全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
!"#$("+(#$
&修改稿收到日期$
!"#$("1(!"
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基金项目$国家自然科学基金"
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!
%#!+"%%&
#&江苏省产学研联合创新资金前瞻性联合研究项目"
23!"#)#%#
#
!!
作者简介$徐
!
晟"
#&1%
#!男!博士!助理研究员!主要从事药用植物分子生物学研究(
!!"
通信作者$汪
!
仁!博士!副研究员!主要从事药用植物次生代谢等研究工作(
4(56.7
$
-
/860
9
:;0
!
67.
<
=0*>?5
石蒜
1(2$30
基因的克隆与表达特性分析
徐
!
晟!江宜龙!蒋明敏!卜
!
多!傅江燕!夏
!
冰!汪
!
仁"
"江苏省中国科学院植物研究所!南京
!#""#)
#
摘
!
要$
"
#
(
吡咯啉
($(
羧酸合成酶"
@$AB
#是植物渗透胁迫下谷氨酸途径合成脯氨酸的关键酶(该研究以石蒜"
!
"
#
$%&(&)*)+)
#为材料!采用同源克隆)
CDA4
方法结合
CE(@AC
技术克隆获得
!&,$-.
基因全长
>FGD
序列(序
列分析表明!
&,$-.
基因全长
!$!#H
I
!其中开放阅读框"
JCK
#为
!#%&H
I
!编码
+#%
个氨基酸!预测编码蛋白质
的分子量为
++*#&LF
!等电点为
,*%)
&
M:@$AB
是
#
个稳定的疏水蛋白!不含信号肽!不具有跨膜结构!具有
DDN
超基因家族和
DMFO(BK
超基因家族的保守结构域(氨基酸序列比对和系统进化树分析发现!
M:@$AB
与植物其
他
@$AB
蛋白具有较高的一致性!且与海枣
@P@$AB
及油棕
4
9
@$AB
聚为一类!亲缘关系最近(实时荧光定量
@AC
分析结果表明!
&,$-.
在根)鳞茎和叶片中均有表达!其中在鳞茎中的表达量最高(
!&,$-.
在
!"Q
聚乙二醇
"
@4R
#处理下的表达模式分析发现!
&,$-.
受
@4R
胁迫处理的诱导表达!其基因相对表达量在处理后
,S
达到
最高&随着处理时间的延长!
!&,$-.
基因相对表达量水平逐渐下调至对照水平(将
!&,$-.
连接到表达载体
I
4E(!16
上!转化获得
!&,$-.
编码基因的大肠杆菌
2M!#
"
F4%
#工程菌!通过
T@ER
诱导表达!
BFB(@DR4
分析表
达产物发现成功表达目的蛋白(该研究结果为进一步分析
!&,$-.
基因功能及石蒜抗逆分子育种奠定了基础(
关键词$石蒜&
,$-.
&脯氨酸&序列分析
中图分类号$
U+1$
&
U+1,
!!!
文献标志码$
D
%&"#
(
)!*+
,
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4
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2$306..5-"71
4
"&(-5($.-$#$
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9
5.0
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9
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X.60
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9
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9<
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9
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I
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I
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JCK
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9
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9
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3
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<
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石蒜"
!
"
$%&(&)*)+)
#为石蒜科"
D56:
<
7.(
P6>;6;
#石蒜属"
!
"
$%&(
#多年生草本植物!具有重要
的观赏和药用价值(石蒜适应性强!耐旱)耐湿和耐
瘠薄土壤!并有一定的耐阴性!是园林绿化造景的好
材料*#+(石蒜鳞茎含有石蒜碱"
7
<
>?:.0;
#)石蒜胺碱
"
7
<
>?:65.0;
#)石蒜伦碱"
7
<
>?:;0.0;
#)加兰他敏"
9
6(
760[S65.0;
#等多种石蒜科生物碱!临床上可用于治
疗阿尔茨海默式病和小儿麻痹症等疾病*!+(
"
#
(
吡咯啉
($(
羧酸合成酶"
"
#
(
I<
::?7.0;($(>6:H?^(
<
76[;/
<
0[S;[6/;
!
@$AB
!
4A!*+*!*##
%
#*!*#*)#
#是植
物通过谷氨酸途径合成脯氨酸的关键酶*%+!它是一个
双功能酶!具有
$
(
谷氨酰激酶和谷氨酰
$
(
半醛脱氢酶
活性!催化从谷氨酸合成脯氨酸的最初两步反应!其
活性受脯氨酸反馈抑制*)+(在逆境条件下!
,$-.
基
因的诱导表达伴随着脯氨酸合成的增加!因此!
,$-.
被认为是植物体一个重要的抗逆相关基因*$(,+(目
前!已经在豇豆)拟南芥)蒺藜苜蓿)高粱)大麦)普通
菜豆)水稻)普通烟草及唐古特白刺等多种植物中克
隆到了
,$-.
基因!并对它们在逆境胁迫下的表达模
式进行了研究*%!+(#)+(此外!大量研究表明!通过转基
因技术在植物体内过表达
,$-.
基因!能够显著提高
植物的耐旱和耐盐性*#$(!!+(
目前!对石蒜脯氨酸合成酶基因仍然没有很好
的研究!尚未有石蒜
,$-.
基因的相关报道(我们
在先前的研究发现!干旱胁迫下!石蒜属植物换锦花
和中国石蒜体内脯氨酸含量增加*!%+(本研究采用
同源克隆)
CDA4
"
:6
I
.P65
I
7.\.>6[.?0?\>FGD
;0P/
#技术结合
CE(@AC
技术从石蒜叶片中克隆到
#
个
,$-.
同源基因的全长
>FGD
"
!&,$-.
#!并对
其在渗透胁迫下的表达规律进行了分析&最后通过
构建原核表达载体!转化获得
!&,$-.
编码基因的
大肠杆菌
2M!#
"
F4%
#工程菌!通过
T@ER
成功诱导
表达出目的蛋白!为进一步研究
!&,$-.
及脯氨酸
在石蒜中的作用机制奠定基础(
#
!
材料和方法
;*;
!
材料及处理
实验材料为种植于江苏省中国科学院植物研究
所实验场的石蒜"
!
"
$%&(&)*)+)
#(选取大小)生
长状况一致的石蒜鳞茎!在其处于休眠期时移栽到
相同规格的塑料盆"直径
##>5
!高
#$>5
#中!盆土
为土)河沙和腐殖质的混合物"土
a
河沙
a
腐殖质
b
#a%a#
#!每盆装土
#L
9
(待其出叶后!选取叶片
长势一致的植株!置于光照培养箱中培养!培养条件
为光照
#,S
)黑暗
1S
)温度"
!!c!
#
d
)相对湿度
,"Q
!培养至二叶期供试备用(
聚乙二醇"
@4R
#处理$将石蒜材料根及鳞茎浸
于
!$Q@4R,"""
溶液中!分别于处理后的
"
)
#
)
%
)
,
)
#!
)
!)
和
)1S
取供试样品叶片!液氮冷冻后置于
1"d
备用(
干旱胁迫处理$参考汪仁等*!%+描述的水分梯度
法进行干旱胁迫处理!各处理分别在达到设定水分
标准的第
"
))
1
)
#!
和
#,
天取样进行指标测定(
原核表达载体
I
4E(!16
)大肠杆菌菌株
2M!#
"
F4%
#和
EJ@#"
均由本实验室保存(
;*<
!
方
!
法
;=<=;
!
石蒜总
>?3
提取及
1@?3
合成
!
利用高纯
度总
CGD
提取试剂盒的操作说明!进行各个组织
及
@4R
处理不同时间点
CGD
的提取&提取完毕
后!用
#*"Q
的琼脂糖凝胶电泳检测总
CGD
的纯度
与完整性(
>FGD
第一链合成参照
K;:5;0[6/
公司
反转录试剂盒的说明书进行(采用
A7?0[;>S
公司
的试剂盒
BYDCE;:
EY
CDA4>FGDD5
I
7.\.>6[.?0
N.[
进行序列的
CDA4
扩增(
;=<=<
!
1(2$30
基因克隆
!
根据
R;0260L
上已知
的
,$-.
基因序列!经序列多重比对分析!在
,$-.
各成员的保守区设计兼并引物用于扩增保守区序
列!经测序后!根据得到的序列分别设计
%e(CDA4
和
$e(CDA4
引物用于扩增
%e
末端和
$e
末端(扩增
产物经测序后!在
FGDYDG
上进行序列拼接!根
据拼接全长预测最大开放阅读框"
JCK
#!设计引物
进行
JCK
验证!本研究所用的引物信息见表
#
(
@AC
反应程序为$
&$d
预变性
%5.0
&
)d
变性
%"
/
!
,"d
退火
%"/
!
+!d
延伸
!5.0
!共
%$
个循环&
+!
d
延伸
#"5.0
(
"*1Q
琼脂糖凝胶电泳分离
@AC
产
物!采用普通
FGD
产物纯化试剂盒纯化目的条带!
通过
ED
克隆法连接到
I
YF#&(E
载体"
E6N6C6
试
剂公司#!转化大肠杆菌
EJ@#"
感受态细胞!涂布
,!&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
于含有氨苄青霉素"
$"5
9
%
M
#
M2
固体培养基上!
%+
d
过夜培养后!挑取单菌落!菌落
@AC
检测是否有
插入片段!将阳性克隆送上海美吉生物医药科技有
限公司测序(
;=<=A
!
1(2$30
基因的生物信息学分析
!
在
GA2T
数据库
2MDBE
"
S[[
I
$%%
H76/[*0>H.*075*0.S*
9
?]
%#
中进行序列比对!并利用
JCKK.0P;:
软件进行开
放阅读框"
JCK
#预测(采用
FGDYDG+*"
软件对
基因编码的氨基酸序列进行比对分析&用
@:?[(
@6:65
软件"
S[[
I
$%%
8;H*;^
I
6/
<
*?:
9
%
I
:?[
I
6:65
%#
在线分析该蛋白的分子量)等电点&用
EYOYY
"
S[[
I
$%%
888*>H/*P[=*PL
%
/;:].>;/
%
EYOYY(
!*"
#预测跨膜结构&用
B.
9
067@
"
S[[
I
$%%
888*>H/*
P[=*PL
%
/;:].>;/
%
B.
9
067@
#预测信号肽&用
BJ@YD
在线软件预测蛋白的二级结构(从
GA2T
数据库下
载不同植物
@$AB
蛋白序列!利用软件
Y4RD$*"
采用
G;.
9
SH?:(X?.0.0
9
"
GX
#模型!进行
#"""
次
2??[/[:6
I
统计学检验构建系统进化树(
;=<=B
!
实时荧光定量
C%>
分析
!
实时荧光定量
@AC
采用
E6N6C6
公司荧光定量试剂盒
B32C
@:;5.^ 4^ :)
;
EY
%
!在
4
II
;0P?:荧光定量
@AC
仪上进行(以石蒜
D>[.0
片段为内标!上述
>FGD
材料为模板!分别根据本实验室转录组测序结果中
比对到的
!&<$+1
基因*!)+和本研究中
!&,$-.
基
因的测序结果设计定量
@AC
特异引物"表
#
#(
!"
&
M
荧光定量
@AC
反应体系中!包含
#
&
M>FGD
模
板!
#"
&
M!fB32C@:;5.^ 4^ :)
;
%
!
#"
&
5?7
,
M
#的上下游引物各
"*1
&
M
!
+*)
&
MPPO
!
J
(反应
程序如下$
&$d
预变性
!5.0
&
$d
变性
#$/
!
,"d
退火
#$/
!
+!d
延伸
!"/
!共
)"
个循环(每个样品
设置
%
次重复(反应结束后!利用
!

""
A[法进行相
对表达量分析(
;=<=$
!
1(2$30
基因原核表达载体的构建
!
根据
原核表达载体
I
4E(!16
的多克隆位点!设计带有酶
切位点的原核表达引物"上游引物含有
=)>O

酶
切位点!下游引物含有
.)3

酶切位点!表
#
#(以石
蒜
>FGD
为模板扩增
!&,$-.
基因编码区"
AF/
#序
列片段(经琼脂糖凝胶电泳分离!回收目的条带后!
连接到
I
YF#&(E
载体上!转化到大肠杆菌
E?
I
#"
中!挑取经
@AC
验证含有目的基因条带的单菌落!
扩大培养提取质粒(
通过
=)>O

和
.)3

分别双酶切
I
YF#&E(
M:@$AB
和
I
4E(!16
质粒!连接后!转化到大肠杆菌
E?
I
#"
!挑取经
@AC
验证正确的单菌落测序(待测
序正确后将单菌落扩大培养提取目的质粒!转化
2M!#
"
F4%
#表达菌株并
@AC
验证(
;=<=D
!
1(2$30
基因的原核表达
!
分别挑取含有
I
4E(!16
和
I
4E(!16(M:@$AB
质粒的
2M!#
"
F4%
#
表达菌株!转接到
#"5MM2
液体培养基"含
$"
5
9
%
M
卡那霉素#中!于
%+d
恒温摇床上振荡培养过
夜(第
!
天!按
#a#"""
的比例将菌液转接到
#""
5M
新鲜配制的
M2
液体培养基
%+d
培养至
JF
,""
约
"*1
左右"取样!作为
"S
样品#!加入终浓度
#
55?7
%
MT@ER%+d
培养
#!S
!离心收获菌体"取
样!作为诱导后样品#(
,""":
%
5.0
离心
#"5.0
!弃
上清!菌体样品加入
$"
&
M!f
上样缓冲液和
$"
&
M
PPO
!
J
混匀!在
#""d
沸水中煮沸
$5.0
!冰上冷却
后!取
!"
&
M
进行
BFB(@DR4
"
$Q
浓缩胶!
#"Q
分
离胶#电泳检测(电泳后!经考马斯亮兰染色)拍照!
分析蛋白表达结果(
;*<*E
!
脯氨酸含量
!
脯氨酸含量采用酸性茚三酮
法测定*!$+(
;*A
!
数据处理
实验数据采用
B@BB#,*"
进行方差分析!采用
F=0>60
氏新复极差法进行处理间多重比较!并用
+
测验对处理与对照样品的相对定量结果进行统计
分析!
J:.
9
.0
统计制图(
!
!
结果与分析
<=;
!
1(2$30
基因全长
1@?3
克隆与序列分析
以石蒜叶片
>FGD
为模板!利用兼并引物!通
过
@AC
扩增获得
#
条
&++H
I
特异条带!经测序后!
获得了预期的保守序列(通过
%e(CDA4
扩增!获得
了
#!")H
I
%e
端序列&通过
$e(CDA4
扩增!获得了
+"&H
I
$e
端序列"图
#
)表
#
#(利用
FGDYDG,*"
将获得的
%
段序列进行拼接!并根据
JCKK.0P;:
查找和设计
JCK
引物!对拼接序列进行
@AC
扩增
和测序验证"图
#
#(结果显示$
!&,$-.
基因"
R;0(
260L
登录号
NE!)+1&&
#全长
>FGD
序列为
!$!#
H
I
!其中
$e
非编码区序列"
$e(WEC
#长
&%H
I
!
%e
非编
码区序列"
%e(WEC
#长
!1,H
I
!开放阅读框"
JCK
#为
!#%&H
I
(编码
+#%
个氨基酸残基(
@:?[
I
6:65
软
件预测结果显示$该基因编码蛋白分子式为
A
%)##
O
$$&)
G
&$1
J
#"%%
B
!"
!相对分子质量为
++*#&LF
!理论等
电点为
,*%)
!不稳定系数为
%!*&#
!为不稳定类蛋白(
保守结构域分析表明!该基因编码的蛋白含有
R$N
结构域"
R7=[656[;($(L.06/;P?56.0
#!具有激
酶活性位点)
DE@
结合位点!属于氨基酸激酶超基
+!&#
#"
期 徐
!
晟!等$石蒜
!&,$-.
基因的克隆与表达特性分析
表
;
!
2$30
基因克隆与表达分析引物信息
E6H7;#
!
@:.5;:/=/;P.0,$-.
9
;0;>7?0.0
9
60P;^
I
:;//.?06067
<
/./
用途
W/6
9
;
引物名称
@:.5;:065;
引物序列
@:.5;:/;
`
=;0>;
"
$e
#
%e
#
扩增片段大小
@:?P=>[/._;
%
H
I
保守片段扩增
D5
I
7.\.>6[.?0?\>?0/;:]6[.];:;
9
.?0
%e(CDA4
$e(CDA4
JCK
扩增
D5
I
7.\.>6[.?0?\JCK
荧光定量
@AC
U=60[.[6[.];:;67([.5;@AC
原核表达
@:?L6:
<
?[.>;^
I
:;//.?0
,$-.#?#
,$-.#@#
,$-.#%,
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,$-.#$,
,$-.#$A,
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ADERDREAARAEAERDAADDA
DERRDAAAADAEARDRADEE
EEEEDDDRRDDRDDEAEERERRRE
RRDDRADRAEDDAERDDDAARER
AADADEADAERDRADDRDADDRR
AEEAEEERDRADADEEAADR
ADARDDRERADDDAAAADRD
RRDEAADERRDAAAADAEARDRADE
REARDAEEEEDDDRRDDRDDEAEERER
&++
#!")
+"&
!#%&
#&$
##$
!#$#
!!
注$下划线分别表示
=)>O

和
.)3

限制性酶切位点
G?[;
$
40_
<
5;:;/[:.>[.?0/.[;/6:;=0P;:7.0;P
图
#
!
石蒜
!&,$-.
基因
@AC
扩增结果
Y*FM!"""
&
#*
保守区片段&
!*%e(CDA4
&
%*$e(CDA4
&
)*
开放阅读框序列
K.
9
*#
!
@AC
I
:?P=>[/?\!&,$-.\:?5!8&)*)+)
Y*FM!"""
&
#*@AC
I
:?P=>[?\>?0/;:]6[.];:;
9
.?0
&
!*%e(CDA4
&
%*$e(CDA4
&
)*@AC
I
:?P=>[?\JCK
因家族"
65.0?6>.PL.06/;//=
I
;:\65.7
<
!
DDN
#&此
外!该蛋白还包
#
个属于依赖于
GDF
"
@
#的醛脱氢
酶超基因家族"
67P;S
<
P;P;S
<
P:?
9
;06/;/=
I
;:\65.(
7
<
!
DMFO(BK
#的结构域(利用
BJ@YD
在线软件
进行二级结构预测结果显示$该氨基酸序列由
)"*
%&Q
(
(
螺旋)
!)*!,Q
无规则卷曲)
!)*!,Q
延伸链
和
##*"1Q
#
(
转角组成(另外!该蛋白无信号肽!无
跨膜结构域!属于疏水性蛋白(
<=<
!
1(2$30
基因编码的蛋白同源性及进化分析
根据石蒜
!&,$-.
推导氨基酸序列!与
GA2T
数据库中部分植物
@$AB
蛋白氨基酸序列进行比
对(结果"图
!
#显示!该基因编码氨基酸序列与其
他物种
@$AB
氨基酸序列具有较高的相似度!其中
与 海 枣 "
,/%012 *)$+
"
3
4
0&)
#
@P@$AB
"
V@
-
""1+++,,1
#)油棕"
53)0(
6
71001((
#
4
9
@$AB
"
V@
-
"#"&%##&"
#)毛果杨"
,%
B
737(+&$/%$)&
B
)
#
@[@$AB
"
V@
-
""!%#$!"!
#)菜 豆 "
,/)(0%37(C73
6
)&(
#
@]@$AB
"
D23,#"+&
#和牛角瓜 "
-)3%+&%
B
(
B
&%#
$0&)
#
A
I
@$AB
"
DOY!$&#%
#的 相 似 度 分 别 为
1$*1$Q
)
1,*1!Q
)
1#*!1Q
)
+1*$"Q
和
+&*1&Q
(
聚类结果"图
%
#显示!石蒜
!&,$-.
基因氨基酸序
列与海枣假定蛋白
@P@$AB
"
V@
-
""1+++,,1
#及油棕
假定蛋白
4
9
@$AB
"
V@
-
"#"&%##&"
#聚为一类!说明
它们的亲缘关系最近(
<=A
!
1(2$30
基因的组织分布及在渗透胁迫下的
基因表达分析
!!
采用实时荧光定量
@AC
技术!以
!&<$+1
基因
为内参!分析
!&,$-.
基因的组织特异性表达"图
)
#(结果显示!
&,$-.
在根)鳞茎和叶片中均有表
达!其中在鳞茎中的表达量最高!根中的表达量最
低(此外!对
!&,$-.
在
!"Q @4R
处理下的表达
模式进行分析!发现
!&,$-.
受
@4R
胁迫处理的诱
导表达!其基因相对表达量在处理后
,S
达到最高!
是对照的
$
倍多!达极显著水平&在处理
#!
)
)1S
!
1!&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
基因相对表达量水平逐渐下调至对照水平"图
$
#(
<*B
!
干旱胁迫处理下石蒜体内脯氨酸含量的变化
干旱胁迫下!石蒜体内脯氨酸含量也随干旱胁
迫时间的延续而逐渐增加!而在正常对照处理下!石
蒜体内脯氨酸含量变化不显著"表
!
#(例如!石蒜
体内脯氨酸含量在胁迫的第
1
天时!比对照显著增
加了
,,*%#Q
&在胁迫的第
#,
天时!石蒜体内脯氨
酸含量比对照显著增加了
#%)*)#Q
!达到最大值(
图
!
!
M:@$AB
推导的氨基酸序列与其他植物
@$AB
蛋白序列比对
M:@$AB*
石蒜"
NE!)+1&&
#&
@[@$AB*
毛果杨"
V@
-
""!%#$!"!
#&
R5@$AB*
大豆"
DDC1,,11
#&
E6@$AB*
小麦"
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#&
@]@$AB*
菜豆"
D23,#"+&
#&
A
I
@$AB*
牛角瓜"
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#&
g]@$AB*
葡萄"
V@
-
"#",$1%#1
#&
@P@$AB*
海枣"
V@
-
""1+++,,1
#&
4
9
@$AB*
油棕"
V@
-
"#"&%##&"
#&划线分别表示保守的
RN
和
RBD(FO
结构域)推测的
DE@
和
GDF
"
@
#
O
结合位点及
M;=
富集区
K.
9
*!
!
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I
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I
760[@$AB
I
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M:@$AB*!
"
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"
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737(+&$/%$)&
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"
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B
(
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"
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6
71001((
"
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-
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!
I
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GDF
"
@
#
OH.0P.0
9
/.[;/60PM;=(:.>S:;
9
.?0/
&!&#
#"
期 徐
!
晟!等$石蒜
!&,$-.
基因的克隆与表达特性分析
图
%
!
石蒜与其他物种
,$-.
基因氨基酸序列进化树分析
进化树分支节点上的数字表示
2??[/[:6
I
验证中基于
#"""
次重复该节点可信度的百分比&标尺代表遗传距离
K.
9
*%
!
@S
<
7?
9
;0;[.>[:;;?\65.0?6>.P/;
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I
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G=5H;:/6[[S;0?P;/:;
I
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I
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I
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&
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I
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I
S
<
7?
9
;0;[.>P./[60>;
图
)
!
!&,$-.
基因在石蒜不同组织中的表达
K.
9
*)
!
ES;;^
I
:;//.?0
I
6[[;:0/?\!&,$-.
9
;0;.0
P.\\;:;0[[.//=;/?\!8&)*)+)
<=$
!
1(2$30
基因原核表达载体构建与表达分析
使用
=)>O

和
.)3

双 酶 切
I
4E(!16(
M:@$AB
质 粒!可 切 出 目 的 片 段 "图
,
#!表 明
!&,$-.
基因已成功插入表达载体
I
4E(!16
中(随
后!对重组表达质粒测序!结果表明!目的基因与原
序列一致!且未出现碱基突变及移码现象(进一步!
挑取测序正确的单菌落扩大培养提取目的质粒!转
化
2M!#
"
F4%
#表达菌株并
@AC
验证"图
,
#!结果显
示扩增的目的片段与预期结果一致(
图
$
!
!"Q@4R
处理对
!&,$-.
基因表达的影响
"
表示每个时间点处理与对照之间在
"*"$
水平存在显著性差异
K.
9
*$
!
ES;;^
I
:;//.?07;];7?\!&,$-.
9
;0;
=0P;:!"Q@4R[:;6[5;0[
"
.0P.>6[;//.
9
0.\.>60[P.\\;:;0>;H;[8;;0[:;6[5;0[
60P>?0[:?7
"
S
#
6["*"$7;];7
将重组质粒
I
4E(!16(M:@$AB
和空载体质粒
I
4E(!16
转化的表达宿主菌在
%+d
培养至
JF
,""
约
"*1
左右!分别加入终浓度
#55?7
%
M
的
T@ER
继续培养!分别诱导表达
"
)
,
和
#!S
后!提取细菌
总蛋白进行
BFB(@DR4
分析(结果"图
+
#表明!与
对照相比!
I
4E(!16(M:@$AB
转化菌经
T@ER
诱导
"%&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
表
<
!
干旱胁迫处理下石蒜体内脯氨酸含量的变化
E6H7;!
!
AS60
9
;/?I
:?7.0;>?0[;0[.0!8&)*)+)
=0P;:P:?=
9
S[/[:;//
处理时间
E:;6[5;0[[.5;
%
P
对照
A?0[:?7
干旱胁迫
F:?=
9
S[/[:;//
" #&*+%c#*+"; #&*+%c#*+";
) #&*")c#*1); !)*+,c!*#!P
1 #&*,$c#*$,; %!*,1c!*"!>
#! !"*%%c#*1)P; )!*%,c!*#!H
#, !#*",c#*1%P; )&*!$c!*$$6
!!
注$不同小写字母表示不同处理数据间在
"*"$
水平经
F=0>60
氏新复极差法检验差异显著
G?[;
$
F.\\;:;0[7?8;:>6/;7;[[;:/.0P.>6[;/.
9
0.\.>60[P.\\;:;0>;
65?0
9
[S;[:;6[5;0[/6["*"$7;];7H
<
F=0>60
.
/0;85=7[.
I
7;:60
9
;
[;/[
图
,
!
重组质粒
I
4E(!16(M:@$AB
的酶切鉴定和菌落
@AC
Y
#
*FM!"""
&
Y
!
*FGD
%
O.0P
+
56:L;:
&
#*
I
4E(!16(M:@$AB
重组质粒酶切产物&
!*
含有
I
4E(!16(M:@$AB
质粒的
2M!#
菌落
@AC
&箭头所指为目标片段
K.
9
*,
!
C;/[:.>[.?0P.
9
;/[.?0?\:;>?5H.060[
I
76/5.P
I
4E(!16(M:@$AB60P.[/>?7?0
<
@AC
Y
#
*FM!"""
&
Y
!
*FGD
%
O.0P
+
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&
#*F.
9
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I
4E(!16(M:@$AB*!*@AC
I
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?\2M!#8.[S
I
4E(!16(M:@$AB
&
D::?8//S?8[S;[6:
9
;[\:6
9
5;0[/
后!在相对分子质量
1!*$1LF
"含部分载体蛋白#左
右有
#
条明显的蛋白条带!表明重组质粒
I
4E(!16(
M:@$AB
在大肠杆菌
2M!#
"
F4%
#中成功诱导表达了
M:@$AB
蛋白(
%
!
讨
!
论
脯氨酸是植物体应对干旱和高盐等非生物胁迫
积累的最为重要的渗透调节物质之一!植物体内脯
氨酸的含量在一定程度上反映了植物的抗逆
性*!,(!++(已有研究表明!植物体脯氨酸的合成根据
起始氨基酸的不同分为谷氨酸途径和鸟氨酸途径!
其中谷氨酸途径在渗透胁迫和氮素缺乏的情况下发
挥了重要作用*!1+(而
@$AB
则是植物体内催化谷
氨酸途径合成脯氨酸过程中的限速酶!在脯氨酸的
合成过程中起着至关重要的作用*%!&+(本研究采用
同源克隆)
CDA4
方法结合
CE(@AC
技术从石蒜中
图
+
!
!&,$-.
诱导表达的
BFB(@DR4
分析
Y*
蛋白分子量标准&
#
)
%*%+d
)
T@ER
终浓度为
#55?7
%
M
下
I
4E(!16
空载体转化子分别诱导
"
)
,
和
#!S
的总蛋白&
)
)
,*
相同条件下融合表达菌分别诱导
"
)
,
和
#!S
的总蛋白&
箭头所指为目标蛋白
K.
9
*+
!
BFB(@DR46067
<
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I
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?\M:@$AB
I
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Y*@:?[;.056:L;:
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I
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[:60/\?:5;PH6>[;:.68.[S#55?7
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&
)(,*ES;;^
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I
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%
M
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!
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&
D::?8/S?8/[S;[6:
9
;[
I
:?[;.0
克隆得到了
,$-.
基因!并命名为
!&,$-.
(氨基
酸序列比对显示!该基因推导的氨基酸序列与已知
的其他植物
,$-.
基因的氨基酸序列一致性均在
+"Q
以上!说明该基因在物种进化上具有高度的保
守性(多序列比对还发现!
M:@$AB
氨基酸序列与
其他物种
@$AB
序列具有相似的保守域(
!&,$-.
基因分别属于氨基酸激酶"
DDN
#和醛脱氢酶"
DM(
FO(BK
#超基因家族中的一个成员(
M:@$AB
蛋白
质的保守结构域!包括
DE@
和
GDF@O
结合位点!
!
个亮氨酸结构域!谷氨酰激酶"
RN
#结构域和谷氨
酸半醛"
RBD
#结构域!不具有跨膜结构及信号肽!
进一步说明该基因在物种进化过程的保守性很高(
此外!系统进化树分析结果说明!
M:@$AB
与海枣和
油棕的
@$AB
聚为一类!亲缘关系最近(
实时荧光定量
@AC
结果表明!
!&,$-.
在根)
鳞茎和叶中具有表达!其中在鳞茎中的表达量最高!
这可能与石蒜具有肉质鳞茎的特征有关&石蒜作为
较为耐旱的一种石蒜属植物!鳞茎是其具有抗旱性
的重要器官(此外!
&,$-.
基因受
@4R
渗透胁迫
诱导表达!而干旱处理下!石蒜体内脯氨酸含量则显
著上升&上述结果进一步暗示石蒜体内可能存在着
渗透胁迫后脯氨酸积累的适应机制!同时
!&,$-.
基因与石蒜的抗旱性可能具有一定的相关性(另一
方面!通过多物种
,$-.
基因序列比对分析表明!植
物基因在进化过程中发生过基因拷贝复制现象!即
#%&#
#"
期 徐
!
晟!等$石蒜
!&,$-.
基因的克隆与表达特性分析
,$-.
基因在植物体内存在双拷贝*%"+(例如$拟南
芥中有
<+,$-.#
和
<+,$-.!
两个
,$-.
同源基
因(在渗透胁迫下!
<+,$-.#
基因在各种器官和不
同的组织中都表达!并在脱水)高盐和
D2D
处理下
诱导表达*%#(%!+(
<+,$-.!
基因在培养的分裂细胞
表达!并且逆境下该基因的诱导依赖于蛋白质的合
成*%%+(由此可见!同一植物
,$-.
基因可以对不同
的逆境胁迫作出反应!而不同的
,$-.
基因也可以
受同一种胁迫诱导表达(而石蒜体内是否存在
,$-.
同源基因!还需进一步研究(
此外!本研究通过构建
!&,$-.
基因原核重组
表达载体!转化大肠杆菌
2M!#
"
F4%
#!成功实现了
该基因的原核表达(这为通过组氨酸"
O./
#标签纯
化)获得高纯度的融合蛋白!深入研究
M:@$AB
的反
应动力学催化特性奠定了基础(另外!近年来!通过
生物技术提高植物自身体内脯氨酸的含量!从而获
得对于逆境胁迫抗性较强的转基因植株取得了一定
应用(
!&,$-.
基因的克隆及相关研究也为进一步
研究分析石蒜耐旱分子机制和抗逆分子育种提供了
有利的理论基础(
参考文献!
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