全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(5): 482鄄485(2011)
收稿日期: 2010鄄12鄄12; 修回日期: 2011鄄07鄄15
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30860163;31060237); “973冶前期研究专项(2010CB134501)
通讯作者: 张仲凯, 研究员, 主要从事植物病毒学研究; Tel: 0871鄄5183204, E鄄mail: zhongkai99@gmail. com。
第一作者: 尹跃艳(1982 - ),女,云南个旧人,研究实习员,硕士,主要从事植物病理学方面的研究; E鄄mail: yinyy0324@163. com。
番茄环纹斑点病毒核壳体蛋白
抗血清制备及其血清学特性分析
尹跃艳1,3, 董家红1,2, 程晓非1, 李婷婷1,2, 丁 铭1,2, 方 琦1,2, 张仲凯1,2*
( 1云南省农业生物技术重点实验室, 昆明 650223; 2云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所, 昆明 650223;
3云南省农业科学院高山经济植物研究所, 丽江 674100)
摘要: 番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus, TZSV)是番茄斑萎病毒属的一个新种,对云南番茄、辣椒生产造成严
重危害。 用 RT鄄PCR从感病番茄中扩增得到长度为 837 bp TZSV的核壳体蛋白基因(N 基因),将其克隆到原核表达载体
pET鄄28a( + ),获得重组原核表达载体 pET鄄TZSV鄄N,在大肠杆菌 BL21 中表达,SDS鄄PAGE 分析表明,该载体高效表达 33
kDa的融合蛋白;以纯化的融合蛋白作为抗原免疫家兔制备 TZSV 核壳体蛋白(N蛋白)的多克隆抗体,间接酶联免疫测定
(ID鄄ELISA)表明效价为 1 / 6 000;Western blot分析表明,该抗血清能与西瓜银色斑驳病毒(WSMoV)血清组的辣椒褪绿病
毒(CaCV)反应,而与番茄斑萎病毒(TSWV)、凤仙花坏死斑病毒( INSV)无血清交叉反应,说明获得的抗血清能用于 WS鄄
MoV血清组成员的检测,TZSV属于WSMoV血清组成员。
关键词: 番茄环纹斑点病毒; 核壳体蛋白; 原核表达; 血清学相关性
Antiserum preparation and serological characterization of the nucleocapsid protein
of Tomato zonate spot virus 摇 YIN Yue鄄yan1,3, DONG Jia鄄hong1,2, CHENG Xiao鄄fei1, LI
Ting鄄ting1,2, DING Ming1,2, FANG Qi1,2, ZHANG Zhong鄄kai1,2 摇 ( 1 Yunnan Province Key Laboratory of
Agricultural Biotechnology, Kunming 650223, China; 2 Institute of Biotechnology and Germplasm Resources,Yunnan Academy
of Agricultural Sciences, Kunming 650223, China; 3 Institute of Alpine Economic Plant, Yunnan Academy of Agricultural
Sciences, Lijiang 674100, China)
Abstract: Tomato zonate spot virus (TZSV), a new species of Tospovirus, was a serious constraint to toma鄄
to and chili production. The nucleocapsid protein gene (837 bp) of TZSV was amplified by RT鄄PCR, and
cloned into vector pET鄄28a for prokaryotic expression. The recombinant plasmid of pET鄄TZSV鄄N was ob鄄
tained and transformed into Escherichia coli BL21. The result of SDS鄄PAGE showed 33 kDa fusion protein
was expressed in high level. The fusion protein was purified and used as antigen to prepare the polyclonal anti鄄
serum in rabbit. The titer of antiserum was 1 / 6 000 estimated by ID鄄ELISA and Western blot results showed
that the obtained antiserum could react with Capsicum chlorosis virus (CaCV), one member of Watermelon
silver mottle virus (WSMoV) serogroup, but not react with Impatiens necrotic spot virus ( INSV) and Tomato
spotted wilt virus (TSWV) . The results indicated that the antiserum could be used to detect the members of
the WSMoV serogroup, and TZSV was serologically relatived to the WSMoV serogroup.
Key words: TZSV; nucleocapsid protein; prokaryotic expression; serological relationship
中图分类号: S432. 41摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 0412鄄0914(2011)05鄄0482鄄04
摇
摇 5 期 摇 摇 尹跃艳,等:番茄环纹斑点病毒核壳体蛋白抗血清制备及其血清学特性分析
摇 摇 番茄斑萎病毒属(Tospovirus)是布尼亚病毒科
(Bunyaviridae)唯一侵染植物的属。 Tospovirus 病
毒粒子为球形,被膜,直径约 80 ~ 120 nm,病毒基
因组为三分体单链 RNA,即 L、M、S RNA[1]。 目前
该属已报道 20 种病毒[2 ~ 4]。 Tospovirus 病毒之间
有着复杂的血清学关系。 De Avila 等[5]曾将 To鄄
spovirus划分为玉 - 吁 5 个血清组或血清型。 但
随着一些新报道的种不能划归这 5 个血清组,因此
Moyer等[6]建议以病毒名称来命名血清组,即番茄
斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus, TSWV)血清
组,包括 TSWV、花生环斑病毒(Groundnut ringspot
virus, GRSV)、番茄褪绿病毒 ( Tomato chlorotic
spot virus, TCSV)、菊花茎坏死病毒(Chrysanthe鄄
mum stem necrosis virus, CSNV)、西葫芦致死褪绿
病毒(Zucchini lethal chlorosis virus, ZLCV)5 种病
毒;西瓜银色斑驳病毒(Watermelon silver mottle vi鄄
rus, WSMoV)血清组,包括 WSMoV、花生顶芽坏
死病毒(Groundnut bud necrosis virus, GBNV)、西
瓜芽坏死病毒 (Watermelon bud necrosis virus,
WBNV)、辣椒褪绿病毒(Capsicum chlorosis virus,
CaCV)、马蹄莲褪绿斑病毒 (Calla lily chlorotic
spot virus, CCSV) 5 种病毒;鸢尾黄斑病毒 ( Iris
yellow spot virus, IYSV)血清组,包括 IYSV 和番
茄黄斑病毒(Tomato yellow spot virus, TYRV);以
及由凤仙花坏死斑病毒( Impatiens necrotic spot vi鄄
rus, INSV)、花生黄斑病毒(Groundnut yellow spot
virus, GYSV)、花生扇形褪绿斑病毒(Groundnut
chlorotic fan鄄spot virus, GCFV)和甜瓜黄斑病毒
(Melon yellow spot virus, MYSV)4 种病毒与属内
其他病毒无血清学相关性,被称为单个血清型[7]。
Tospovirus病毒分布广泛,其代表种 TSWV,每年
在世界范围内造成数十亿美元的损失,被列为世界
上危害性最大的 10 种植物病毒之一[8]。
番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,
TZSV)为 Tospovirus的一个新种[9],该病毒可侵染
5 个科的 20 多种植物,其既可通过汁液传播,也可
通过蓟马以持久增殖的方式进行传播。 近年来该
病毒引起的病害在云南昆明、玉溪、红河、楚雄等地
普遍发生,给上述地区番茄、辣椒及烟草生产带来
严重损失。 本研究通过原核表达 TZSV N 蛋白基
因,制备了高特异性的 TZSV N 蛋白抗血清,为明
确 TZSV的血清学关系和病害的快速诊断提供一
种便捷的方法。
1摇 材料与方法
1. 1摇 材料
1. 1. 1摇 感病样品摇 TZSV 病样分离自云南昆明感
病番茄,机械摩擦接种保存在黄烟(Nicotiana rus鄄
tia)上 。 CaCV、TSWV、INSV由本实验室保存。
1. 1. 2摇 质粒与菌株摇 原核表达载体 pET鄄28a( + )
和大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)由中国
农业大学于嘉林教授惠赠。
1. 1. 3摇 酶及试剂摇 pMD18鄄T Simple 载体、限制性
内切酶、Taq DNA聚合酶均购自 TaKaRa 公司,T4
连接酶购自 Promega公司,羊抗兔 IgG 购自 Sigma
公司,其余试剂均为国产分析纯。
1. 1. 4摇 引物摇 根据已获得序列(NC_010489)设计
N基因全序列引物,用于 TZSV N基因全序列的扩
增,引物合成由上海生工生物工程有限公司完成,
引物序列为:正向引物 ( 5忆鄄ACTTgaattcATGTC鄄
TAACGTCCGGAGTTTAAC鄄 3忆),反向引物(5忆鄄AA
CActcgagTTAAAAAGACAGATCATTGCTGCT鄄3忆)。
为便于克隆分别在 5忆端引物和 3忆端引物中插入酶
切位点 EcoR玉和 Xho玉。
1. 2摇 方法
1. 2. 1摇 TZSV N 基因的扩增及克隆 摇 参照 Dong
等[9]的方法提取感病番茄总 RNA,以提取的总
RNA为模板,反转录后 PCR 扩增病毒的 N 基因,
回收目的片段连接到 pMD18鄄T Simple 载体上,得
到重组质粒 pMD鄄TZSV鄄N,用 EcoR玉和 Xho玉双
酶切,回收目的片段连接到经同样酶切的表达载体
pET鄄28a( + ),转化 E. coli BL21,筛选阳性克隆,
碱裂解法提取质粒,再用 EcoR玉和 Xho玉双酶切
鉴定,得到与扩增片段相同大小的片段即成功构建
了原核表达载体 pET鄄TZSV鄄N。
1. 2. 2摇 融合蛋白基因的诱导表达、SDS鄄PAGE 分
析和纯化摇 将含有原核表达载体 pET鄄TZSV鄄N 的
单菌落接种于含卡那霉素(50 滋g / mL)的 LB培养
基中,经 1 mmol / L IPTG诱导表达后,分别于 0、2、
4、6 h取 1 mL菌液离心收集菌体,加入 200 滋L 的
2 伊 SDS蛋白上样缓冲液(0. 1 mol / L Tris鄄HCl、4%
SDS、1% b鄄巯基乙醇、20%甘油、0. 2%溴酚兰),液
氮反复冻融 3 次,沸水中煮沸 10 min,取 20 滋L
上样于5% 的浓缩胶和 12. 5% 的分离胶进行
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摇
植物病理学报 41 卷
SDS鄄PAGE电泳检测蛋白的表达情况。 将 SDS鄄
PAGE电泳后的凝胶置于冰冷的 0. 1 mol / L KCl
中显色,待条带清晰后,切下目的条带作为抗原免
疫家兔。
1. 2. 3摇 多抗血清的制备及效价测定摇 将回收的目
的条带经透析后,溶于 0. 9%的生理盐水中,第 1
次及第 2 次按 1 mg / mL的量与等体积的弗氏完全
佐剂及弗氏不完全佐剂混合免疫家兔,第 3、4 次为
耳缘静脉注射,免疫 4 次后收集抗血清。 抗血清按
1 / 500、1 / 1 000、1 / 3 000、1 / 5 000、1 / 6 000、1 / 8 000
进行梯度稀释,采用间接 ELISA 进行抗血清效价
的测定,具体参照Wang等[10]的方法。
1. 2. 4摇 抗血清特异性测定及 TZSV血清学特性分
析摇 抗血清特异性及 TZSV 血清学特性分析采用
Western blot 方法。 取 1 g 感病番茄叶片,液氮研
磨至粉末状,加入 100 滋L 2 伊 SDS 蛋白上样缓冲
液,取 20 滋L上样于 5%的浓缩胶和 12. 5%的分离
胶进行 SDS鄄PAGE 电泳,电泳结束后转移至硝酸
纤维素膜上,加入 TZSV抗血清(1 / 3 000 稀释)孵
育 1 h,随后加入碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔 IgG
(1 / 5 000 稀释),在 NBT / BCIP显色系统下显色至
条带清晰。
2摇 结果与分析
2. 1摇 原核表达载体的构建及在大肠杆菌内的
表达
以番茄病样总 RNA 为模板,进行 RT鄄PCR 扩
增,扩增片段大小为 837 bp,将其克隆到表达载体
pET鄄28a( + ),碱裂解法提取质粒,经 EcoR玉和
Xho玉酶切后,电泳结果显示得到了约 2 700 bp 及
约800 bp大小的片段,表明目的片段成功插入表
达载体 pET鄄28a( + ),成功构建了原核表达载体
pET鄄TZSV鄄N。
SDS鄄PAGE电泳显示,表达的融合蛋白分子量
为 33 kDa(图 1),与推导的融合蛋白分子量相符,
表明该蛋白得到了完整表达。
Fig. 1 摇 SDS鄄PAGE of expressed product in
E. coli
Lane M: Prestained protein marker; Lane 1: Negative control
of BL21 / pET鄄28a; Lane 2鄄5: Sample of the pellet of BL21 /
pET鄄TZSV induced by IPTG for 2, 4, 6 h.
2. 2摇 抗血清制备及效价测定
以诱导表达的 N 蛋白为抗原,免疫家兔获得
了 TZSV N 蛋白抗血清,经 ID鄄ELISA 测定抗血清
效价为 1 / 6 000,与感病番茄反应效价则为 1 / 3 000
(表 1),表明该抗体的检测效价为 1 / 3 000。
2. 3摇 TZSV的血清特性分析
将制备的 TZSV抗血清与 TZSV、TSWV、CaCV
和 INSV感染的番茄样品粗汁液进行Western
Table 1摇 The titer analysis of antiserum
Serial dilution N protein Disease sample Negative control
1 / 500 0. 225 0. 185 0. 074
1 / 1 000 0. 195 0. 162 0. 073
1 / 3 000 0. 161 0. 149 0. 075
1 / 5 000 0. 153 0. 091 0. 071
1 / 6 000 0. 149 0. 083 0. 076
1 / 8 000 0. 095 0. 085 0. 078
Note: A405of samples / A405 of negative control > 2, the samples regard as positive.
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摇
摇 5 期 摇 摇 尹跃艳,等:番茄环纹斑点病毒核壳体蛋白抗血清制备及其血清学特性分析
blot分析,结果显示, TZSV 抗血清仅与 TZSV、
CaCV感染的病样呈阳性反应,而与 INSV、TSWV
感染的病样无反应(图 2)。
Fig. 2 摇 Reaction of Tospoviruses to TZSV
Antibody
Lane M: Prestained protein marker; Lane 1: INSV; Lane 2:
TZSV; Lane 3: CaCV; Lane 4: TSWV.
3摇 讨论
Tospovirus病毒为球状、具包膜的病毒,提纯
较困难,而且病毒系统侵染的寄主在症状表现上会
出现枯萎现象,给病毒繁殖带来一定困难[11]。 To鄄
spovirus分布广泛,且可为害一些具有经济重要性
的作物,造成严重损失,寻求一种快速、便捷的鉴定
方法对于病害防控具有重要指导意义。
N蛋白的氨基酸同源性和血清学关系是 To鄄
spovirus病毒分类的一个重要依据[2]。 本研究通
过制备 TZSV 多克隆抗体, 比较了 TZSV 与
TSWV、CaCV、INSV Tospovirus病毒之间的血清学
关系,结果表明 TZSV 与 CaCV 具有血清交叉反
应,而 CaCV 为 WSMoV 血清组成员[12];同时
TZSV与 WSMoV / GBNV 复合抗血清也有微弱反
应;但 TZSV与 TSWV、INSV 并无血清交叉反应,
说明 TZSV、CaCV、WSMoV 和 GBNV 具有较近的
血清学关系。 已有研究表明 TZSV N 蛋白氨基酸
序列与 CaCV同源性为 61. 8% 。 构建 TZSV 与同
属其他种的 N、NSs、NSm、GN / GC和 RdRp基因的系
统进化树,进化树中 TZSV都与WSMoV血清学关
系相近的成员聚于同一分支[9]。 本研究的研究结
果与已报道的结果一致,证明 TZSV与WSMoV血
清组成员具有较近的血清学关系。
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责任编辑:于金枝
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