全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(６): ６２９￣６３３(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣０６￣２１ꎻ 修回日期: ２０１４￣０８￣１２
基金项目: 宁波市科研项目(２０１１Ｃ５００８０)ꎻ国家质检总局项目(２０１３ＩＫ２７９)
通讯作者: 张吉红ꎬ副研究员ꎬ主要从事动植物检验检疫研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｚｈａｎｇｊｈ＠ｎｂｃｉｑ.ｇｏｖ.ｃｎꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０６.００９
逆转录环介导等温扩增技术检测烟草环斑病毒的研究
张吉红１∗ꎬ 陈先锋１ꎬ 孙 辉２
( １宁波出入境检验检疫局ꎬ宁波 ３１５０１２ꎻ ２宁波市农业环境与农产品质量监督管理总站ꎬ宁波 ３１５０１２)
摘要:本研究采用环介导等温扩增技术(Ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬ ＬＡＭＰ)ꎬ建立了一种快速、简便的烟草环斑
病毒检测方法ꎮ 根据 ＴＲＳＶ外壳蛋白编码基因上的 ８个位点ꎬ共设计了 ６条引物ꎬ通过 ＲＴ￣ＬＡＭＰ扩增得到特征性的梯度
条带ꎮ 特异性试验表明ꎬ引物对 ＴＲＳＶ的检测具有良好的特异性ꎻ灵敏度试验显示 ＲＴ￣ＬＡＭＰ比普通 ＲＴ￣ＰＣＲ高 １０倍ꎮ 通
过反应温度和时间的优化ꎬ该方法只需在水浴锅中 ６０℃等温扩增 ６０ ｍｉｎꎬ整个检测周期约 １.５ ｈꎬ结果采用 ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ染
色显示ꎬ易于观察和判定ꎮ
关键词:烟草环斑病毒ꎻ 环介导等温扩增ꎻ 检测
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｂａｃｃｏ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ＲＴ￣ＬＡＭＰ　 ＺＨＡＮＧ Ｊｉ￣ｈｏｎｇ１ꎬ ＣＨＥＮ
Ｘｉａｎ￣ｆｅｎｇ１ꎬ ＳＵＮ Ｈｕｉ２ 　 ( １Ｎｉｎｇｂｏ Ｅｎｔｒｙ￣Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ＢｕｒｅａｎꎬＮｉｎｇｂｏ ３１５０１２ꎬＣｈｉｎａꎻ２Ｎｉｎｇｂｏ Ｃｅｎｔｒａｌ
Ｓｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔꎬ Ｎｉｎｇｂｏ ３１５０１２ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ Ｔｏｂａｃｃｏ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ (ＴＲＳＶ ) ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ
Ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ (ＬＡＭＰ) . Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｅｉｇｈｔ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ＴＲＳＶ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ
ｇｅｎｅｓꎬ ｓｉｘ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｌａｄｄｅｒ￣ｌｉｋｅ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ＲＴ￣ＬＡＭＰ. Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ
ｔｅｓｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＲＳＶ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ｗａｓ
１０ ｔｉｍｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ＲＴ￣ＰＣＲ. Ｂｙ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｏｆ　 ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｉｍｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎꎬ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｊｕｓｔ ｎｅｅｄ ｔｈｅ
ｐｏｔ ｗｉｔｈ ａ ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ ６０℃ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ６０ ｍｉｎꎬ ｔｈｅ ｅｎｔｉｒｅ ｔｅｓｔｉｎｇ ｃｙｃｌｅ ｉｓ ａｂｏｕｔ １.５ ｈꎬ ａｎｄ ｉｔ ｉｓ
ｖｅｒｙ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｔｏｂａｃｃｏ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ (ＴＲＳＶ)ꎻＬｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ (ＬＡＭＰ)ꎻｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
中图分类号: Ｓ４３２　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０６￣０６２９￣０５
　 　 烟草环斑病毒(Ｔｏｂａｃｃｏ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓꎬＴＲＳＶ)
隶属豇豆花叶病毒科(Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ)线虫传多面体
病毒属(Ｎｅｐｏｖｉｒｕｓ)ꎬ在进境的植物种球和苗木中
携带该病毒的风险很大[１]ꎬ是我国明确规定禁止
入境的检疫性有害生物ꎮ ＴＲＳＶ 分布于日本、澳大
利亚、英国和美国等 ３０ 多个国家ꎮ 该病毒寄主范
围广ꎬ可侵染 ５２ 科 ２４６ 种植物ꎬ是果树、蔬菜和花
卉等经济作物的重要病害之一ꎬ发生严重时可导致
绝产[２]ꎮ
　 　 目前ꎬ国内外针对 ＴＲＳＶ 的检测技术主要有
ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ、ＲＴ￣ＰＣＲ 和 ＩＣ￣ＲＴ￣ＰＣＲ 技术等[３~６]ꎮ
与 ＬＡＭＰ 方法比较ꎬ上述方法对 ＴＲＳＶ 的检测均
具有较高的灵敏度ꎬ其中 ＩＣ￣ＲＴ￣ＰＣＲ 灵敏度最高ꎬ
但该方法操作复杂ꎬ步骤较多ꎬ适用于可疑样品的
检验ꎮ ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ 和 ＲＴ￣ＰＣＲ 方法灵敏度相当ꎬ
稍低于 ＬＡＭＰ方法ꎮ 相比传统的电镜观察和生物
学鉴定ꎬ血清学方法具有操作简单和高通量的优
点ꎬ但制备高质量的血清ꎬ难度大且成本较高ꎮ
ＲＴ￣ＰＣＲ需要进行 ＰＣＲ后处理ꎬ接触 ＥＢ等有毒试
剂ꎬ易发生交叉污染造成假阳性结果ꎮ
　 　 环介导等温扩增技术(Ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒ￣
ｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬ ＬＡＭＰ)作为一种新的核酸扩增
　
植物病理学报 ４４卷
方法ꎬ具有检测速度快、操作简单和灵敏度高等优
点ꎮ 该技术依赖于能够识别靶序列上 ６ 个特异区
域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的
Ｂｓｔ ＤＮＡ酶ꎬ在等温条件下可高效、快速和特异地
扩增靶序列[７]ꎮ 基于以上优点ꎬ本文针对烟草环
斑病毒的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ检测方法进行了研究ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 供试材料
　 　 含有 ＴＲＳＶ 的阳性样品物质购自美国 Ａｇｄｉａ
公司ꎬ样品状态为新鲜叶片经液氮处理ꎬ磨成粉末
状ꎬ冷藏于 ４℃冰箱保存ꎮ 含有 ＴＲＳＶ 的大豆样品
由本实验室从美国进境大豆中截获ꎬ经 ＤＡＳ￣
ＥＬＩＳＡ和普通 ＲＴ￣ＰＣＲ 检测确认为阳性ꎮ 番茄环
斑病毒(Ｔｏｍａｔｏ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓꎬＴｏＲＳＶ)、香石竹环
斑病毒(Ｃａｒｎａｔｉｏｎ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓꎬＣＲＳＶ)、黄瓜绿
斑驳病毒 (Ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｇｒｅｅｎ ｍｏｔｔｌｅ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓꎬ
ＣＧＭＭＶ)、南芥菜花叶病毒(Ａｒａｂｉｓ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓꎬ
ＡｒＭＶ)和马铃薯 Ｖ 病毒(Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ ＶꎬＰＶＶ)等
阳性标准物质也都购自美国 Ａｇｄｉａ公司ꎮ
　 　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 引物由上海英骏生物技术公司合
成ꎬ核酸提取试剂 Ｔｒｉｚｏｌ 购自上海生物工程公司ꎬ
ＲＴ￣ＬＡＭＰ扩增试剂盒由本实验室研制ꎬＯｎｅ￣ｓｔｅｐ
ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ与 ＤＬ￣２０００ ｍａｒｋｅｒ购自大连 ＴａＫａＲａ
公司ꎮ
１.２　 引物设计
　 　 根据 ＧｅｎＢａｎｋ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ.
ｇｏｖ)中已登录的烟草环斑病毒的外壳蛋白基因序
列(Ｌ０９２０５)ꎬ采用 Ｂｌａｓｔ 程序进行同源性比较ꎬ在
序列的保守区ꎬ使用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ３.０ 软件ꎬ设计
得到 Ｆ３、Ｂ３、 ＦＩＰ ( Ｆ１ｃ ＋ ＴＴＴＴ ＋ Ｆ２)、ＢＩＰ (Ｂ１ｃ ＋
ＴＴＴＴ＋Ｂ２)、Ｌｏｏｐ１ 和 Ｌｏｏｐ２ 共 ６ 条引物ꎬ分别识
别外壳蛋白编码基因的 ８个位点(表 １)ꎮ
１.３　 烟草环斑病毒的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ扩增
　 　 总 ＲＮＡ提取:采用文献[８]试剂方法提取ꎮ
　 　 反应体系:２×ＲＴ￣ＬＡＭＰ Ｍｉｘ １０ μＬꎬ引物 Ｆ３
和 Ｂ３各为 ０.２ μｍｏｌ / ＬꎬＬｏｏｐ１ 和 Ｌｏｏｐ２ 的终浓度
各为 ０. ８ μｍｏｌ / ＬꎬＦＩＰ 和 ＢＩＰ 的终浓度各为 １. ６
μｍｏｌ / ＬꎬＢｓｔ ＤＮＡ聚合酶(５ Ｕ / μＬ)１.５ μＬꎬＡＭＶ
ＲＮＡ聚合酶(５ Ｕ / μＬ) １ μＬꎬ模板 ＲＮＡ １μＬꎬ用
ｄｄＨ２Ｏ 补充至总体积 ２０ μＬꎮ 取 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ
(１０ ０００×)０.１ ｍＬ加至反应管盖上ꎬ６０℃恒温水浴
锅中扩增 １ ｈꎮ
　 　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 结果分析:反应结束后ꎬ在不开盖
的情况下离心反应管ꎬ使染色剂与扩增产物混合ꎬ
肉眼观察试验结果ꎬ或取 １０ μＬ 扩增产物进行 ２.
０％琼脂糖凝胶电泳ꎬ在 ＧｅｌＤｏｃ￣２０００(Ｂｉｏ￣Ｒａｄ)凝
胶成像系统上观察并记录结果ꎮ
１.４　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ的检测反应温度优化试验
　 　 以烟草环斑病毒 ＲＮＡ 为模板ꎬ按照建立的
ＲＴ￣ＬＡＭＰ检测方法ꎬ分别在 ５８℃、６０℃、６３℃和 ６５℃
４个温度条件下进行扩增ꎬ反应时间为 １ ｈꎮ 每个温
度条件设置 ２个 ＲＮＡ样品重复ꎬ１个空白对照ꎮ
１.５　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ的检测反应时间优化试验
　 　 以烟草环斑病毒 ＲＮＡ 为模板ꎬ按照建立的
ＲＴ￣ＬＡＭＰ检测方法ꎬ分别在 ３０ ｍｉｎ、６０ ｍｉｎ 和 ９０
ｍｉｎ ３ 个时间条件下进行扩增ꎬ反应温度为 ６０℃ꎮ
每个时间条件设置 ２ 个 ＲＮＡ 样品重复ꎬ１ 个空白
对照ꎮ
Ｔａｂｌｅ １　 Ｔｈｅ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＲＳＶ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ(５′￣３′) Ｓｏｕｒｃｅ
Ｆ３ ｃｃａｇｃｃｃａｃｇｔｔｇｔａｃｔｔｔ
Ｂ３ ｔｔｇａｔｇｇｇｔｃａａｃｔｔｃｃａｔ
Ｌｏｏｐ１ ｔｔｇｇｃａｇｔｇｔａｔｔｇｔｔａｃｃａｔｇｃ
Ｌｏｏｐ２ ａｔｔｃａａｔｔｇｇｇｔｇａｔａｃｔｔｔｃｇｃ
ＦＩＰ ａｃａｔｇｇｇｇｃｃｃｇｔｃａｔｔｇａｔｔｔｔｔｔｃｃａｃａａａｔｃａａｇｔａａｃｇａｔｇｇｃ
ＢＩＰ ｇａｇｔｔａａａｔａａｔｃｃａａｃｔａｔｇａｃｇｔｇｇｃｔｔｔｔｃａｔｔｇａｔａｇａｔａｔｔａｔｇａｇｇｃｇａａａｇａ
Ｌ０９２０５ / ＡＦ４６１１６３ / ＡＹ３６３７２７ / Ｕ５０８６９
　
０３６
　
　 ６期 张吉红ꎬ等:逆转录环介导等温扩增技术检测烟草环斑病毒的研究
１.６　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ的特异性试验
　 　 以烟草环斑病毒、番茄环斑病毒、香石竹环斑病
毒、黄瓜绿斑驳病毒、南芥菜花叶病毒以及马铃薯 Ｖ
病毒等多种植物病毒 ＲＮＡ为模板ꎬ按照建立的烟草
环斑病毒 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 检测方法ꎬ进行特异性研究ꎮ
其中ꎬ烟草环斑病毒设置 ２个 ＲＮＡ样品重复ꎬ其余
病毒设置 １个 ＲＮＡ样品ꎬ并设置 １个空白对照ꎮ
１.７　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ的检测灵敏度试验
　 　 将提取好的烟草环斑病毒 ＲＮＡ 模板进行 １０
倍系列稀释ꎬ得到 １０－１、１０－２、１０－３、１０－４和 １０－５稀释
的病毒 ＲＮＡ 样品ꎮ 采用建立的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 和
ＲＴ￣ＰＣＲ方法进行扩增灵敏度比对试验ꎮ
１.８　 烟草环斑病毒 ＲＴ￣ＰＣＲ检测方法的建立
　 　 ＲＴ￣ＰＣＲ反应体系参照 Ｏｎｅ￣ｓｔｅｐ ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ
试剂盒说明进行ꎬ其中引物为 Ｆ３和 Ｂ３ꎮ 反应条件
如下:５０℃ ｃＤＮＡ合成 ３０ ｍｉｎꎬ９４℃预变性 ２ ｍｉｎꎻ
９４℃变性 ３０ ｓꎬ５８℃复性 ３０ ｓꎬ７２℃延伸 １ ｍｉｎꎬ３５
个循环ꎻ最后 ７２℃延伸 ５ ｍｉｎꎮ
１.９　 大豆样品中 ＴＲＳＶ的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ快速检测
　 　 取已用 ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ 和普通 ＲＴ￣ＰＣＲ 检测呈
ＴＲＳＶ阳性的进境美国大豆样品ꎬ采用本研究建立
的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ方法进行扩增检测ꎬ结果采用 ＳＹＢＲ
ｇｒｅｅｎ Ｉ染色观察ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ检测反应温度优化试验结果
　 　 相同反应时间条件下ꎬ在 ６０℃等温扩增时ꎬ
ＲＴ￣ＬＡＭＰ产物条带清晰明亮(图 １)ꎮ 由此ꎬ确定
６０℃为最佳反应温度ꎮ
Ｆｉｇ. １ 　 Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ
ＲＴ￣ＬＡＭＰ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ＴＲＳＶ
Ｍ: ＤＬ￣２０００ Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １￣３: ５８℃ꎻ Ｌａｎｅ ４￣６: ６０℃ꎻ
Ｌａｎｅ ７￣９: ６３℃ꎻ Ｌａｎｅ １０￣１２: ６５℃ꎻ Ｌａｎｅ １ꎬ２ꎬ４ꎬ５ꎬ７ꎬ８ꎬ１０ꎬ
１１: ＴＲＳＶ ＲＮＡꎻ Ｌａｎｅ ３ꎬ６ꎬ９ꎬ１２: Ｃｏｎｔｒｏｌ.
２.２　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ检测反应时间优化试验结果
　 　 在 ６０℃等温扩增条件下ꎬ６０ ｍｉｎ 和 ９０ ｍｉｎ 扩
增产物条带在亮度和清晰度方面没有显著差异
(图 ２)ꎬ故确定 ６０ ｍｉｎ为最佳反应时间ꎮ
Ｆｉｇ. ２　 Ｔｉｍｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ａｍｐｌｉ￣
ｆｉｅｄ ＴＲＳＶ
Ｍ: ＤＬ￣２０００ Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １￣３: ３０ ｍｉｎꎻ Ｌａｎｅ ４￣６: ６０ ｍｉｎꎻ
Ｌａｎｅ ７￣９: ９０ ｍｉｎꎻ Ｌａｎｅ １ꎬ２ꎬ４ꎬ５ꎬ７ꎬ８: ＴＲＳＶ ＲＮＡꎻ Ｌａｎｅ
３ꎬ６ꎬ９: Ｃｏｎｔｒｏｌ.
２.３　 烟草环斑病毒 ＲＴ￣ＬＡＭＰ特异性扩增结果
　 　 烟草环斑病毒的阳性标准物质经过ＲＴ￣ＬＡＭＰ
扩增后ꎬ能够得到特异性的梯度条带ꎬ而其他病毒
毒株的 ＲＮＡ模板则无扩增条带出现ꎬ空白对照中
无特异性基因条带(图 ３)ꎮ 这表明本研究设计的
６条引物针对 ＴＲＳＶ的检测具有非常好的特异性ꎮ
Ｆｉｇ. ３ 　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍｐｌｉｆｉ￣
ｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＲＳＶ
Ｍ: ＤＬ￣２０００ Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １ꎬ２: ＴＲＳＶꎻ Ｌａｎｅ ３:ＴｏＲＳＶꎻ
Ｌａｎｅ ４:ＣＲＳＶꎻ Ｌａｎｅ ５:ＣＧＭＶꎻ Ｌａｎｅ ６:ＡｒＭＶꎻ Ｌａｎｅ ７:
ＰＶＶꎻ Ｌａｎｅ ８: Ｃｏｎｔｒｏｌ.
２.４　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ检测灵敏度试验
　 　 不同稀释梯度的烟草环斑病毒 ＲＮＡ 经过
ＲＴ￣ＬＡＭＰ扩增后ꎬ其检测灵敏度为 １０－３病毒稀释
１３６
　
植物病理学报 ４４卷
液ꎬ比普通 ＲＴ￣ＰＣＲ扩增灵敏度高出 １０倍(图 ４)ꎮ
Ｆｉｇ. ４ 　 Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ａｎｄ ＲＴ￣ＰＣＲ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ＴＲＳＶ
Ｍ: ＤＬ￣２０００ Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １￣５: １０－１ ￣１０－５ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｏｆ
ＲＴ￣ＬＡＭＰꎻ Ｌａｎｅ ７￣１１: １０－１ ￣１０－５ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＲＴ￣ＰＣＲꎻ Ｌａｎｅ
６ꎬ１２:Ｃｏｎｔｒｏｌ.
２.５　 扩增产物的观察
　 　 本研究在 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 产物中加入 ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ
Ｉ染色剂ꎬ对照颜色呈橙红色ꎬ而有扩增产物则呈
绿色(图 ５￣Ａ)ꎮ 在紫外灯下观察ꎬ空白对照和阴性
样品管均没有发出白色荧光ꎬ而阳性样品管则发出
白色荧光ꎬ且白色荧光的亮度与 ＲＮＡ 模板浓度的
高低成正比(图 ５￣Ｂ)ꎮ ＲＴ￣ＬＡＭＰ 扩增产物用凝
胶电泳法和荧光染料 ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ 观察的结果
一致ꎮ
Ｆｉｇ. ５　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ
ｂｙ ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ
Ａ: Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｎａｋｅｄ￣ｅｙｅｓ ꎻ Ｂ: Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｕｌｔｒａ￣
ｖｉｏｌｅｔ ｌｉｇｈｔ. Ｌａｎｅ １￣５: １０－１ ￣１０－ ５ｄｉｌｕｔｉｏｎꎻ Ｌａｎｅ ６: Ｃｏｎｔｒｏｌ.
２.６　 大豆样品中 ＴＲＳＶ的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ快速检测结果
　 　 采用本研究建立的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 方法对大豆
ＴＲＳＶ 阳性样品进行检测ꎬ并用荧光染料 ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ Ｉ法观察ꎬ结果显示ꎬ阳性样品均显示明显的
绿色(图 ６)ꎮ
Ｆｉｇ. ６　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｏｙ￣
ｂｅａｎ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＴＲＳＶ
Ｌａｎｅ １ꎬ２: Ｓｏｙｂｅａｎ ｗｉｔｈ ＴＲＳＶꎻ Ｌａｎｅ ３: Ｈｅａｌｔｈｙ ｓｏｙｂｅａｎꎻ
Ｌａｎｅ ４: Ｃｏｎｔｒｏｌ.
３　 讨论
　 　 目前ꎬ环介导等温扩增技术已被逐渐应用于细
菌、病毒和寄生虫等生物的检测[９~１２]ꎮ ２００８ 年ꎬ
Ｈｕａｎｇ等[１３]利用 ＬＡＭＰ技术在几种常见的致病分
支杆菌中检测结核分支杆菌ꎬ结果表明ꎬＬＡＭＰ 技
术能在恒温条件下ꎬ１ ｈ 内检测出结核分枝杆菌ꎬ
且特异性明显ꎮ Ｐｏｏｎ 等[１４]采用 ＰＣＲ 和 ＬＡＭＰ 来
扩增甲型流感病毒的 ＲＮＡꎬ结果表明ꎬＬＡＭＰ 的灵
敏度比 ＰＣＲ 的高出 １０ 倍ꎮ 大量研究证明ꎬＬＡＭＰ
技术是一种快速、灵敏度高、特异性好的分子生物
学检测方法ꎮ
　 　 本研究建立的 ＴＲＳＶ ＲＴ￣ＬＡＭＰ 检测方法ꎬ在
２０ μＬ 的反应体系中ꎬ可检测到烟草环斑病毒
ＲＮＡ的 １０－３稀释度ꎬ比普通 ＲＴ￣ＰＣＲ 扩增灵敏度
高出 １０ 倍ꎮ Ｇｕｏ 等[１５]建立的烟草环斑病毒的
ＲＴ￣ＬＡＭＰ方法的检测灵敏度与普通 ＲＴ￣ＰＣＲ 方
法相同ꎬ两者结论稍有不同ꎬ究其原因可能是扩增
产物的浊度观察法的灵敏度较添加 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ
染料法略低ꎮ ＬＡＭＰ方法灵敏度高ꎬ容易出现假阳
性ꎮ 因此本研究采用在 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 反应管盖上滴
加 ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ Ｉ 染色剂ꎬ待反应结束后在不开盖
的情况下直接使染色剂与扩增产物混合ꎬ以此减少
反复开盖而造成的污染问题ꎮ
　 　 为了提高 ＴＲＳＶ检测的准确性及检测效率ꎬ本
２３６
　
　 ６期 张吉红ꎬ等:逆转录环介导等温扩增技术检测烟草环斑病毒的研究
研究在国内外首次建立了该病毒的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 检
测方法ꎮ 通过温度和反应时间的优化ꎬ使该病毒的
检测从核酸抽提到结果观察的整个检测周期只需
１.５ ｈꎬ而检测灵敏度比常规 ＲＴ￣ＰＣＲ检测方法高出
１０倍ꎮ 另外ꎬ反应是在 ６０℃等温条件下进行ꎬ不需
要昂贵的精密仪器ꎬ降低了检测成本ꎬ反应结果可
以用肉眼直接判断ꎬ操作简单ꎬ非常适合在口岸现
场使用ꎮ
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病理学报)ꎬ ２００７ꎬ３４(１):６１－６６.
[５] 　 Ｗｅｎ Ｗ Ｇ ꎬＣｕｉ Ｊ Ｘꎬ Ｓｈｅｎｇ Ｌ. Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｔｏｂａｃｃｏ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｉｍｐｏｒｔｅｄ ｓｏｙｂｅａｎ ｓｅｅｄｓ[ Ｊ] .
Ｓｏｙｂｅａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ(大豆科学)ꎬ ２００７ꎬ２６(５):７４８－７５１.
[６] 　 Ｙａｎｇ Ｃ Ｙꎬ Ｃａｏ Ｊꎬ Ｙｕ Ｃꎬｅｔ ａｌ.Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ＲＴ￣ＰＣＲ
ａｎｄ ＩＣ￣ＲＴ￣ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｔｏｂａｃｃｏ ｒｉｎｇｓｐｏｔ
ｖｉｒｕｓ[ Ｊ] . Ａｃｔａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ Ｓｈａｎｇｈａｉ (上海农业学
报)ꎬ２００７ꎬ２３(１):８３－８７.
[７] 　 Ｎｏｔｏｍｉ Ｔꎬ Ｏｋａｙａｍａ ＨꎬＭａｓｕｂｕｃｈｉ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ. Ｌｏｏｐ￣
ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ [Ｊ] . Ｎｕｃｌｅ￣
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈꎬ２０００ꎬ２８(１２):６３.
[８] 　 Ｗｅｎ Ｗ Ｇꎬ Ｃｕｉ Ｊ Ｘꎬ Ｚｈａｏ Ｘ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｂｅａｎ ｐｏｄ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｓｅｍｉ￣ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ￣ＰＣＲ ｉｎ
ｉｍｐｏｒｔｅｄ ｓｏｙｂｅａｎ [ Ｊ] . Ａｃｔａ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ
(植物病理学报)ꎬ ２００６ꎬ３６(４):２９６－３００.
[９] 　 Ｐａｒｉｄａ Ｍꎬ Ｐｏｓａｄａｓ Ｇꎬ Ｉｎｏｕｅ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ
ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉ￣
ｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ [ Ｊ] . Ｊ.
Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.ꎬ２００４ꎬ４２(１):２５７－２６３.
[１０] Ｄｕｋｅｓ Ｊ ＰꎬＫｉｎｇ Ｄ ＰꎬＡｌｅｘａｎｄｅｒｓｅｎ Ｓ. Ｎｏｖｅｌ ｒｅｖｅｒｓｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ
ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｏｔ￣ａｎｄ￣ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ [ Ｊ] .
Ａｒｃｈ. Ｖｉｒｏｌ.ꎬ２００６ꎬ１５１:１０９３－１１０６.
[１１] Ｆｕｋｕｔａ ＳꎬＩｉｄａ ＴꎬＭｉｚｕｋａｍｉ Ｙꎬｅｔ ａｌ. Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｊａｐａ￣
ｎｅｓｅ ｙａｍ ｍｏｓｉｃ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ＲＴ￣ＬＡＭＰ [ Ｊ] . Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ
Ｖｉｒｏｌｏｇｙꎬ２００３ꎬ１４８:１７１３－１７２０.
[１２] Ｗａｎｇ Ｚ Ｇꎬ Ｚｈａｎｇ Ｓ Ｆꎬ Ｃａｏ Ｓ Ｎꎬ ｅｔ ａｌ. Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ｏｆ ＬＡＭＰ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ ｓｅｒｇｅｎｔｉ [ Ｊ ] .
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ(中
国预防兽医学报)ꎬ ２０１０ꎬ３２(２):１０８－１１１.
[１３] Ｈｕａｎｇ Ｆꎬ Ｌｉ ＬꎬＬｉｎ Ｓ Ｐꎬ ｅｔ ａｌ. Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｏｐ￣
ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ(ＬＡＭＰ) ｉｎ ｒａｐｉｄ ｄｅ￣
ｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ [ Ｊ ] . Ｍｏｄｅｒｎ
Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ (现代食品科技 )ꎬ
２００８ꎬ２４(８):８３５－８３８.
[１４] Ｐｏｏｎ Ｌꎬ Ｌｅｕｎｇ Ｃ ＳꎬＣｈａｎ Ｋ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ. Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｈｕｍｍａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒ￣
ｎａｌ ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ [Ｊ] . Ｊ. Ｃｌｉｎ.Ｍｃｒｏｂｉｏｌ.ꎬ２００４ꎬ４２５:１９５６
－１９６１.
[１５] Ｇｕｏ Ｌ Ｘꎬ Ｃｈｅｎ Ｘ Ｆꎬ Ｘｕ Ｙ Ｆꎬ ｅｔ ａｌ. Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｔｏｂａｃｃｏ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｓｅｅｄｓ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅｖｅｒｓｅ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｍｅｔｈｏｄ[ Ｊ] . Ｓｏｙｂｅａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ(大豆科学)ꎬ ２０１２ꎬ３１
(６):９８０－９８７.
责任编辑:曾晓葳
　 　
　 　
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