全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４３(６): ５８１￣５８９(２０１３)
收稿日期: ２０１２￣０７￣０６ꎻ 修回日期: ２０１３￣０９￣２９
基金项目: 国家自然科学基金(３１０７１３８１ꎬ３０９０００５０)ꎬ高等学校博士学科点专项科研基金(２００９３７０２１２００１３)ꎬ山东省优秀中青年科学家科
研奖励基金(ＢＳ２０１０ＮＹ０１７)
通讯作者: 丁新华ꎬ博士ꎬ教授ꎬ研究方向为微生物与植物互作ꎻＥｍａｉｌ:ｘｈｄｉｎｇ＠ｓｄａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
储昭辉ꎬ博士后ꎬ教授ꎬ研究方向为微生物与植物互作ꎻＥｍａｉｌ:ｚｃｈｕ＠ｓｄａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
共同第一作者: 冯雯杰ꎬ女ꎬ山东泰安人ꎬ博士研究生ꎬ研究方向为分子植物病理学ꎻＥｍａｉｌ: ｗｅｎｊｉｅｆｅｎｇ２０１０＠ｇｍａｉｌ.ｃｏｍ
常清乐ꎬ男ꎬ山东济南人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为分子植物病理学ꎬＥｍａｉｌ: ｊｐｗａｎ１２３＠１２６.ｃｏｍꎮ
水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的
分子标记筛选及检测
冯雯杰＃ꎬ 常清乐＃ꎬ 杨 龙ꎬ 丁新华∗ꎬ 储昭辉∗
(作物生物学国家重点实验室 /山东省农业微生物重点实验室ꎬ山东农业大学植物保护学院ꎬ泰安 ２７１０１８)
摘要:水稻白叶枯病菌(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ)和细菌性条斑病菌(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａ)是水稻种子产地
检疫中最重要的两种检疫对象ꎬ且同属于水稻黄单胞杆菌ꎮ 本研究基于生物信息学技术构建比较基因组学算法对两种病原
的全基因组序列比对分析ꎬ得到一系列能够区分两种病原的特异性 ＰＣＲ引物ꎮ 结合简单的 ＰＣＲ技术及全自动 ＤＮＡ分析系
统ꎬ我们选取了 １２对引物分别对 ２３株水稻白叶枯病菌和 ５株水稻细菌性条斑病菌及其它相关菌株进行验证ꎮ 结果获得了 ２
对显性标记(Ｘｏｏ￣Ｈｐａ１和 Ｘｏｃ￣ＯＲＦ２)以及 ３对共显性分子标记(Ｍ５６８、Ｍ８９７和Ｍ１５７５)可以达到理想的区分检测两种病原的
效果ꎮ 分子标记的检测灵敏度从 ５×１０４到 ５ × １０７ ｃｆｕ􀅰ｍＬ￣１不等ꎬ且从水稻种子浸提液中也能成功地检测水稻白叶枯病菌和
细菌性条斑病菌ꎮ 本研究丰富了检测标记的靶位点ꎬ并有效的结合了高通量检测的手段对多位点联合分析ꎬ增强了检测的可
靠性ꎬ有望在今后的植物检疫及病原鉴定中发挥着重要的作用ꎮ
关键词:水稻白叶枯病菌ꎻ 水稻细菌性条斑病菌ꎻ 分子标记ꎻ 植物检疫
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ ｆｒｏｍ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａ 　 ＦＥＮＧ Ｗｅｎ￣ｊｉｅ１ꎬ ＣＨＡＮＧ
Ｑｉｎｇ￣ｌｅ１ꎬＹＡＮＧ Ｌｏｎｇꎬ ＤＩＮＧ Ｘｉｎ￣ｈｕａꎬ ＣＨＵ Ｚｈａｏ￣ｈｕｉ (Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｂｉｏｌｏｇｙ / Ｓｈａｎｄｏｎｇ
Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ ＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬＳｈａｎｄｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｔａｉａｎ ２７１０１８ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ (Ｘｏｏ) ａｎｄ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａ (Ｘｏｃ) ｔｈａｔ ｃａｕｓｅ ｒｉｃｅ
ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｌｉｇｈｔ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｅａｆ ｓｔｒｅａｋ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｒｅ ｔｈｅ ｔｗｏ ｍｏｓｔ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｒｉｃｅ ｓｅｅｄ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅꎬ
ａｎｄ ｂｅｌｏｎｇ ｔｏ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｇｅｎｕｓ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ａ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ ｆｒｏｍ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅｉｒ
ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ. Ｔｗｅｌｖｅ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｏｒ ＰＣＲ ｔｅｓｔ ｉｎ ｔｏｔａｌ ３３ ｓｔｒａｉｎｓꎬ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ２３
Ｘｏｏꎬ ５ Ｘｏｃ ａｎｄ ５ ｏｔｈｅｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔｒａｉｎｓ. Ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｏｒｅ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｄｅｔｅｃ￣
ｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍꎬ ｅｉｔｈｅｒ ｔｈｅ ＱＩＡｘｃｅｌ ｓｙｓｔｅｍ ｏｒ ｔｈｅ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ ｓｙｓｔｅｍ. Ａｓ ａ ｒｅｓｕｌｔꎬ ｆｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｅｒｅ ｉ￣
ｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｔｏ ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｘｏｏ ａｎｄ Ｘｏｃꎬ ｗｈｉｃｈ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ｔｗｏ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｍａｒｋｅｒｓ (Ｘｏｏ￣Ｈｐａ１
ａｎｄ Ｘｏｃ￣ＯＲＦ２) ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ｃｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｍａｒｋｅｒｓ (Ｍ５６８ꎬ Ｍ８９７ ａｎｄ Ｍ１５７５) . Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｒａｎｇｅｄ
ｆｒｏｍ ５×１０４ ｔｏ ５ × １０７ ｃｆｕ􀅰ｍＬ ￣１. Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎꎬ ｂｏｔｈ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｒｉｃｅ ｓｅｅｄ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｗｉｔｈ
ａｌｌ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ. Ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｆｉｖｅ ｎｅｗ ｍａｒｋｅｒｓꎬ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｉｓ ａｌｓｏ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ ｐｒｏｓｐｅｃｔｅｄ ｔｏ
ｐｌａｙ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｔｏ ｓｅｒｖｅ ｉｎ ｒｉｃｅ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ｂｅｃａｕｓｅ ｔｈｅ ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｈａｓ ｂｅｅｎ
　
植物病理学报 ４３卷
ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｃｏｎｊｏｉｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＤＮＡ ｑｕａｌｉｔｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅꎻ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａꎻ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓꎻ ｐｌａｎｔ
ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ
中图分类号: Ｓ４３５.１１１　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１３)０６￣０５８１￣０９
　 　 水稻白叶枯病(ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｌｉｇｈｔꎬＢＢ)和水稻细菌
性条斑病(ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｅａｆ ｓｔｒｅａｋꎬＢＬＳꎬ简称水稻条斑
病)是水稻上最重要的两种细菌性病害ꎮ 其中ꎬ白叶
枯病与稻瘟病、水稻纹枯病并称水稻三大病害ꎬ而水
稻条斑病也成为继三大病害之后的又一重要的水稻
病害ꎮ 在我国乃至东南亚的某些地区甚至成为主要
病害ꎬ危害巨大ꎮ 因此ꎬ遏制水稻细菌病害的发展对
于稳定粮食生产和改善人们生活水平至关重要ꎮ
　 　 在水稻种子产地检疫中ꎬ水稻白叶枯病和条斑
病是最重要的两种细菌性检疫病害[１~３ ]ꎬ其种子带
菌传播严重ꎬ因此ꎬ采取必要的检疫措施对于病害
的防治有着非常重要的意义ꎮ 但是ꎬ同属水稻黄单
胞菌的白叶枯病菌 ( Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ.
ｏｒｙｚａｅꎬ Ｘｏｏ)和条斑病菌(Ｘ. ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａꎬ
Ｘｏｃ)亲缘关系非常近ꎬ且基因组序列相似性高达
９０％以上[ ４ ]ꎬ在检疫工作中不易被鉴定区分[ ５ ]ꎮ
前人采用噬菌体、血清学等检测技术区分两种病
害ꎬ但易出现假阳性或假阴性的结果[ ６ ꎬ ７ ]ꎮ 基于
ＰＣＲ技术以及 ＴａｑＭａｎ探针实时荧光 ＰＣＲ 方法也
有报道[ ８ ]ꎬ但可用的分子标记单一有限ꎮ 此外ꎬ两
种病原的致病变种呈现很大程度的多样性[ ９~１１ ]ꎬ
因此ꎬ在现有的检疫体制中ꎬ筛选丰富的特异性分
子标记ꎬ以先进的 ＰＣＲ检测平台为依托ꎬ能够为两
种细菌病害的鉴定提供更简便、准确、可靠的技术
支持ꎮ
　 　 本研究基于已公布的 ３ 个白叶枯病菌株
ＭＡＦＦ３１１０１８、ＫＡＣＣ１０３１１、ＰＸＯ９９Ａ[１２~１４]与 ２ 个
条斑病菌株 ＢＬＳ２５６[１５]的基因组序列和 ＲＳ１０５ 的
部分基因序列ꎬ利用生物信息学的方法对 Ｘｏｏ 菌
株全基因组内以及与 Ｘｏｃ全基因组间比对分析ꎬ选
定白叶枯病菌 ＭＡＦＦ３１１０１８ 和条斑病菌 ＢＬＳ２５６
为分析对象ꎬ根据两菌株基因组的差异序列ꎬ设计
特异性引物ꎬ通过常规 ＰＣＲ 技术ꎬ结合高通量、自
动化电泳分析平台—ＱＩＡｘｃｅｌ 全自动 ＤＮＡ / ＲＮＡ
分析系统和 ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ 自动化 ＤＮＡ / ＲＮＡ 分析
仪对包含水稻白叶枯病菌和条斑病菌及其它相关
菌株在内的 ３３个候选菌株进行检测区分ꎮ 以筛选
到的分子标记为对象ꎬ检测了其灵敏度并对水稻种
子浸提液进行了成功检测ꎮ 这种高通量的检测方
法将为水稻种子检疫及病原鉴定提供技术支撑ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 材料
１.１.１　 供试菌株 　 供试水稻细菌性条斑病菌株
ＲＨ３和所有白叶枯病菌株均由华中农业大学袁猛
博士提供ꎬ细菌性条斑病菌株 ＲＳ１０５、ＲＳ８５、ＨＮＢ８￣
４７和 ＪＳＢ２￣２４ 由上海交通大学陈功友教授提供ꎬ
柑橘溃疡病菌株由华中农业大学刘继红教授提供ꎬ
其他参试对照菌株由本实验室保存ꎬ详见表 １ꎮ
Ｔａｂｌｅ １　 Ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａꎬ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ
ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ
Ｉｓｏｌａｔｅ Ｉｓｏｌａｔｅ ｃｏｄｅ
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａ　 (Ｘｏｃ) ＲＨ３ꎬ ＲＳ１０５ꎬ ＲＳ８５ꎬ ＨＮＢ８￣４７ꎬ ＪＳＢ２￣２４
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ　 (Ｘｏｏ)
ＰＸＯ９９ꎬ ＰＸＯ８６ꎬ ＰＸ０６１ꎬ ＰＸＯ７１ꎬ ＰＸＯ３３９ａꎬ ＰＸＯ３３９ｂꎬ ＰＸＯ３３９ｃꎬ
ＳＣ￣ｙｃ￣ａꎬ Ｆｕｊｉａｎꎬ ＧＤ４１４ꎬ ＨｅＮ１１ꎬ ＹＮ２４ꎬ ＹＮ１８ꎬ ＹＮ１１ꎬ
ＹＮ１ꎬ Ｔ３ꎬ Ｔ２ꎬ Ｔ１ꎬ ＪＬ６９１ꎬ ＰＸＯ３４９ꎬ ＰＸＯ３６４ꎬ ＰＸＯ３４７ꎬ Ｚｈｅ１７３
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ. ｃｉｔｒｉ　 (Ｘａｃ) ＹＣ(Ｙｉｃｈａｎｇ ｉｓｏｌａｔｅꎬ Ｈｕｂｅｉ)
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｖｅｓｉｃａｔｉｏｒｉａ　 (Ｘｃｖ) ＳＤ(Ｓｈａｎｄｏｎｇ ｉｓｏｌａｔｅ)
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ. ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　 (Ｘｃｃ) Ｘ８￣１
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｔｏｍａｔｏ　 (Ｐｓｔ) ＤＣ３０００
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ　 (Ｒｓ) ＹＮ
２８５
　
　 ６期 冯雯杰ꎬ 等:水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的分子标记筛选及检测
１.１.２　 水稻种子 水稻品种中花 １１ 种子由本实验
室保存ꎮ
１.１.３　 仪器与试剂　 ＱＩＡｘｃｅｌ全自动 ＤＮＡ/ ＲＮＡ分
析系统(Ｑｉａｇｅｎ 公司ꎬ德国)ꎬＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ 自动化
ＤＮＡ/ ＲＮＡ分析仪(Ｃａｌｉｐｅｒ 公司ꎬ美国)ꎬＡＢＩ９７００ 型
ＰＣＲ仪(Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓꎬ ＵＳＡ)均来自山东省农业
微生物重点实验室ꎮ
　 　 Ｔａｑ酶试剂购自宝生物工程(大连)有限公司ꎬ
ＱＩＡｘｃｅｌ ＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｋｉｔ 购自 ＱＩＡｇｅｎ 公
司ꎬ引物由上海生工生物工程股份有限公司合成ꎮ
１.２　 引物设计
　 　 根据 ＮＣＢＩ (ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ) 上已公
布的 ３ 个水稻白叶枯病菌株 ＭＡＦＦ３１１０１８、
ＫＡＣＣ１０３１１、ＰＸＯ９９Ａ 的全基因组序列与 ２ 个水
稻细菌性条斑病菌 ＢＬＳ２５６ 和 ＲＳ１０５ 的基因组序
列ꎬ通过序列比对ꎬ 分析两种病原菌间的差异序
列ꎬ设计特异性引物ꎮ 共显性引物设计方法如下:
先对 ＭＡＦＦ３１１０１８、ＫＡＣＣ１０３１１、ＰＸＯ９９Ａ 等 ３ 个
菌株的全基因组序列进行 ｂｌａｓｔｎꎬ序列一致性较
强ꎬ选取 ＭＡＦＦ３１１０１８ 作为水稻白叶枯菌的模式
种ꎬ用其全基因组序列与条斑病菌 ＢＬＳ２５６ 的基因
组序列比对分析ꎮ 编写 Ｐｅｒｌ程序ꎬ在 ＭＡＦＦ３１１０１８
与 ＢＬＳ２５６ 两者的 Ｂｌａｓｔ 结果中ꎬ寻找相似度大于
８０％ꎬ相似区段大于 ２００ ｂｐ 的片段ꎮ 挖取该段序
列ꎬ用 ｅｐｒｉｍｅｒ３ 在区段上设计引物ꎬ但保证该区段
包含差异序列ꎮ 利用电子 ＰＣＲ 技术( ｅＰＣＲ)在 ５
个基因组中分别模拟 ＰＣＲ扩增ꎬ利用 Ｐｅｒｌ程序ꎬ在
ｅＰＣＲ的结果中筛选其扩增产物长度不一致的引
物ꎬ即为候选的在两种病菌中有多态性的共显性分
子标记ꎮ
　 　 为了验证共显性引物的可靠性以及检测手段的
多样性ꎬ根据已公布的水稻白叶枯病菌和细菌性条
斑病菌基因组序列ꎬ通过序列比对ꎬ分析两病原的保
守序列之间的差异序列ꎬ设计特异的显性引物ꎮ
１.３　 ＰＣＲ模板的制备
　 　 将供试菌株划线于 ＴＳＡ 固体培养基平板上ꎬ
２８℃培养 ２ ｄ 后ꎬ挑取单菌落ꎬ置于 ＴＳＡ 液体培养
基ꎬ在转速 １８０ ｒ􀅰ｍｉｎ￣１摇床 ２８℃培养 ２ ｄꎮ 吸取菌
液 １ ｍＬꎬ８ ０００ｇ 离心 ２ ｍｉｎꎬ弃去上清液ꎮ 菌体用
１０ ｍＬ的灭菌双蒸水悬浮作为 ＰＣＲ反应的模板ꎮ
１.４　 ＰＣＲ检测体系的建立
　 　 反应体系为:Ｔａｑ 酶 ０.２ μＬ(５ｕ􀅰μＬ￣１)ꎬ１０×
ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ(Ｍｇ２＋ ｆｒｅｅ)２ μＬꎬ２５ ｍＭ ＭｇＣｌ２１.２ μＬꎬ
２.５ ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ １.５ μＬꎬ取菌液为模板 １ μＬꎬ
引物 Ｆ(１０ μＭ) ０.６ μＬꎬ引物 Ｒ(１０ μＭ) ０.６ μＬꎬ用
灭菌双蒸水补充至 ２０ μＬ 体系ꎮ 反应程序为 ９４℃
预变性 ３ ｍｉｎꎻ９４℃变性 １５ ｓꎬ５８℃退火 １５ ｓꎬ７２℃
延伸 ３０ ｓꎬ３０ 个反应循环ꎻ最后 ７２℃延伸 ７ ｍｉｎꎮ
反应产物的检测主要应用毛细管电泳的原理ꎬ采用
高灵敏度的 ＱＩＡｘｃｅｌ全自动 ＤＮＡ / ＲＮＡ分析系统ꎬ
以及 ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ 自动化 ＤＮＡ / ＲＮＡ 分析仪进行
检测ꎬ检测的上样量为 ０.１ μＬ ＰＣＲ产物ꎬ具体操作
程序参照仪器说明书ꎮ
１.５　 携菌水稻种子样品的检测
　 　 分别用水稻细菌性条斑病菌 ＲＳ１０５ 菌液、水
稻白叶枯病菌 ＰＸＯ９９菌液、两种病菌的混合液(均
为 ＯＤ６００＝ ０.５)和无菌水浸泡健康的中花 １１ 水
稻种子各 ２粒ꎬ待晾干后再用 １００ μＬ无菌水 ４℃浸
泡 ２ ｈꎮ 分别取浸提液作为 ＰＣＲ 反应的模板ꎮ 通
过建立的 ＰＣＲ 反应体系ꎬ利用高分辨率的 ＱＩＡｘｃｅｌ
全自动 ＤＮＡ/ ＲＮＡ分析系统进行病原检测ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 显性引物的验证
　 　 通过比对水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌
基因组序列ꎬ分析两病原的保守序列之间的差异序
列ꎮ 我们分别设计了专化 Ｘｏｃ 的显性引物 Ｘｏｃ￣
ＯＲＦ２和专化 Ｘｏｏ的显性引物 Ｘｏｏ￣Ｈｐａ１ (表 ２)ꎮ
　 　 Ｘｏｃ￣ＯＲＦ２ 是根据水稻条斑病菌编码特有效
应蛋白的基因 ａｖｒＲｘｏ１上第 ２个开放阅读框 ＯＲＦ２
设计ꎬ其效应蛋白可能与病原菌的毒性密切相
关[ １６ꎬ１７ ]ꎮ 经 ＱＩＡｘｃｅｌ系统分析 Ｘｏｃ￣ＯＲＦ２ 的 ＰＣＲ
产物ꎬ在供试的 ３３株菌株中ꎬ仅 Ｘｏｃ菌株(５株)能
扩增出 １２３ ｂｐ左右的 ＤＮＡ 条带(图 １Ａ)ꎬ与预期
的 １２５ ｂｐ 大小相近ꎬ具有体现细菌性条斑病菌特
异性的特点ꎬ可用于水稻细菌性条斑病菌的分离鉴
定ꎬ并帮助分析以下共线性引物的效果ꎮ Ｘｏｏ￣Ｈｐａ１
是根据基因组比对筛选ꎬ选取了水稻白叶枯病菌编
码与激发植物免疫反应有关的 ＴＴＳＳ 分泌蛋白的
保守基因 ｈｐａ１设计[ １８ ]ꎬＰＣＲ扩增产物经 ＬａｂＣｈｉｐ
ＧＸ自动分析仪检测ꎬ在供试菌株中仅从２３株水稻
３８５
　
植物病理学报 ４３卷
Ｆｉｇ. １　 Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａ ａｎｄ
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｍａｒｋｅｒｓ
Ａ:Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｘｏｃ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｍａｒｋｅｒ Ｘｏｃ￣ＯＲＦ２ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＱＩＡｘｃｅｌ ｓｙｓｔｅｍꎻ Ｂ: Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｘｏｏ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｍａｒｋｅｒ Ｘｏｏ￣Ｈｐａ１ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ ｓｙｓｔｅｍ. Ｌａｎｅ １￣５: Ｘｏｃ ｓｔｒａｉｎｓ ＲＨ３ꎬ ＲＳ１０５ꎬ ＲＳ８５ꎬ
ＨＮＢ８￣４７ꎬ ＪＳＢ２￣２４ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ Ｌａｎｅ ６￣２８: Ｘｏｏ ｓｔｒａｉｎｓ ＰＸＯ９９ꎬ ＰＸＯ８６ꎬ ＰＸ０６１ꎬ ＰＸＯ７１ꎬ ＰＸＯ３３９ａꎬ ＰＸＯ３３９ｂꎬ ＰＸＯ３３９ｃꎬ
ＳＣ￣ｙｃ￣ａꎬ Ｆｕｊｉａｎꎬ ＧＤ４１４ꎬ ＨｅＮ１１ꎬ ＹＮ２４ꎬ ＹＮ１８ꎬ ＹＮ１１ꎬ ＹＮ１ꎬ Ｔ３ꎬ Ｔ２ꎬ Ｔ１ꎬ ＪＬ６９１ꎬ ＰＸＯ３４９ꎬ ＰＸＯ３６４ꎬ ＰＸＯ３４７ꎬ
Ｚｈｅ１７３ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻＬａｎｅ ２９￣３３: Ｏｔｈｅｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ ＹＣꎬ ＳＤꎬ Ｘ８￣１ꎬ ＤＣ３０００ꎬＹＮꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ
ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａ ａｎｄ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ
Ｎａｍｅ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ(５’→３’) Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ(５’→３’) Ｐｒｏｄｕｃｔ ｌｅｎｇｔｈ / ｂｐ
Ｘｏｃ￣ＯＲＦ２ ｔａａｇｇａａｃｇｃａａｔａａａｇｃｃ ｃａｔｃｇｃｔｇｇｔａｔｃｇｃａａａ １２５(Ｘｏｃ)
Ｘｏｏ￣Ｈｐａ１ ｃｃａｇｇａｃａｃａａｃｇｔｔｃｇ ｃｇａｇｇｔｃｇｃｃａｃｔａａａｇ ３１７(Ｘｏｏ)
ＳＳＲ１ ａｇｔｇｇｔｇｇｔｃｔｇｃａｔａｇｇｇ ｃｇｔｃｇａｃｔａｃｔｇｇｇｃｔｇａｔｔ ２１３(Ｘｏｏ) 　 ３０４(Ｘｏｃ)
ＳＳＲ２ ａａｇｔｇｇｔｇｇｔｃｔｇｃａｔａｇｇｇ ｔａｃａａｃａｃｇｃａｃｇａｃｇａｇａｔ ２６５(Ｘｏｏ) 　 ３５６(Ｘｏｃ)
Ｍ５６８ ａｔｇｃｔｇａｇｃａｃａｔｃｃａｃａｔｃ ｇａｔｇａｃｇｃｔｃａａｔｃａｃａａｃｇ ２０９(Ｘｏｏ) 　 ２１５(Ｘｏｃ)
Ｍ７４３ ｃａｇｃｃｔｃａａｇｃａｇｃａｇａａｇｔ ｃｇｇｃｔｇｇｇｇｔｔｔｃｔｔｔａｇｔｔ １８２(Ｘｏｏ) 　 １６１(Ｘｏｃ)
Ｍ７６３ ｇｇａｃｇａｔａｃｇｃａｇｔａｃｇａｃａ ｔｇｔｔｇｃｔｇａｔｃｔｇｃｔｔｃｃａｃ ２００(Ｘｏｏ) 　 １８５(Ｘｏｃ)
Ｍ８９７ ｔｃａａｃｇｃｃｔａｔｃｔｃａａｃａｃｇ ｔｃａｇｇｇｔｇａｔａｇｇｃｇａａｃｔｃ ２０８(Ｘｏｏ) 　 ２２９(Ｘｏｃ)
Ｍ１２３８ ｃｔｃｇｃｔｃａａｇｇｔｇａｔｃｇｔｃ ｃｃａｇａｔｃｇｔｃｃｔｇｃａｇｔｔｔｔ ２００(Ｘｏｏ) 　 ２０６(Ｘｏｃ)
Ｍ１３８２ ａｇａｇａｔｃｇｇｇａｔａｇｇｃｇａｔｔ ｇａｔｇｔｇｔｔｃｇｔｇｃｔｔｇａｔｇｃ １９９(Ｘｏｏ) 　 １９３(Ｘｏｃ)
Ｍ１４７０ ａｔｃｔｔｇｃｃｔｔｃｇａｔｇｃｔｇａｔ ａａａｇａｃｇｔｔｇｔｔｃｃｇｇｔｃａｃ ２００(Ｘｏｏ) 　 １９４(Ｘｏｃ)
Ｍ１５７５ ｔｃｇｔａｃｃｇａｔｇｃａａｇｔｃｇｔａ ｇａｃａｔｇａａｇｔｇｇｔｇｃｔｇｇｔｇ １９９(Ｘｏｏ) 　 １９３(Ｘｏｃ)
　
４８５
　
　 ６期 冯雯杰ꎬ 等:水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的分子标记筛选及检测
白叶枯病菌中扩增到与目标大小(约 ３１７ ｂｐ)相符
合的 ＤＮＡ片段(图 １Ｂ)ꎮ Ｘｏｃ￣ＯＲＦ２ 和 Ｘｏｏ￣Ｈｐａ１
仅能从各自专属的菌株中扩增出条带ꎬ在其它参照
菌株中不能检测到目的 ＤＮＡꎬ可以用于区分鉴定
水稻细菌性条斑病和白叶枯病病原ꎮ 同时通过结
果分析ꎬＱＩＡｘｃｅｌ 与 ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ 两种检测系统均
可用于精细的 ＤＮＡ 片段化分析ꎬ适合帮助区分鉴
定病原菌ꎮ
２.２　 共显性引物的筛选与验证
　 　 基于设定的分析程序ꎬ筛选到基于白叶枯病菌
保守序列的引物 １ ６００ 对ꎬ通过 ｅＰＣＲ 找到在水稻
白叶枯病菌和细菌性条斑病菌之间有差异ꎬ且扩增
长度在 ２００ ｂｐ 左右的引物 ５５ 对ꎬ选取 １０ 对特异
性引物进行检测验证ꎬ引物序列及预测获得的片段
大小见表 ２ꎮ
　 　 利用筛选到的引物ꎬ结合已经建立起来的
ＰＣＲ检测体系ꎬ对供试的水稻细菌性条斑病菌、水
稻白叶枯病菌及其它供试菌株进行检测ꎮ 通过对
１０对特异性电子引物检测验证ꎬ得到 ３ 对共显性
引物 Ｍ５６８、Ｍ８９７和 Ｍ１５７５ꎬ可作为同时检测两病
菌的共显性分子标记ꎬ均能扩增出与预期大小相符
合的 ＤＮＡ 差异条带(图 ２)ꎮ 经 ＱＩＡｘｃｅｌ 系统分
析ꎬＭ１５７５能扩增出特异性的 １９５ ｂｐ 左右的条斑
病菌的 ＤＮＡ片段和 ２００ ｂｐ 左右的白叶枯病菌的
ＤＮＡ片段(图 ２Ａ)ꎻ此外ꎬ经 ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ 自动分
析仪检测ꎬＭ８９７能扩增出 ２４１ ｂｐ左右条斑病菌的
ＤＮＡ片段和 ２１９ ｂｐ 左右的白叶枯病菌 ＤＮＡ片段
(图 ２Ｂ)ꎻ分子标记 Ｍ５６８ 则在两种病菌中能分别
扩增出大小约 ２３４ ｂｐ 和 ２２６ ｂｐ 的目的条带(图
２Ｃ)ꎮ 其中ꎬＭ８９７ 在参照菌株 Ｘａｃ 中也能扩增出
与Ｘｏｃ大小相近的ＤＮＡ片段 ꎬ说明在Ｘａｃ和Ｘｏｃ
Ｆｉｇ. ２　 Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａ ａｎｄ
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｔｈｒｅｅ ｃｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｍａｒｋｅｒｓ
Ａ: Ｍ１５７５ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＱＩＡｘｃｅｌ ｓｙｓｔｅｍꎻ Ｂ: Ｍ８９７ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ ｓｙｓｔｅｍꎻ
Ｃ: Ｍ５６８ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ ｓｙｓｔｅｍ. Ｌａｎｅ １￣３３:Ｓｔｒａｉｎｓ ｌｉｓｔｅｄ ａｓ ｔｈｏｓｅ ｉｎ Ｆｉｇ.１.
５８５
　
植物病理学报 ４３卷
Ｆｉｇ. ３　 ＰＣＲ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａ ａｎｄ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ
Ａ: Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ ｍａｒｋｅｒｓ Ｘｏｃ￣ＯＲＦ２ꎬ Ｍ８９７ꎬ Ｍ１５７５ ａｎｄ Ｍ５６８ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｘｏｃ ＲＳ１０５ꎬ Ｌａｎｅ １￣６: ５ ×１０８
ｔｏ ５ ×１０３ｃｆｕ􀅰ｍＬ￣１ ｏｆ Ｘｏｃꎬ １０ ｔｉｍｅｓ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ Ｂ: Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ ｍａｒｋｅｒｓ Ｘｏｏ￣Ｈｐａ１ꎬ Ｍ８９７ꎬ Ｍ１５７５
ａｎｄ Ｍ５６８ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｘｏｏ ＰＸＯ９９ꎬ Ｌａｎｅ １￣６: ５ ×１０８ ｔｏ ５ ×１０３ｃｆｕ􀅰ｍＬ￣１ ｏｆ Ｘｏｏꎬ １０ ｔｉｍｅｓ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
两菌中ꎬＭ８９７ 所标记的差异序列比较保守ꎬ但不
会影响其在水稻细菌性条斑病菌和白叶枯病菌检
测中的应用ꎻ而另外两个共显性标记 Ｍ５６８ 与
Ｍ１５７５不能在其它参照菌株中检测到目的 ＤＮＡꎮ
　 　 同时ꎬ其它 ７对显性引物的 ＰＣＲ产物经全自动
ＤＮＡ分析仪检测ꎬ不能非常清楚区分 Ｘｏｏ和 Ｘｏｃ两
种菌ꎬ不宜用于鉴定 Ｘｏｃ与 Ｘｏｏ(结果未显示)ꎮ
２.３　 分子标记灵敏度的检测
　 　 选用水稻细菌性条斑病菌 ＲＳ１０５ 菌株和水稻
白叶枯病菌 ＰＸＯ９９ 菌株作为供试菌ꎬ对 ２ 对显性
标记和 ３对共显性分子标记进行灵敏度检测ꎮ 设
定两菌株初始菌悬液的 ＯＤ６００ ＝ ０.５(５ ×１０８ ｃｆｕ􀅰
ｍＬ￣１)并将其按 １０ 倍梯度稀释ꎬ所得菌液作为
ＰＣＲ的模板ꎮ 利用已建立起来的 ＰＣＲ体系进行灵
敏度检测ꎬ结果通过 ＱＩＡｘｃｅｌ全自动 ＤＮＡ / ＲＮＡ分
析系统进行检测分析(图 ３)ꎮ Ｘｏｃ￣ＯＲＦ２ 与 Ｘｏｏ￣
Ｈｐａ１检测的灵敏度分别为 ５ ×１０４和 ５ ×１０６ ｃｆｕ􀅰
ｍＬ￣１ꎬＭ８９７检测 Ｘｏｃ和 Ｘｏｏ的灵敏度分别为 ５×１０７
和 ５×１０４ ｃｆｕ􀅰ｍＬ￣１ꎬＭ５６８ 检测 Ｘｏｃ 和 Ｘｏｏ 的灵敏
度分别为 ５×１０５和 ５×１０４ ｃｆｕ􀅰ｍＬ￣１ꎬＭ１５７５检测 Ｘｏｃ
和 Ｘｏｏ的灵敏度均为 ５×１０５ ｃｆｕ􀅰ｍＬ￣１(表 ３)ꎮ
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｍａｒｋｅｒｓ
Ｎａｍｅ ＲＳ１０５ / ｃｆｕ􀅰ｍＬ￣１ ＰＸＯ９９ / ｃｆｕ􀅰ｍＬ￣１
Ｘｏｃ￣ＯＲＦ２ ５×１０４ 　 (Ｆｉｇ ３Ａ)
Ｘｏｏ￣Ｈｐａ１ ５×１０
６ 　 (Ｆｉｇ ３Ｂ)
Ｍ８９７ ５×１０７ 　 (Ｆｉｇ ３Ａ) ５×１０４ 　 (Ｆｉｇ ３Ｂ)
Ｍ１５７５ ５×１０５ 　 (Ｆｉｇ ３Ａ) ５×１０５ 　 (Ｆｉｇ ３Ｂ)
Ｍ５６８ ５×１０５ 　 (Ｆｉｇ ３Ａ) ５×１０４ 　 (Ｆｉｇ ３Ｂ)
　
２.４　 对稻种样品的检测
　 　 以 ＱＩＡｘｃｅｌ 系统为 ＰＣＲ 产物分析系统ꎬ细菌
性条斑病菌特异分子标记 Ｘｏｃ￣ＯＲＦ２ 仅能从
ＲＳ１０５浸泡以及 ＲＳ１０５和 ＰＸＯ９９混合浸泡的中花
１１ 种子重悬液中扩增出特异条带ꎬ而不能从
ＰＸＯ９９及水浸泡的水稻种子重悬液中扩增出特异
条带(图 ４)ꎮ 水稻白叶枯病菌特异分子标记 Ｘｏｏ￣
Ｈｐａ１也仅能从 ＰＸＯ９９ 浸泡以及 ＲＳ１０５ 和 ＰＸＯ９９
混合浸泡的中花 １１ 种子重悬液中扩增出特异条
带ꎮ 同理ꎬＭ８９７、Ｍ１５７５ 和 Ｍ５６８ 共显性分子标记
能从除水之外的 ３种水稻种子浸提液中扩增出特异
条带ꎬ所不同的是ꎬ３对共显性分子标记在ＲＳ１０５和
６８５
　
　 ６期 冯雯杰ꎬ 等:水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的分子标记筛选及检测
Ｆｉｇ. ４　 Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｘｏｏ ａｎｄ Ｘｏｃ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｍａｒｋｅｒｓ ｆｒｏｍ ｂａｃｔｅｒｉａ￣ｓｏａｋｅｄ ｒｉｃｅ ｓｅｅｄｓ
Ｌａｎｅ １￣４: ＰＣＲ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ ｓｅｅｄｓ ｐｒｅ￣ｓｏａｋｅｄ ｗｉｔｈ ＲＳ１０５ꎬ ＰＸＯ９９ꎬ
ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ＲＳ１０５ ａｎｄ ＰＸＯ９９ꎬ ａｎｄ ｗａｔｅｒꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
ＰＸＯ９９混合浸泡的中花 １１ 种子重悬液中均能扩
增出 Ｘｏｃ 和 Ｘｏｏ 特异的带型ꎬ并且能较好的被仪
器识别区分ꎬ说明筛选的 ５对引物可较好的用于对
水稻种子的检测(图 ４)ꎮ 其中ꎬＭ８９７ 标记的区分
效果更加显著ꎬＭ８９７ 能鉴定 ２３８ ｂｐ 的条斑病菌
ＤＮＡ片段和 ２１５ ｂｐ的白叶枯病菌基因片段ꎬ两者
片段长度差异最大ꎻＭ１５７５ 能区分 １９８ ｂｐ 的条斑
病菌片段和 ２０４ ｂｐ 的白叶枯病菌目的片段ꎻ而
Ｍ５６８在条斑病菌和白叶枯病菌中检测的 ＤＮＡ 片
段大小分别是 ２３２和 ２２７ ｂｐꎮ 与前面所得结果(图
１、图 ２)相比ꎬ显性分子标记的检测大小误差在 １~
２ ｂｐ左右ꎬ相差不大ꎻ共显性分子标记的检测片段
大小误差在 ３ ~ ４ ｂｐ 的范围之内ꎬ这可能是因为外
在环境(高温、低温等)的变化造成 ＤＮＡ泳动速率
变化形成的 ＱＩＡｘｃｅｌ自身的系统误差ꎬ但不影响实
验检测的效果ꎮ
３　 结论与讨论
　 　 随着水稻白叶枯病菌与水稻条斑病菌在全球
范围内的扩展蔓延ꎬ检验检疫作为有效的防治措施
显得尤为重要ꎮ 传统的筛选分离手段对于同种不
同致病变种等ꎬ形态特征极为相似菌株ꎬ区分起来
耗时耗力ꎮ 噬菌体技术在水稻细菌病害流行中较
为常用ꎬ但噬菌体专化性易造成的假阴性以及血清
学方法中抗血清质量问题易产生的假阳性[ ７ ]ꎬ使
得这种方法的普及受到限制ꎮ 在当前的检验检疫
工作中ꎬ采用方便、经济的 ＰＣＲ分子标记开展相关
工作已经成为主要方法ꎬ各种以 ＰＣＲ 为依托的检
测方法络绎不绝ꎬ如 ＴａｑＭａｎ 实时荧光 ＰＣＲ 方法
虽然准确灵敏但成本昂贵ꎬ很难应用到日常检验检
疫工作中ꎮ 在水稻两种细菌性病害的检验检疫中ꎬ
前人利用两种病原菌中电子转移黄蛋白 α 亚基的
差异和跨膜蛋白基因 (ＡＹ３１９９３７、ＡＹ３１９９４１)的
差异设计显性专化性引物来进行鉴定区分ꎬ取得一
定的效果[６ ~ ８]ꎮ 由于细菌间存在一定程度的遗传
物质的交换ꎬ单一分子标记容易造成检测上的误
差ꎬ而且 ＰＣＲ实验在实际操作中容易形成一定的
污染概率ꎬ存在一定的假阳性风险ꎬ因此开发丰富
的、保守性高的分子标记进行多位点检测有利于保
证检测的准确性ꎮ 本研究基于全基因组序列分析ꎬ
结合了高通量全自动的 ＤＮＡ 分析系统ꎬ成功开发
了 ５对特异性引物ꎬ能较好从候选菌株中区分水稻
条斑病菌与白叶枯病菌ꎬ可直接应用于检验检疫工
作ꎬ并可发展多标记协同检测方法ꎬ提高检测准确
性ꎮ 而在检疫工作中ꎬ对于大量的样本采用多标记
协同检测ꎬ结合本实验尝试的高通量、自动化的
ＰＣＲ检测方法有利于提高检测效率ꎬ符合检测技
术发展的方向ꎮ
　 　 开发的 ３对共显性分子标记可同时检测两种
病害ꎬ在实际操作中具有更好的应用潜力ꎮ 从检测
对象上ꎬ两种病害在田间常协同发生[３]ꎬ疫区种子
可能同时携带两种病原菌ꎬ共显性标记可同时检测
两种菌ꎬ简化了检测程序ꎻ从操作上ꎬ共显性标记可
以互为参照ꎬ在同一批次的检疫过程中可以减少
７８５
　
植物病理学报 ４３卷
ＰＣＲ假阴性效果ꎬ提高检测的准确性ꎻ尤为重要的
是ꎬ我们筛选的共显性标记的靶标基因在两菌间高
度保守ꎬ形成的差异在长期的进化过程中已经稳
定ꎬ在遗传上存在更高的稳定性ꎬ不容易发生丢失
或交换ꎮ 在引物的设计中ꎬ我们利用完成了全基因
组测序的水稻白叶枯菌 ３ 个菌株与水稻条斑病菌
２个菌株的序列信息构建比较基因组学算法[ １９ ]ꎬ
在 Ｘｏｏ和 Ｘｏｃ 两者的 Ｂｌａｓｔ 结果中ꎬ寻找相似度大
于 ８０％ꎬ相似区段大于 ２００ ｂｐ 的片段设计引物ꎮ
所合成的 １０ 对引物中ꎬ３ 对引物能成功的区分开
已经鉴定的菌株ꎬ另外 ７对引物虽然在已经测序的
５株菌株中能区分ꎬ但在 ２８ 株 Ｘｏｏ 和 Ｘｏｃ 混合菌
株中不能有效区分ꎬ如 ＳＳＲ１ 和 ＳＳＲ２ 扩增产物在
Ｘｏｃ与 Ｘｏｏ各菌株中存在丰富的多样性ꎬ推测这些
微卫星标记属于进化上的活跃区ꎬ不适合作为分子
标记进行区分 Ｘｏｃ 与 Ｘｏｏꎻ Ｍ１２３８、 Ｍ１３８２ 和
Ｍ１４７０等标记也能有效区分 Ｘｏｏ与 Ｘｏｃꎬ但有个别
Ｘｏｏ菌株未能扩增出目标大小的带型ꎬ推测相关菌
株在引物序列上可能存在有突变影响 ＰＣＲ 扩增ꎻ
Ｍ７４３ 及 Ｍ７６３ 扩增的结果显示白叶枯病菌
ＰＸＯ８６与 ５个条斑病菌分在一起ꎬ推测与 Ｘｏｏ 和
Ｘｏｃ菌株间进化上存在遗传物质的交流相关(结果
未显示)ꎮ 因此ꎬ基于两者遗传上高度相似ꎬ在实
际检疫过程中仅基于单一位点的检测方法存在一
定的风险ꎬ宜采用多个特异性引物共同检测的多位
点检测方法ꎮ
　 　 同时ꎬ本研究开发的能区分 Ｘｏｏ 和 Ｘｏｃ 的分
子标记主要基于配套高通量 ＤＮＡ 电泳检测技术
开发ꎬ所以 ＰＣＲ 扩增条带长度均设定在 ２００ ｂｐ 左
右ꎬ实验证明无论显性引物 Ｘｏｃ￣ＯＲＦ２ 和 Ｘｏｏ￣
Ｈｐａ１ꎬ还是共显性引物 Ｍ８９７、Ｍ１５７５ 和 Ｍ５６８ 都
能有效区分已经鉴定的菌株ꎬ可作为检疫用分子标
记ꎮ 相比常规的琼脂糖凝胶电泳ꎬ采用新的 ＤＮＡ
检测系统ꎬ其用样量少至 ０.１ μＬ ＤＮＡ 样品ꎬ只有
常规 ＤＮＡ电泳检测用量的百分之一ꎬ因此在以后
的检测工作中ꎬ可以通过优化更小的 ＰＣＲ 反应体
系来达到节约检测成本以及提高检测灵敏度的目
的ꎮ 两种 ＤＮＡ全自动分析仪的检测分辨率较高ꎬ
可区分 ５ ~ ６ ｂｐ 大小的碱基差异ꎬ并能够在图谱上
直接显示 ＤＮＡ片段的大小ꎬ虽然也存在一定的系
统读数误差ꎬ但相比较琼脂糖电泳ꎬ分辨率具有很
大的提高ꎮ 新的检测系统具备检测差异更小序列
的能力ꎬ扩大了分子标记的选择范围ꎬ尤其对共显
性引物而言具有更好的优势ꎬ片段长度差异越小ꎬ
越有效降低 ＰＣＲ 环节对某特定条带的优势扩增ꎮ
综合而言ꎬ应用新的检测系统可扩大分子标记的选
择范围ꎬ全自动及高通量、快速的特点也符合植物
检疫发展的方向ꎮ
　 　 此外ꎬ筛选到的标记均能在稻种的浸提液中有
效地鉴定出两种病原菌ꎬ为我们的实际应用奠定了
基础ꎮ 同时ꎬ应用新的分子标记用于实验室遗传操
作过程中相关菌株的区分已经取得较好效果(未
发表数据)ꎮ 因此ꎬ通过生物信息学方法筛选水稻
白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的特异性分子标记ꎬ
结合简单的 ＰＣＲ 技术以及灵敏的高通量 ＤＮＡ 检
测系统进行检测ꎬ为简便ꎬ快速、准确及高通量地检
测两种病原细菌开辟了有效途径ꎮ
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８８５
　
　 ６期 冯雯杰ꎬ 等:水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌的分子标记筛选及检测
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａ ｂｙ ＰＣＲ
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Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ (江西农业大学学报)ꎬ ２０１１ꎬ
３３ (２): ０２６４－０２６９.
[１２] Ｏｃｈｉａｉ Ｈꎬ Ｉｎｏｕｅ Ｙꎬ Ｔａｋｅｙａ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅ￣
ｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ ｓｕｇｇｅｓｔｓ
ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｉｎ￣
ｓｅｒｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｔｏ ｉｔｓ ｒａｃｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ. Ｊａｐａｎ Ａｇｒｉｃｕｌ￣
ｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙꎬ ２００５ꎬ ３９ (４): ２７５－２８７.
[１３] Ｌｅｅ Ｂ Ｍꎬ Ｐａｒｋ Ｙ Ｊꎬ Ｐａｒｋ Ｄ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅ￣
ｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ
ＫＡＣＣ１０３３１ꎬ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｌｉｇｈｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｏｆ ｒｉｃｅ.
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈꎬ ２００５ꎬ ３３ (２): ５７７－５８６.
[１４] Ｓａｌｚｂｅｒｇ Ｓ Ｌꎬ Ｓｏｍｍｅｒ Ｄ Ｄꎬ Ｓｃｈａｔｚ Ｍ Ｃꎬ ｅｔ ａｌ. Ｇｅ￣
ｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｐａｔｈｏ￣
ｇｅｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ ＰＸＯ９９Ａ. ＢｉｏＭｅｄ
Ｃｅｎｔｒａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓꎬ ２００８ꎬ ９: ２０４.
[１５] Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ Ａ Ｊꎬ Ｋｏｅｂｎｉｋ Ｒꎬ Ｌｕ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｗｏ ｎｅｗ
ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆｆｅｒ ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｈｏｓｔ ａｎｄ
ｔｉｓｓｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ.
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙꎬ ２０１１ꎬ １９３ ( １９): ５４５０ －
５４６４.
[１６] Ｚｈａｏ Ｂ Ｙꎬ Ｅｄｎａ Ｙ Ａꎬ Ａｓｕｎｃｉｏｎ Ｒꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｈｅ ａｖｒ
Ｒｘｏ１ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ
ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａ ｃｏｎｆｅｒｓ ａ ｎｏｎｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｎ
ｍａｉｚｅ ｗｉｔｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ Ｒｘｏ１. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉ￣
ｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ ２００４ꎬ １７ (７): ７７１－７７９.
[１７] Ｚｈａｏ Ｂ Ｙꎬ Ｌｉｎ Ｘ Ｈꎬ Ｊｅｓｓｅ Ｐꎬ ｅｔ ａｌ. Ａ ｍａｉｚｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｇａｉｎｓｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｔｒｅａｋ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｒｉｃｅ.
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ
２００５ꎬ １０２ (４３): １５３８３－１５３８８.
[１８] Ａｈｍｅｄ Ｈꎬ Ｃｈｒｙｓｔｅｌｌｅ Ｂꎬ Ｚｈａｏ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ ｓｅ￣
ｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｍｉｎｉｎｇ
ｐｒｏｖｉｄｅ ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｈｉｓｔｏｒｙ ａｎｄ
ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａ￣
ｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２０１２ꎬ １３ (３): ２８８－３０２.
[１９] Ｌａｎｇ Ｊ Ｍꎬ Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｊ Ｐꎬ Ｄｉａｚ Ｍ Ｇꎬ ｅｔ ａｌ. Ｇｅｎｏｍｉｃｓ－
ｂａｓｅｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ ａｎｄ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉ￣
ｃｏｌａ. Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅꎬ ２０１０ꎬ ９４: ３１１－３１９.
责任编辑:李晖
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