全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 41(1): 85-92(2011)
收稿日期: 2010-03-26; 修回日期: 2010-09-11
基金项目: 国家质检总局科技项目(20081K241)
通讯作者: 于翠,博士,农艺师,主要从事植物病害检测研究; Tel: 021-38620578, E-mail: yuc@shciq. gov. cn
第一作者: 易汪雪(1986 - ),女,湖北恩施人,硕士研究生,主要从事植物病毒检测研究; E-mail: ywx1986@126. com。
单管实时荧光 RT-PCR方法同时检测大豆种子
中的菜豆荚斑驳病毒和烟草环斑病毒
易汪雪1, 陈舜胜1, 杨翠云2, 于 翠2*
( 1上海海洋大学, 上海 201306; 2上海出入境检验检疫局, 上海 200135)
摘要: 本研究建立了大豆种子中菜豆荚斑驳病毒(BPMV)和烟草环斑病毒(TRSV)单管双重实时荧光 PCR检测方法。 将
含有相同浓度的分别带有 BPMV和 TRSV CP基因的质粒溶液作为阳性对照,以受两种病毒侵染的大豆种子作为待测样品
进行实时荧光 PCR检测,结果表明能从同一管中同时检测出这两种病毒而不发生交叉反应。 尽管在阳性对照中,二者的
检测限相当,均可达到 35 pg / mL,但在实际应用中,两种病毒由于在大豆种子中的浓度不一致而存在一定的差别。 该方法
快速、灵敏、简便,同时特异性更强,在出入境检验检疫中具有广泛的应用前景。
关键词: 菜豆荚斑驳病毒;烟草环斑病毒;双重实时荧光 PCR;检测
One-tube real-time PCR assay for simultaneous detection of Bean pod mottle virus
and Tobacco ringspot virus in soybean seeds 　 YI Wang-xue1, CHEN Shun-sheng1, YANG
Cui-yun2, YU Cui2 　 ( 1Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2Shanghai Entry-Exit Inspection and Quaran-
tine Bureau, Shanghai 200135, China)
Abstract: An one-tube duplex real-time PCR approach for detecting Bean pod mottle virus (BPMV) and To-
bacco ringspot virus (TRSV) was developed in this study. The solution of the same concentration of plasmids
carrying either the CP gene of BPMV or that of TRSV was used as posivitive controls and the soybean seeds
mix-infected by BPMV and TRSV were as experimental samples for real-time PCR detection. The results
showed that both viruses could be detected in the same tube without cross-reaction. Although the detection
limits for these two viruses were equivalent and up to 35 pg / mL in the positive samples, there were some
differences in practical detection due to the uneven concentration of these two viruses in the soybean seeds.
This approach suggested a simple, sensitive, rapid and more specific detection of BPMV and TRSV for the en-
try-exit inspection and quarantine.
Key words: BPMV; TRSV; duplex real-time PCR; detection
中图分类号: S432. 41　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2011)01-0085-08
　 　 大豆(Glycine max L)原产中国,是最古老的
农作物之一,现在世界各地都有种植。 人类日常生
活中,大豆是一种价格低廉、营养均衡、富含蛋白的
消费品,也是植物油及植物蛋白提取的重要原料。
在大豆生长过程中,可能感染超过一百种的病虫
害,能够引起一定经济损失的大概有 35 种[1]。 其
中可侵染大豆的病毒种类有 11 种,包括新修订检
疫性有害生物名录中的番茄环斑病毒 ( Tomato
ringspot virus, ToRSV),烟草环斑病毒 ( Tobacco
ringspot virus, TRSV),南芥菜花叶病毒 (Arabis
　
植物病理学报 41 卷
mosaic virus, ArMV),菜豆荚斑驳病毒(Bean pod
mottle virus, BPMV),南方菜豆花叶病毒(Southern
bean mosaic virus, SBMV)和花生矮化病毒(Pea-
nut stunt virus, PSV)。 TRSV 和 BPMV 在大豆上
经常发生,且 TRSV 在大豆上的种传率较高,可达
到 40% ~ 100% [2];BPMV在大豆上的种传率虽然
较低(只有 0. 01% ~ 0. 013% ),但是它经常种皮带
毒[3],受这些病毒侵染后,通常表现为豆荚不发育
或败育,种子丧失活力。 近两年来,我国上海、宁波
等口岸部门从进境大豆上多次截获 BPMV,江苏局
曾于 2005 年截获 TRSV,一旦大豆中携带的病毒
随大豆贸易传入我国,将给我国农业生产造成严重
损失。
目前国内检测 BPMV 和 TRSV 的方法主要
有酶联免疫吸附检测(ELISA)、电镜技术和 RT-
PCR技术[4,5] 。 实时荧光技术是最近几年发展起
来的一种新技术,其基本原理是使用能特异标记
核苷酸序列的荧光物质,利用荧光信号的积累实
时监测整个 PCR过程,目前已经被检疫部门用于
植物病毒检测[6 ~ 12] ,但大多都是对单一病毒进行
检测,不能实现在一次实验中同时检测多种病
毒,达不到检疫检验所需的快速、简便的特点,因
此我们在本研究中建立双重实时荧光 PCR 检测
方法,并利用该技术从大豆种子中同时检测
BPMV和 TRSV。 研究结果为今后利用实时荧光
PCR技术同时检测植物中的多种病毒奠定了
基础。
1　 材料与方法
1. 1　 材料
TRSV为上海出入境检验检疫局保存的毒源,
在隔离温室中接种大豆幼苗,待结籽后采摘种子作
为实验材料;BPMV 为上海局于 2005 年从截获的
美国大豆种子上分离得到。
1. 2　 引物、探针的设计和合成
根据美国 NCBI 核酸数据库中 BPMV(Gen-
Bank 登录号: AF330206, AF394609, AF448497,
M62738,NC003495)和 TRSV (GenBank 登录号:
AF461163, AY363727, AY787756, L09205, NC-
005096)CP基因的序列保守区,分别设计引物和
Taqman-MGB探针(表 1)。 TRSV 探针 5′端标记
HEX荧光基团,激发及发射波长分别为 494 和 522
nm,而 BPMV 5′端则标记 FAM 荧光基团,激发及
发射波长分别为 535 和 553 nm。 因为两种荧光基
团的激发和发射波长不同,故在同一反应中可同时
检测两种荧光信号。 引物和探针由上海基康生物
技术有限公司合成。
Table 1　 Sequences of primers and probes used for PCR detection of Bean
pod mottle virus and Tobacco ringspot virus
Primer Sequence (5′→3′) Amplicon (bp)
TRSV-F-2 GATGCAAAGAAAGGAAAGC 580
TRSV-R-2 AGATATGGACAACATGGAGG
TRSV-F GGTTTTCATGCTTAAAGATGCAGAT 85
TRSV-R CCATGTCCAGTAAGTTCCCCATA
TRSV-MGB-T-HEX TGCATGAATGGCAGTTC
BPMV-F CTGCTGATGTTCTTGCAAAGCG 275
BPMV-1R AGACAGAATTTCCTCCTGTGCCAT
BPMV-F TCATGAAAGCCTCAAGGATCAA 138
BPMV-R CCATCAGTAAGAAGTTTAAGATCACCAA
BPMV-MGB-T-FAM TTCCTGCTGTTGACAAGT
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　 1 期 　 易汪雪,等:单管实时荧光 RT-PCR方法同时检测大豆种子中的菜豆荚斑驳病毒和烟草环斑病毒
1. 3　 阳性对照样品的制备
分别将 BPMV 和 TRSV 的 RT-PCR 产物克隆
到 pMD18-T载体(TaKaRa)上,经测序验证后分别
提取质粒,并将质粒的浓度调至 35 ng / μL,即阳性
对照样品,用于单管双重实时荧光分析。
1. 4　 DAS-ELISA检测
称取病毒侵染的大豆粉 0. 1 g,加入病毒抽提
缓冲液 1 mL研磨,8 000 rpm离心 5 min,上清液即
为病毒粗提液。 采用 Agdia公司的 DAS-ELISA试
剂盒检测 BPMV 和 TRSV,具体操作同常规 DAS-
ELISA方法。
1. 5　 RNA提取、cDNA第一链合成和 RT-PCR
RNA提取、cDNA 第一链合成和 RT-PCR 参
照已发表方法[9]。 RNA 提取时最后用 60 μL
RNase-free ddH2O洗脱;在做双重 PCR 检测时,将
TRSV和 BPMV的引物等量混合后加入。
1. 6　 实时荧光 PCR反应
反应在 ABI 7500 Fast 实时荧光 PCR 仪上进
行,体系为 25 μL,单一实时荧光 PCR 参考我们已
经报道的方法[9]。 双重实时荧光 PCR体系包括模
板(cDNA或质粒)1 μL、2 × buffer 12. 5 μL、上下
游引物各 0. 5 μL(20 μmol / L,BPMV 和 TRSV 引
物等体积混合后取)、探针 0. 5 μL(20 μmol / L,
BPMV和 TRSV探针等体积混合后取),加灭菌水
补足 25 μL。 反应条件:95℃预变性 10 min;95℃
30 s,60℃ 30 s,40 个循环。
1. 7　 双重实时荧光 PCR特异性测试
参照 Zhang 等[13] 的方法,反应体系中含有
BPMV和 TRSV 的引物和探针,将反应分为 3 组:
第一组以 BPMV的 cDNA为模板,第二组以 TRSV
的 cDNA为模板,第三组以二者混合物为模板,在
1. 6 反应条件下同管扩增。
1. 8　 灵敏度对比试验
1. 8. 1 　 DAS-ELISA 检测方法的灵敏度 　 由 1. 4
得到浓度为 100 mg / mL 病毒粗提液,再用病毒抽
提缓冲液将其稀释至浓度分别为 10 mg / mL、
1 mg / mL、100 μg / mL、10 μg / mL、1 μg / mL,并设
阴性对照和阳性对照,每个浓度吸取 100 μL 粗提
液用于 DAS-ELISA灵敏度检测。
1. 8. 2　 RT-PCR检测方法的灵敏度　 用无菌水稀
释合成的总 cDNA溶液,进行相对灵敏度检测,稀
释倍数依次为 10n(n =0、 - 1、 - 2、 - 3、 - 4、 - 5),
取 1 μL cDNA用于 RT-PCR反应。
1. 8. 3　 实时荧光 PCR 检测方法的灵敏度 　 用无
菌水稀释合成的 BPMV 和 TRSV cDNA 溶液,进
行相对灵敏度检测,稀释倍数依次为 10n ( n = 0、
-1、 -2、 - 3、 - 4、 - 5、 - 6),阳性对照样品用洗
脱缓冲液进行稀释,稀释倍数依次为 102n(n = -1、
-2、 -3、 -4、 - 5、 - 6),再取 1 μL cDNA 或质粒
进行实时荧光 PCR检测。
2　 结果与分析
2. 1　 BPMV和 TRSV引物及探针的特异性测试
根据 BPMV 和 TRSV的保守序列设计引物和
MGB探针,分别以带有 BPMV 和 TRSV 的大豆种
子作为检测对象,可以特异性地扩增目的条带(Ct
值分别为 24. 273 4 和 27. 815 8),而对携带 ToRSV
和 TBRV的大豆种子、健康大豆种子及空白对照
没有扩增,呈阴性(图 1-A、1-B),说明针对 BPMV、
TRSV设计的引物和探针特异性强,可与其他植物
病毒区分开来。 当每一反应管中两对引物和两对
探针同时存在时,只有对应模板被加入才发生相应
的实时荧光 PCR扩增反应;两模板同时加入时,既
不发生交叉反应也不影响各自反应效率(图 1-C)。
2. 2　 阳性对照样品检测
将 BPMV 和 TRSV 的质粒 (浓度均为 35
ng / μL)分别按 10 -2、10 -4、10 -6、10 -8、10 -10、10 -12
稀释后取 1 μL 进行实时荧光 PCR 反应。 其中
BPMV可以检测到 10 -10(Ct值为 39. 213 9),即能
检测到 3. 5 fg / mL(图 2-A);而 TRSV 只能检测到
10 -8(Ct 值为 38. 881 4),即可检测到的浓度为
0. 35 pg / mL(图 2-B),可见,当二者浓度相当时,
BPMV更易被检出,这也验证了荧光基团 FAM 的
扩增效率要比 HEX高。 当二者等体积混合后进行
反应,二者可同时检测到 35 pg / mL(图 2-C,其中
BPMV 的 Ct 值为 36. 207 4、 TRSV 的 Ct 值为
35. 965),表明本实验所建立的单管双重实时荧光
PCR方法同时检测等浓度的 BPMV和 TRSV的效
率相当。
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植物病理学报 41 卷
Fig. 1　 Specificity of real-time PCR for detection of Bean pod mottle virus
and Tobacco ringspot virus in soybean seeds
A: BPMV from soybean seeds; B: TRSV from soybean seeds; C: Simulanteous
detection BPMV and TRSV from soybean seeds. 1: BPMV; 2: TRSV.
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　 1 期 　 易汪雪,等:单管实时荧光 RT-PCR方法同时检测大豆种子中的菜豆荚斑驳病毒和烟草环斑病毒
Fig. 2　 Detection sensitivity of plasmids including Bean pod mottle
virus and Tobacco ringspot virus CP gene
A: Hundred-fold serial dilutions of BPMV plasmid from 20 μg to 20 ng. 10 -2(1), 10 -4(2), 10 -6(3), 10 -8(4), 10 -10
(5), the others are 10 -12 and healthy control; B: Hundred-fold serial dilutions of TRSV plasmid from 20 μg to 20 ng.
10 -2(1), 10 -4(2), 10 -6(3), 10 -8(4), the others are 10 -10, 10 -12 and healthy control; C: Hundred-fold
serial dilutions of BPMV and TRSV plasmids from 20 μg to 20 ng in one tube. BPMV-10 -2(1),
TRSV-10 -2(2), BPMV-10 -4(3), TRSV-10 -4(4), BPMV-10 -6(5), TRSV-10 -6(6) .
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植物病理学报 41 卷
2. 3　 实验样品的相对灵敏度检测
2. 3. 1　 DAS-ELISA方法的灵敏度试验　 称取 100
mg携带 BPMV和 TRSV的大豆粉,将病毒粗提液
依次稀释为终浓度为 100 mg / mL、 10 mg / mL、
1 mg / mL、100 μg / mL、10 μg / mL、1 μg / mL 的样
品,分别吸取各浓度 100 μL 进行 DAS-ELISA 检
测。 结果表明,浓度为 100 mg / mL 的样品有阳性
反应(BPMV 的 OD405 > 0. 214;TRSV 的 OD405 >
0. 298),而 10 mg / mL、1 mg / mL、100 μg / mL、10
μg / mL、1 μg / mL 的样品及阴性对照的反应结果
为阴性(表 2)。 表明 DAS-ELISA检测方法可检测
到 10 mg的携带 BPMV及 TRSV的大豆粉。
2. 3. 2 　 RT-PCR 的灵敏度试验 　 将 BPMV 和
TRSV的总 cDNA 按 10 倍梯度稀释,用于两种病
毒的双重 RT-PCR灵敏度研究,结果表明,二者稀
释 10 倍后仍可同时检出(图 3),经计算,相当于 10
μg的含有 BPMV和 TRSV的混合大豆粉。
2. 3. 3 　 实时荧光 PCR 的灵敏度试验　 将 BPMV
和 TRSV 的 cDNA 按 10n ( n = 0、 - 1、 - 2、 - 3、
-4、 - 5、 - 6)进行稀释,用单管双重实时荧光
PCR检测不同稀释浓度的扩增情况(表 3),当稀释
到 10 -3(经计算,结果相当于 100 ng 的 BPMV 大
豆粉)时,实时荧光 PCR还能扩增到 BPMV(Ct 值
为 37. 791 6),但继续稀释到 10 -4时则没有扩增;
而 TRSV则可检测到 10 -6 (计算后相当于 100 pg
的 TRSV大豆粉),Ct 值为 39. 227 3,综合比较阳
性对照样品的检测结果得出:该大豆种子中 BPMV
的含量较 TRSV的低,同时二者在 100 ~ 10 -3稀释
度时均可被同时检出。 因此,在实际应用中,即使
种子带毒量不相当时,也可以在同一管中同时进行
Table 2　 Sensitivity of DAS-ELISA for detection of Bean pod mottle
virus and Tobacco ringspot virus
Extraction solution (bulbs / mL) BPMV (OD405) TRSV (OD405)
100 mg 0. 286 ( + ) 0. 336 ( + )
10 mg 0. 195 ( - ) 0. 218 ( - )
1 mg 0. 152 ( - ) 0. 153 ( - )
100 μg 0. 151 ( - ) 0. 147 ( - )
10 μg 0. 147 ( - ) 0. 141 ( - )
1 μg 0. 145 ( - ) 0. 133 ( - )
Positive control 0. 774 ( + ) 1. 215 ( + )
Negative control 0. 117 ( - ) 0. 149 ( - )
+ : Positive; - : Negative.
Fig. 3　 Sensitivity of RT-PCR for detection of Bean pod mottle virus and
Tobacco ringspot virus from soybean seeds
M: DL2000 marker; 1-6: cDNA of BPMV and TRSV at dilutions of 100, 10 -1, 10 -2, 10 -3, 10 -4 and 10 -5 .
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　 1 期 　 易汪雪,等:单管实时荧光 RT-PCR方法同时检测大豆种子中的菜豆荚斑驳病毒和烟草环斑病毒
实时荧光 PCR 检测,以提高工作效率。 与 DAS-
ELISA灵敏度结果比较可知,实时荧光 PCR 检测
BPMV和 TRSV 的灵敏度分别是 DAS-ELISA 灵
敏度的 103、106 倍;与 RT-PCR 灵敏度结果比较表
明,双重实时荧光 PCR检测灵敏度是双重 RT-PCR
灵敏度的 100 倍。
Table 3　 Ct value detection of Bean pod mot-
tle virus and Tobacco ringspot virus
for the soybean seeds infected by
the two viruses in one tube
Dilution BPMV (Ct) TRSV (Ct)
100 29. 007 3 18. 833 5
10 -1 30. 778 5 22. 246 8
10 -2 34. 303 0 25. 859 3
10 -3 37. 791 6 29. 262 2
10 -4 - 33. 080 2
10 -5 - 36. 573 2
10 -6 - 39. 227 3
Healthy control - -
- : Negative.
3　 结论与讨论
BPMV和 TRSV均是危害大豆生产的重要病
害,其中种子传播又是其远距离传播的重要途径,
因此快速、灵敏、准确、简便的检测方法的建立是十
分有意义的。 以往的血清学检测方法虽然简单易
于操作,但容易出现假阳性结果,故只适合于初筛;
普通的 PCR技术最终需要接触致癌物质 EB,容易
对实验操作人员造成伤害,以及对实验室的环境造
成污染。 实时荧光技术是最近几年发展最快的技
术之一,它由荧光系统和普通 PCR 扩增系统相结
合,克服了普通 PCR技术的不足,且简化了检测过
程。 本实验利用两种 MGB 荧光探针实时检测两
个目的基因的扩增,在同一管中 RT-PCR与探针检
测同时进行,整个检测过程只需一小时三十分钟左
右,且只需在加样时打开一次盖子,其后的过程完
全是闭管操作,不需要 PCR 后处理,消除了 PCR
产物的污染,减少了检测步骤,节省了时间,解决了
以往同时检测 BPMV和 TRSV方法存在的不足之
处,具有较好的应用前景。 与普通双重 PCR 相比
较,该方法更加灵敏,对种子中这种病毒的含量要
求不及普通 RT-PCR严格,这对于种子中同时含有
BPMV和 TRSV且含量较低时的检测尤为有用。
本研究根据 BPMV和 TRSV 各分离物基因的
保守序列设计引物和探针,将 BPMV 及 TRSV 的
特异性片段分别克隆到 pMD18-T 载体上,然后提
取质粒,并以质粒作为理论标准品,优化反应条件
并成功建立了 BPMV 和 TRSV 的双重实时荧光
PCR检测技术。 研究结果表明,该研究方法具有
以下特点:(1)特异性强,二者均无模板的非特异
性扩增,并且二者在同一管反应时也无交叉反应,
适于同时对这两种病毒同时进行实时荧光 PCR检
测。 (2)灵敏度高,由以上结果可以看出,在二者
浓度相当时,其检测限也相当,当不明样品中二者
含量比例不同时,在一定的稀释度内也可同时将其
扩增出来,这非常适合带毒量无法计算的口岸检
测。 (3)操作简单迅速,在同一管中同时检测出两
种病毒,大大缩短了检测时间,使工作效率得到大
幅度提高。 本实验做了绝对灵敏度的分析,还未发
挥实时荧光 PCR 技术的定量优势,由于本研究未
获得纯病毒,因此,无法对实时荧光 PCR 检测
BPMV及 TRSV的灵敏度进行绝对定量。 同时,由
于实际检测样品的复杂性,对其检测灵敏度的绝对
定量意义也不是非常大。 在研究过程中,我们还尝
试做了带有 BPMV 和 TRSV 的大豆种子分别以
1∶ 10 至 10∶ 1 的比例掺合,然后提取 RNA 进行实
时荧光检测,都能同时检测出两种病毒(图表未
列)。 因此,具有诸多优点的双重实时荧光技术在
病毒检测方面有着广阔的应用前景,同时该方法的
建立在农业生产、种子流通及种子检验检疫中具有
重大意义。
参考文献
[1] 　 Sinclair J B, Shurtleff M C. Compendium of soybean
diseases [M] . Minesota: Academic Press, 1980.
[2] 　 Ross J P. Response of early- and late-planted soybeans
to natural infection by Bean pod mottle virus [ J] .
Plant Disease, 1986, 70: 222 -224.
[3] 　 Wei M S. Brief introduction for seed-transmitted virus
of U. S. soybean ( in Chinese) [ J] . Plant Quarantine
(植物检疫), 2003, 17: 13 -17.
[4] 　 Liao F, Guo J Z, Liu P, et al. Detection of Bean pod
19
　
植物病理学报 41 卷
mottle virus in soybean by one step assay of RT-PCR
and real-time fluorescent RT-PCR ( in Chinese) [ J] .
Acta Phytophylacica Sinica(植物保护学报), 2009,
36(2): 141 -145.
[5] 　 Kong B H, Cai H, Chen R H, et al. The study on de-
tection Tobacco ring-spot virus (TRSV) by RT-PCR
( in Chinese) [J] . Journal of Yunnan Agricultural U-
niversity(云南农业大学学报), 2001, 16(1): 13 -
15.
[6] 　 Xia M X, Zhao W J, Ma Q, et al. Rapid detection of
tomato bacterial canker ( Clavibacter michiganensis
subsp. michiganensis) with real-time fluorescent PCR
( in Chinese) [J] . Acta Phytopathologica Sinica(植物
病理学报), 2006, 36(2): 152 -157.
[7] 　 Qi Y X, Zhu S F, Zhao W J, et al. Detection and i-
dentification of Pantoea stewartii using TaqMan probe
( in Chinese) [ J] . Acta Phytophylacica Sinica(植物
保护学报), 2004, 31(1): 51 -56.
[8] 　 Guo L X, Xiang B C, Chen H Y, et al. Detection of
Apple stem grooving virus by real-time fluorescent RT-
PCR one step assay ( in Chinese) [ J] . Acta Phyto-
pathologica Sinica(植物病理学报), 2006, 36(1): 57
-61.
[9] 　 Yu C, Yang C Y, Zhang S Y. Development and com-
parative studies of several PCR for detecting Arabis
mosaic virus ( in Chinese) [J] . Acta Phytopathologica
Sinica(植物病理学报), 2008, 38(4): 388 -393.
[10] Deng C L, Lv Y F, Liang X M, et al. Method for de-
tecting Arabis mosaic virus by RT-Realtime PCR ( in
Chinese) [ J] . Plant Quarantine(植物检疫), 2008,
22(2): 80 -82.
[11] Schaad N W, Opgenorthe D, Gaush P. Real-time poly-
merase chain reaction for one-hour on-site diagnosis of
pierce′w disease of grape in early seanson asymptoma-
tic vins. Phytopathology, 2002, 92(7): 721-727.
[12] Schaad N W, Frederick R D. Real-time PCR and its
application for rapid plant disease diagnostics [ J] .
Can. J. Plant Pathol. , 2002, 24: 250-258.
[13] Zhang Y, Liu C J, Qin Y A, et al. Application of dup-
lex fluorescent quantitative polymerase-chain-reaction
for detecting marek′s disease virus serotype 1 ( in Chi-
nese) [ J] . Chinese Journal of Prewentive Veterinary
Medicine(中国预防兽医学报), 2007, 29(1): 46 -
51.
责任编辑:李晖
29