ｌｕ Ｇ Ｔꎬ Ｓｕ Ｈ Ｚꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｍｕｔａｇｅｎ￣
ｅｓｉｓ ｏｆ ａｌｌ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｇｎｔＲ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ＧｎｔＲ ｆａｍｉｌｙ ｔｒａｎ￣
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ
ａｎｄ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ [ Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃ￣
ｔｉｏｎｓꎬ ２０１１ꎬ ２４ (９):１０２７－１０３９.
[１０] Ｌｉ Ｒ Ｆꎬ Ｌｕ Ｇ Ｔꎬ Ｌｉ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｕｔａ￣
ｔｉｖｅ ｃｏｇｎａｔｅ ｓｅｎｓｏｒ ｋｉｎａｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｗｏ￣ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｒｅ￣
ｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ＨｒｐＧꎬ ａ ｋｅｙ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｒｐ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ
ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ [ Ｊ ] . Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ
２０１３ꎬ ｄｏｉ: １０.１１１１ / １４６２－２９２０.１２２０７.
[１１] Ｉｓｌａｍ Ｍ Ｒꎬ Ｋａｂｉｒ Ｍ Ｓꎬ Ｈｉｒａｔａ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ. Ａ ｌｅｕｃｉｎｅ￣ｒｉｃｈ
ｐｒｏｔｅｉｎꎬ ＬｒｐＸꎬ ｉｓ ａ ｎｅｗ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｈｒｐ ｇｅｎｅｓ ｉｎ
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ [ Ｊ ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００９ꎬ ７５ (１): ６６－７１.
[１２] Ｉｓｌａｍ Ｍ Ｒꎬ Ｈｉｒａｔａ Ｈꎬ Ｔｓｕｇｅ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｅｌｆ￣ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆ ａ ｎｅｗ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｌｅｕｃｉｎｅ￣
ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ＬｒｐＸ ｉｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ
[Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００９ꎬ ７５
(１): ５６－６５.
[１３] Ｌｉ Ｙ Ｒꎬ Ｃｈｅ Ｙ Ｚꎬ Ｚｏｕ Ｈ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｈｐａ２ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｂｙ
ＨｒｐＦ ｔｏ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ
ａｃｔｉｖａｔｏｒ￣ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｉｎｔｏ ｒｉｃｅ ｆｏｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ [ Ｊ] .
Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２０１１ꎬ ７７
(１１):３８０９－３８１８.
[１４] Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｃ Ｍꎬ Ｗｈｉｔｅ Ｆ Ｆꎬ Ｃｈｏｉ Ｓ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ￣
ｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ａｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ [ Ｊ ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ
Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ １９９２ꎬ ５ (６):４５１－４５９.
[１５] Ｍｉｌｌｅｒ Ｗ Ｇꎬ Ｌｅｖｅａｕ Ｊ Ｈꎬ Ｌｉｎｄｏｗ Ｓ Ｅ. Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｇｆｐ
ａｎｄ ｉｎａＺ ｂｒｏａｄ￣ｈｏｓｔ￣ｒａｎｇｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ￣ｐｒｏｂｅ ｖｅｃｔｏｒｓ [Ｊ] .
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ ２０００ꎬ １３ (１１):
１２４３－１２５０.
[１６] Ｂｏｕｈｅｎｎｉ Ｒꎬ Ｇｅｈｒｋｅ Ａꎬ Ｓａｆｆａｒｉｎｉ Ｄ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｓｈｅ￣
ｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓꎬ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍａｒｉｎｅｒ ｔｒａｎｓｐｏ￣
ｓｏｎ [ Ｊ] . Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ
２００５ꎬ ７１ (８):４９３５－４９３７.
[１７] Ｐａｔｉｌ Ｐ Ｂꎬ Ｓｏｎｔｉ Ｒ Ｖ. Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｓｕｇｇｅｓｔｉｖｅ ｏｆ
ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｔ ａ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ( ｌｐｓ)
ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｏｃｕｓ ｉｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅꎬ
ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｅａｆ ｂｌｉｇｈｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｏｆ ｒｉｃｅ [ Ｊ] . ＢＭＣ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００４ꎬ ４(１):４０
[１８] Ｎｇｕｙｅｎ Ｔ Ｈꎬ Ｋｕｍａｇａｉ Ｔꎬ Ｍａｔｏｂａ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｎＤ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ ＡＴＣＣ２５２３３ [ Ｊ ]. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ ２００８ꎬ １０６ (３):３０３－３０５.
[１９] Ｓｕ Ｗ Ｃꎬ Ｔｕｎｇ Ｓ Ｙꎬ Ｙａｎｇ Ｍ Ｋꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｈｅ ｐｉｌＡ ｇｅｎｅ
ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃｉｔｒｉ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ
ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ ｃｆ. [ Ｊ ] .
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓꎬ １９９９ꎬ ２６２ (１):２２－２６.
[２０] Ｔａｈａ Ｍ Ｋꎬ Ｌａｒｒｉｂｅ Ｍꎬ Ｄｕｐｕｙ Ｂꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｉｌＡꎬ
ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅꎬ
ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ
１９９２ꎬ １７４ (１８):５９７８－５９８１.
[２１] ＯｒｎｄｏｒｆｆＰ Ｅꎬ Ｓｐｅａｒｓ Ｐ Ａꎬ Ｓｃｈａｕｅｒ Ｄꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｗｏ
ｍｏｄｅｓ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｉｌＡꎬ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｙｐｅ １
ｐｉｌｉｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ[ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ
１９８５ꎬ １６４ (１):３２１－３３０.
[２２] Ｋｏｎｇ Ｙꎬ Ｗｕ Ｄꎬ Ｂａｉ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ. Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ￣
ｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ
γ￣ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ ２００８ꎬ １４３(１):５９－６８.
[２３] Ｕｒｂａｎｏｗｓｋｉ Ｍ Ｌꎬ Ｐｌａｍａｎｎ Ｌ Ｓꎬ Ｓｔａｕｆｆｅｒ Ｇ Ｖ.
Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔＢ ｇｅｎｅ ｏｆ
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＬＴ２ [ Ｊ ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙꎬ １９８７ꎬ １６９ (１):１２６－１３０.
[２４] Ｓｉｍｏｎ Ｒꎬ Ｑｕａｎｄｔ Ｊꎬ Ｋｌｉｐｐ Ｗ. Ｎｅｗ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ
ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｔｎ５ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃｏｎｓꎬ
ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｐｅｒｏｎ ｆｕｓｉｏｎｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎ
ｇｒａｍ￣ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ [Ｊ] . Ｇｅｎｅꎬ １９８９ꎬ ８０ (１):１６１
－１６９.
[２５] Ｓｉｍｏｎｓ Ｒ Ｗꎬ Ｈｏｕｍａｎ Ｆꎬ Ｋｌｅｃｋｎｅｒ Ｎ. Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｉｎ￣
ｇｌｅ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｃｏｐｙ ｌａｃ￣ｂａｓｅｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ
ａｎｄ ｏｐｅｒｏｎ ｆｕｓｉｏｎｓ [Ｊ] . Ｇｅｎｅꎬ １９８７ꎬ ５３ (１):８５－９６.
[２６] Ｐｅｎｇ Ｑꎬ Ｙａｎｇ Ｓꎬ Ｃｈａｒｋｏｗｓｋｉ Ａ Ｏꎬ ｅｔ ａｌ. Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
ｂｅｈａｖｉｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｓｐＥ ａｎｄ ｐｅｌＤ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ
Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ ３９３７ [ Ｊ ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣
Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ ２００６ꎬ １９ (４):４５１－４５７.
责任编辑:于金枝
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