全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(2): 195-201(2012)
收稿日期: 2011-08-06; 修回日期: 2011-10-18
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (30860163); 中国烟草公司重点科技项目 (110200902065); 云南省烟草公司科技项目
(2010YN19)
通讯作者: 秦西云, 研究员, 主要从事烟草病害研究; Tel: 0877-2075036, E-mail: xyqin@yntsti. com
张仲凯, 研究员, 主要从事植物病毒研究; Tel: 0871-5183204, E-mail: zhongkai99@sina. com
第一作者: 卢 训(1984 - ),男,云南宾川人,主要从事植物病理学方面的研究; E-mail: luxun2943@126. com。
侵染云南烟草的番茄环纹斑点病毒
N基因的分子变异分析
卢 训1, 丁 铭1, 方 琦1, 方敦煌2, 秦西云2*, 张仲凯1*
( 1云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 云南省农业生物技术重点实验室
农业部西南农业基因资源与种质创制重点实验室, 昆明 650223; 2云南省烟草农业科学研究院, 玉溪 653100)
摘要:应用电镜观察和 ELISA检测从云南 11 个县(市)烟草种植区采集的烟草上检测到番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate
spot virus, TZSV)。 根据 TZSV N基因设计引物扩增得到了 31 个 TZSV分离物 N基因全序列。 测序分析表明,31 个 TZSV
N基因核苷酸序列与 GenBank中报道的序列相似性在 94. 9% ~ 98%之间,其推导的氨基酸序列同源性为 98. 2% ~ 99. 3% 。
构建系统进化树发现云南不同地区的 TZSV分离物存在一定差异。 氨基酸序列比较发现,文山分离物和西畴分离物具有 2
个该地区独有的氨基酸位点。
关键词:番茄环纹斑点病毒; N基因; 分子变异
Molecular variation of natural populations of Tomato zonate spot virus infecting
flue-cured tobacco in Yunnan　 LU Xun1, DING Ming1, FANG Qi1, FANG Dun-huang2, QIN Xi-yun2,
ZHANG Zhong-kai1 　 (1 Institute of Biotechnology and Germplasm Resources,Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Yun-
nan Province Key Laboratory of Agricultural Biotechnology, Key Lab of the Southwestern Crop Gene Resources and Germplasm
Innovation, Ministry of Agriculture, Kunming 650223, China; 2Yunnan Tobacco Research Institute, Yuxi 653100, China)
Abstract: Using electron microscopy and ELISA, Tomato zonate spot virus (TZSV) isolates were detected
from flue-cured tobacco in 11 counties and cities of Yunnan. With primers from conserved regions, the nucle-
ocapsid (N) gene sequences of 31 naturally occurring TZSV isolates from flue-cured tobacco were amplified
by RT-PCR. Sequence analysis showed a high level of sequence conservation (94. 9% ~ 98% ) among the N
genes of the tobacco isolates. However, cluster dendrogram showed distinct differences were present in Yun-
nan TZSV isolates from different area. Amino acid sequence analysis showed that two amino acid residues
were considered to be area specific in Wenshan isolates and Xichou isolates.
Key words: Tomato zonate spot virus, nucleocapsid gene, molecular variation
中图分类号: S432. 41　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)02-0195-07
　 　 番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,
TZSV)属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)番茄斑
萎病毒属(Tospovirus),是中国大陆首次报道的新
种[1]。 TZSV 自然条件下可侵染番茄、辣椒、马铃
薯和烟草等 24 种作物及杂草[2]。 TZSV 具有典型
的 Tospovirus病毒属特征,病毒粒子为球形,被膜,
直径约 80 ~ 120 nm,病毒基因组为三分体单链
RNA,即 L、M、S RNA[3]。 L RNA为负义 RNA,全
长 8 919 nt,互补链编码 332. 7 kDa的 RNA依赖的
RNA 聚合酶 ( RNA-dependent RNA polymerase,
RdRp)。 M RNA为双义 RNA,全长 4 945 nt,病毒
链编码 1 个 34. 4 kDa的非结构蛋白(non-structural
　
植物病理学报 42 卷
protein,NSm),目前推测该蛋白可能与病毒运动相
关。 互补链编码 1 个 127. 4 kDa 的糖蛋白前体
(glycoprotein precursor),是病毒膜蛋白 Gn / Gc 的
前体蛋白。 S RNA为双义 RNA, 全长 3 279 nt,病
毒链编码 1 个 51. 9 kDa 的非结构蛋白(non-struc-
tural protein,NSs),根据 Tospovirus 其它病毒进行
推测,该蛋白可能是病毒抑制寄主植物基因沉默的
抑制子。 互补链编码 1 个 30. 6 kDa的核壳体蛋白
(nucleocapsid protein,N) [1],N 蛋白是 Tospovirus
中最不保守的蛋白,因此 N 基因序列及其推导的
氨基酸序列是 Tospovirus 不同病毒的分类依据之
一[4]。
烟草是云南省的重要支柱产业,云南烟草常年
种植面积保持在 35 万 hm2 左右。 我国最初报道
Tospovirus病毒侵染烟草是在 1992 年,Yao[5]从四
川晒烟上检测到番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt
virus,TSWV)。 2010 年 Dong 等[6]报道了 TSWV
侵染云南烟草。 2011 年,由番茄环纹斑点病毒
(Tomato zonate spot virus,TZSV)引起的病害在滇
南、滇中烟区广泛发生,部分烟区大田发病率在
3% ~ 5%之间,重病田块达到 20%左右。 本研究
主要针对病毒分类相关基因 N 基因进行比较分
析,通过分子克隆及测序,得到了云南 11 个县
(市)的 31 个 TZSV分离物 N基因序列,并对其进
行分子变异分析,初步明确了云南 TZSV分离物的
分子变异情况,对病害的防控及抗病育种工作提供
了一定的理论基础。
1　 材料
1. 1　 烟草病株
烟草病样采集于云南 11 个烟草种植区:分别
是红河州蒙自市(编号为 MZ-1 ~ 5)、红河州个旧
市(编号为 GJ-1 ~ 5)、红河州泸西县(编号为 LX-1
~ 4)、文山州文山市(编号为 WS-1 ~ 2)、文山州西
畴县(编号为 XC-1 ~ 3)、玉溪通海县(编号为 TH-
1)、玉溪新平县(编号为 XP-1 ~ 3)、保山腾冲县
(编号为 TC-1 ~ 4)、楚雄州双柏县(编号为 SB-1)、
楚雄州南华县(编号为 NH-1)和楚雄州禄劝县(编
号为 LQ-1 ~ 2)。
采集烟草样品主要症状为:初期发病叶片半叶
点状密集坏死,且不对称生长;发病中期,病叶出现
半叶坏死斑点和脉坏死,顶部新叶出现整叶坏死症
状;发病后期,烟株进一步坏死,茎杆上有明显的凹
陷坏死症状,且对应部位的髓部变黑,但不形成碟
片状;最终导致烟株整株死亡。
1. 2　 抗血清
番茄斑萎病毒 ( Tomato spotted wilt virus,
TSWV)、凤仙花坏死斑病毒 ( Impatiens necrotic
spot virus,INSV)、鸢尾黄斑病毒( Iris yellow spot
virus,IYSV)特异抗血清,西瓜银色斑驳病毒(Wa-
termelon silver mottle virus,WSMoV )和花生顶芽
坏死病毒(Groudnut bud necrosis virus,GBNV)复
合抗血清,花生环斑病毒 (Groundnut ring spot
virus,GRSV)和番茄褪绿斑病毒(Tomato chlorotic
spot virus,TCSV)复合抗血清购自 Agdia。 番茄环
纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)及花
生黄斑病毒(Groundnut yellow spot virus,GYSV)
ID-ELISA检测试剂盒由本实验室制备。
2　 方法
2. 1　 电镜负染色观察
根据 Zhang 等[7]方法制片,置于 JEM100CX-
Ⅱ型透射电子显微镜下观察。
2. 2　 ELISA检测
采用购自 Agdia的 DAS-ELISA检测试剂盒对
病样进行检测,具体检测方法参照说明书。 TZSV
和 GYSV 采用 ID-ELISA 检测方法,具体参照
Wang等[8]方法。
2. 3　 RT-PCR扩增
参照 Dong 等[1]方法提取病样总 RNA,采用
RT-PCR 两步法对 TZSV N 基因序列进行扩增。
反转录采用 AMV 反转录试剂盒(Promega),具体
方法参照说明书。 PCR 反应条件根据具体引物设
定延伸时间及退火温度。
2. 4　 PCR产物克隆及测序
RT-PCR 扩增 产 物 经 DNA 回 收 试 剂 盒
(Sangon)回收,连接到 pGEM-T Easy 载体( Pro-
mega)上,转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,
涂布含有氨苄青霉素的 LB 培养基,筛选阳性克
隆。 筛选出的阳性克隆送北京华大基因公司进行
测序。
2. 5　 序列分析
利用 DNAMAN Version 5. 0 进行序列处理、分
691
　
　 2 期 　 　 卢 训,等:侵染云南烟草的番茄环纹斑点病毒 N基因的分子变异分析
析。 进化树构建采用 MEGA 4. 0 软件,以 NJ
(neighbor-joining)方法构建,进化树各分支的可信
度用 Bootstrap检测(1 000 次重复)。
3　 结果
3. 1　 病毒粒子形态特征及血清学关系
经电镜负染色观察,在发病样品分离物中有
80 ~ 120 nm 的球形病毒粒子存在,且病毒粒子具
包膜,具有典型的 Tospovirus病毒粒子形态。
采集症状表现为 1. 1 中描述的烟草样品共 68
份,采用 TSWV、 INSV、 IYSV、TZSV、GYSV、WS-
MoV / GBNV、GRSV / TCSV 等 7 个抗血清进行检
测,65 个样品与 WSMoV / GBNV 呈弱阳性反应,
与 TZSV呈阳性反应,初步确定侵染烟草的病毒为
TZSV。
3. 2　 RT-PCR扩增、克隆及序列分析
根据 GenBank 中报道的序列设计并合成
TZSV N 基因引物 ( Invitrogen)对样品进行 RT-
PCR扩增。 经扩增、克隆及测序表明,扩增片段大
小为 837 bp,为 TZSV N 基因全序列,共编码 278
个氨基酸。
从采集样品中扩增得到 11 个县(市)的 31 个
分离物,采用 DNAMAN Version 5. 0 对获得的
TZSV不同地区分离物与 GenBank 中报道的昆明
分离物(TZSV-KM,序列号 NC_010489)N 基因进
行比较,核苷酸相似性在 94. 9% ~ 98%之间,氨基
酸同源性在 98. 2% ~ 99. 3%之间(表 1)。
采用 DNAMAN Version 5. 0 对获得的分离物
与 GenBank中报道的 TZSV-KM推导的 N 蛋白氨
基酸进行比较 (表 2)。 结果表明,泸西分离物
(LX-1 ~ 4)与 TZSV-KM的 12 位氨基酸位点均为
缬氨酸,而其余分离物在该位点为异亮氨酸。 在
84 位氨基酸位点通海分离物(TH-1)、新平分离物
(XP-1 ~ 3)、禄劝分离物(LQ-1 ~ 4)、双柏分离物
(SB-1)、南华分离物(NH-1)和 TZSV-KM 分离物
均为丝氨酸,其余分离物为甘氨酸。 在 123 和 192
位氨基酸位点通海分离物 (TH-1)、新平分离物
(XP-1 ~ 3)、禄劝分离物(LQ-1 ~ 2)、双柏分离物
(SB-1)和南华分离物(NH-1)均为缬氨酸和苯丙
氨酸,而 TZSV-KM及其余分离物在该位点均为异
亮氨酸和酪氨酸。 38 和 41 氨基酸位点文山分离
物(WS-1 ~ 2)和西畴分离物(XC-1 ~ 3)为丙氨酸
和天冬氨酸,TZSV-KM和其余分离物在该位点为
丝氨酸和谷氨酸。
根据所获得的 N 基因序列,用 MEGA 4. 0 构
建了含有 31 个 TZSV云南烟草分离物与 GenBank
中报道的 TZSV-KM的系统进化树(图 1),结果表
Fig. 1　 Nucleocapsid gene sequences of Tomato zonate spot virus isolates
791
Table 1　 Nucleotide sequence and encoded protein comparison of nucleocapsid protein gene of TZSV isolates
GJ-1 GJ-2 GJ-3 GJ-4 GJ-5 LQ-1 LQ-2 LX-1 LX-2 LX-3 LX-4 MZ-1 MZ-2 MZ-3 MZ-4 MZ-5 TC-1 TC-2 TC-3 TC-4 TH-1 WS-1 WS-2 XC-1 XC-2 XC-3 XP-1 XP-2 XP-3 TZSV-KM
GJ-1 99. 60 98. 90 99. 30 99. 60 97. 80 98. 20 99. 60 99. 30 98. 90 99. 60 98. 60 99. 60 99. 60 98. 60 99. 60 98. 90 99. 60 98. 60 99. 60 98. 20 98. 60 98. 60 99. 60 98. 60 98. 90 98. 60 98. 60 98. 60 98. 90
GJ-2 99. 80 99. 30 99. 60 100. 00 98. 20 98. 60 100. 00 99. 60 99. 30 100. 00 98. 90 100. 00 100. 00 98. 90 100. 00 99. 30 100. 00 98. 90 100. 00 98. 60 98. 90 98. 90 100. 00 98. 90 99. 30 98. 90 98. 90 98. 90 99. 30
GJ-3 96. 80 96. 80 98. 90 99. 30 97. 50 97. 80 99. 30 98. 90 98. 60 99. 30 98. 20 99. 30 99. 30 98. 20 99. 30 98. 60 99. 30 98. 20 99. 30 97. 80 98. 20 98. 20 99. 30 98. 20 98. 60 98. 20 98. 20 98. 20 98. 60
GJ-4 97. 30 97. 30 99. 00 99. 60 97. 80 98. 20 99. 60 99. 30 98. 90 99. 60 98. 60 99. 60 99. 60 98. 60 99. 60 98. 90 99. 60 99. 30 99. 60 98. 20 98. 60 98. 60 99. 60 98. 60 98. 90 98. 60 98. 60 98. 60 98. 90
GJ-5 97. 10 97. 10 99. 60 99. 40 98. 20 98. 60 100. 00 99. 60 99. 30 100. 00 98. 90 100. 00 100. 00 98. 90 100. 00 99. 30 100. 00 98. 90 100. 00 98. 60 98. 90 98. 90 100. 00 98. 90 99. 30 98. 90 98. 90 98. 90 99. 30
LQ-1 96. 80 96. 80 95. 00 95. 20 95. 30 98. 90 98. 20 97. 80 97. 50 98. 20 97. 10 98. 20 98. 20 97. 10 98. 20 97. 50 98. 20 97. 10 98. 20 98. 90 97. 10 97. 10 98. 20 97. 10 97. 50 99. 30 99. 30 99. 30 98. 20
LQ-2 96. 40 96. 40 94. 40 94. 90 94. 70 97. 70 98. 60 98. 20 97. 80 98. 60 97. 50 98. 60 98. 60 97. 50 98. 60 98. 20 98. 60 97. 50 98. 60 99. 30 97. 50 97. 50 98. 60 97. 50 97. 80 99. 60 99. 60 99. 60 98. 60
LX-1 96. 10 96. 10 95. 10 95. 50 95. 30 94. 50 93. 90 99. 60 99. 30 100. 00 98. 90 100. 00 100. 00 98. 90 100. 00 99. 30 100. 00 98. 90 100. 00 98. 60 98. 90 98. 90 100. 00 98. 90 99. 30 98. 90 98. 90 98. 90 99. 30
LX-2 97. 00 97. 00 96. 30 96. 70 96. 50 95. 50 94. 90 98. 60 98. 90 99. 60 98. 60 99. 60 99. 60 98. 60 99. 60 98. 90 99. 60 98. 60 99. 60 98. 20 98. 60 98. 60 99. 60 98. 60 98. 90 98. 60 98. 60 98. 60 98. 90
LX-3 95. 70 95. 70 94. 70 95. 10 95. 00 94. 10 93. 50 99. 60 98. 20 99. 30 98. 20 99. 30 99. 30 98. 20 99. 30 98. 60 99. 30 98. 20 99. 30 97. 80 98. 20 98. 20 99. 30 98. 20 98. 60 98. 20 98. 20 98. 20 98. 60
LX-4 95. 90 95. 90 95. 00 95. 30 95. 20 94. 40 93. 80 99. 90 98. 40 99. 80 98. 90 100. 00 100. 00 98. 90 100. 00 99. 30 100. 00 98. 90 100. 00 98. 60 98. 90 98. 90 100. 00 98. 90 99. 30 98. 90 98. 90 98. 90 99. 30
MZ-1 98. 90 98. 90 96. 70 97. 10 97. 00 95. 90 95. 60 95. 90 96. 90 95. 60 95. 80 98. 90 98. 90 100. 00 98. 90 98. 20 98. 90 97. 80 98. 90 97. 50 97. 80 97. 80 98. 90 97. 80 98. 20 97. 80 97. 80 97. 80 98. 20
MZ-2 95. 90 95. 90 95. 00 95. 30 95. 20 94. 40 93. 80 99. 90 98. 40 99. 80 100. 00 95. 80 100. 00 98. 90 100. 00 99. 30 100. 00 98. 90 100. 00 98. 60 98. 90 98. 90 100. 00 98. 90 99. 30 98. 90 98. 90 98. 90 99. 30
MZ-3 95. 90 95. 90 95. 00 95. 30 95. 20 94. 40 93. 80 99. 90 98. 40 99. 80 100. 00 95. 80 100. 00 98. 90 100. 00 99. 30 100. 00 98. 90 100. 00 98. 60 98. 90 98. 90 100. 00 98. 90 99. 30 98. 90 98. 90 98. 90 99. 30
MZ-4 98. 90 98. 90 96. 70 97. 10 97. 00 95. 90 95. 60 95. 90 96. 90 95. 60 95. 80 100. 00 95. 80 95. 80 98. 90 98. 20 98. 90 97. 80 98. 90 97. 50 97. 80 97. 80 98. 90 97. 80 98. 20 97. 80 97. 80 97. 80 98. 20
MZ-5 95. 90 95. 90 95. 00 95. 30 95. 20 94. 40 93. 80 99. 90 98. 40 99. 80 100. 00 95. 80 100. 00 100. 00 95. 80 99. 30 100. 00 98. 90 100. 00 98. 60 98. 90 98. 90 100. 00 98. 90 99. 30 98. 90 98. 90 98. 90 99. 30
TC-1 97. 60 97. 60 97. 70 98. 20 98. 10 95. 80 95. 20 96. 10 97. 30 95. 70 95. 90 97. 30 95. 90 95. 90 97. 30 95. 90 99. 30 98. 20 99. 30 97. 80 98. 20 98. 20 99. 30 98. 20 98. 60 98. 20 98. 20 98. 20 98. 60
TC-2 97. 10 97. 10 99. 60 99. 40 100. 00 95. 30 94. 70 95. 30 96. 50 95. 00 95. 20 97. 00 95. 20 95. 20 97. 00 95. 20 95. 50 98. 90 100. 00 98. 60 98. 90 98. 90 100. 00 98. 90 99. 30 98. 90 98. 90 98. 90 99. 30
TC-3 97. 00 97. 00 98. 80 99. 80 99. 20 95. 00 94. 60 95. 20 96. 40 94. 90 95. 10 96. 90 95. 10 95. 10 96. 90 95. 10 95. 10 98. 00 98. 90 97. 50 97. 80 97. 80 98. 90 97. 80 98. 20 97. 80 97. 80 97. 80 98. 20
TC-4 97. 80 97. 80 98. 40 98. 70 98. 80 95. 80 95. 50 95. 80 97. 00 95. 50 95. 70 97. 30 95. 70 95. 70 97. 30 95. 70 95. 90 98. 10 98. 80 98. 60 98. 90 98. 90 100. 00 98. 90 99. 30 98. 90 98. 90 98. 90 99. 30
TH-1 96. 70 96. 70 94. 60 95. 10 95. 00 98. 00 99. 30 94. 10 95. 10 93. 80 94. 00 95. 80 94. 00 94. 00 95. 80 94. 00 95. 20 95. 50 95. 00 94. 90 97. 50 97. 50 98. 60 97. 50 97. 80 99. 60 99. 60 99. 60 98. 60
WS-1 97. 00 97. 00 97. 10 97. 60 97. 50 95. 00 94. 60 95. 50 96. 40 95. 10 95. 30 96. 90 95. 30 95. 30 96. 90 95. 30 95. 10 97. 70 97. 50 97. 40 97. 50 98. 60 98. 90 99. 30 99. 60 97. 80 97. 80 97. 80 98. 20
WS-2 97. 10 97. 10 97. 70 98. 20 98. 10 95. 10 94. 70 95. 30 96. 30 95. 00 95. 20 97. 00 95. 20 95. 20 97. 00 95. 20 95. 20 98. 10 98. 10 98. 00 97. 80 95. 00 98. 90 98. 60 98. 90 97. 80 97. 80 97. 80 98. 20
XC-1 98. 00 98. 20 97. 80 98. 30 98. 20 95. 70 95. 30 95. 70 96. 90 95. 30 95. 60 97. 60 95. 60 95. 60 97. 60 95. 60 96. 10 98. 70 98. 20 98. 10 98. 70 95. 60 98. 10 98. 90 99. 30 98. 90 98. 90 98. 90 99. 30
XC-2 97. 10 97. 10 96. 90 97. 40 97. 30 95. 00 94. 90 95. 50 96. 40 95. 10 95. 30 97. 00 95. 30 95. 30 97. 00 95. 30 95. 30 97. 70 97. 30 97. 10 97. 30 94. 90 98. 10 97. 50 99. 60 97. 80 97. 80 97. 80 98. 20
XC-3 97. 00 97. 30 97. 50 97. 70 97. 80 95. 10 94. 70 95. 30 96. 30 95. 00 95. 20 96. 90 95. 20 95. 20 96. 90 95. 20 95. 20 97. 60 97. 80 97. 50 97. 80 95. 00 98. 20 98. 10 98. 00 98. 20 98. 20 98. 20 98. 60
XP-1 96. 70 96. 70 94. 60 95. 10 95. 00 98. 20 99. 00 94. 40 95. 10 94. 00 94. 30 95. 80 94. 30 94. 30 95. 80 94. 30 95. 50 95. 50 95. 00 94. 90 95. 70 99. 30 94. 90 95. 20 95. 60 94. 90 100. 00 100. 00 98. 90
XP-2 96. 70 96. 70 94. 60 95. 10 95. 00 98. 20 99. 00 94. 40 95. 10 94. 00 94. 30 95. 80 94. 30 94. 30 95. 80 94. 30 95. 50 95. 50 95. 00 94. 90 95. 70 99. 30 94. 90 95. 20 95. 60 94. 90 95. 00 100. 00 98. 90
XP-3 96. 30 96. 30 94. 30 94. 70 94. 60 97. 60 99. 60 93. 80 94. 70 93. 40 93. 70 95. 50 93. 70 93. 70 95. 50 93. 70 94. 90 95. 10 94. 60 94. 50 95. 30 99. 20 94. 50 94. 60 95. 20 94. 70 94. 60 98. 90 98. 90
TZSV-KM 96. 70 96. 90 95. 20 95. 30 95. 50 95. 10 95. 00 98. 00 97. 70 97. 60 97. 80 95. 80 97. 80 97. 80 95. 80 97. 80 95. 90 95. 50 95. 90 95. 20 95. 10 95. 20 96. 10 95. 30 9520 95. 50 95. 20 95. 50 94. 90
　 　 Note: Left lower is comparison of nucleotide sequence and right upper is amino acid.
Table 2　 Differences among amino acid sequences of nucleocapsid protein gene of the various TZSV isolates
Isolates
Amino acid position
7 12 13 38 41 44 45 81 84 123 129 139 141 150 162 171 182 189 192 196 197 248 249 252 256 257 261 269
TZSV-KM L V Q S E K A V S I P V D M S F E S Y C K E T K N V G K
MZ-1 I G R S S
MZ-2 I G
MZ-3 I G
MZ-4 I G R S S
MZ-5 I G
GJ-1 I G G
GJ-2 I G
GJ-3 I G Y I
GJ-4 I V G
GJ-5 I G
TC-1 I E G T
TC-2 I G
TC-3 I V A G G
TC-4 I G
TH-1 I V F R
XP-1 I V F
XP-2 I V F
XP-3 I V F
WS-1 I A D G E
WS-2 S I A D G L
XC-1 I A D G
XC-2 I A D G Q
XC-3 I A D G
LX-1 G
LX-2 R G
LX-3 G K A
LX-4 G
LQ-1 I V A L F
LQ-2 I R V F
SB-1 I R V F
NH-1 I V F
　
植物病理学报 42 卷
明,蒙自 (MZ-2、MZ-3 和 MZ-5)和泸西分离物
(LX-1、LX-3 和 LX-4)与 TZSV-KM 关系最近,聚
为 1 个亚支。 通海分离物 (TH-1)、新平分离物
(XP-1 ~ 3)、禄劝分离物(LQ-1 ~ 2)、南华分离物
(NH-1)和双柏分离物(SB-1)聚为 1 支,腾冲分离
物(TC-1 ~ 4)、个旧分离物(GJ-3 ~ 5)、文山分离物
(WS-1 ~ 2)及西畴分离物(XC-1 ~ 3)聚于 1 个亚
支,蒙自分离物分别处于 2 个亚支,其中 MZ-2、
MZ-3、MZ-5 与 TZSV-KM聚为 1 个亚支,而 MZ-1
和 MZ-4 与个旧分离物(GJ-1、GJ-2)聚为 1 个亚
支。
4　 讨论
Tospovirus 属于布尼亚病毒科 ( Bunyaviri-
dae),根据 ICTV第八次报告,Tospovirus分类依据
主要是根据传播介体、寄主植物范围、N 蛋白血清
学关系以及 N 蛋白氨基酸序列与 Tospovirus 属其
他所有已报道种的同源性低于 90% 4 个依据[4]。
目前该属包括 22 种病毒[4,9 ~ 12],云南已发现侵染
烟草的 Tospovirus 病毒有 TSWV[2]和凤仙花坏死
斑病毒( Impatiens necrotic spot virus,INSV)。 2011
年 5 月中下旬,在滇南、滇中烟区的烟草上出现一
种类似 TSWV和 INSV引起的病害,发病烟草叶片
上出现密集坏死环斑,但与 TSWV和 INSV引起的
症状又有一定的区别,主要是:幼叶不对称生长,整
个叶片以主叶脉为中轴,一边正常,一边坏死,致使
两边生长不均,主叶脉弯曲,叶片似镰刀状。 烟株
上,顶芽萎蔫下垂,往往同一侧的多片烟叶出现密
集的坏死斑,整株烟矮化,呈“偏头”状。 通过电镜
观察发现病样中存在 80 ~ 120 nm 的球形病毒,具
有典型的 Tospovirus 特征[3]。 血清检测发现该病
毒与 TZSV多抗血清具有较强的血清学反应。
本研究通过对云南 11 个县(市)的以上症状
表现的样品进行 RT-PCR 扩增、克隆及测序得到
31 个 TZSV烟草分离物 N 基因序列,构建系统进
化树,发现蒙自(MZ-2、MZ-3 和 MZ-5)和泸西分
离物(LX-2、LX-4 和 LX-5)与报道的 TZSV-KM分
离物关系较近。 对推导的 N 蛋白氨基酸序列进行
比较,发现在文山州的文山县和西畴县存在该地区
特有的氨基酸位点。
1998 年美国报道了侵染烟草的 TSWV遗传多
样性研究[13],研究中对美国乔治亚州烟草上分离
到的 TSWV进行了系统的分析,发现 TSWV 存在
较为明显的地域差异。 本研究首次对侵染云南烟
草的 TZSV 进行遗传多样性分析,得到了云南
TZSV存在一定的地域差异,初步明确了侵染云南
烟草的 TZSV N基因的遗传组成,为该病毒病害的
防治及抗病育种提供一定的理论基础。
致谢:感谢云南省烟草农业科学研究院莫笑晗
副研究员和夏振远研究员在样品采集过程中的协
助和有益的讨论。
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