全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
#"""*"!$
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#
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.
,/001,#"""*"!$,!"#$,"$,"&&
收稿日期$
!"#*#!*%"
&修改稿收到日期$
!"#$*"%*!#
基金项目$国家自然科学基金项目"
%##-#+"+
#
作者简介$李
!
蒙"
#)&&(
#!男!在读硕士研究生!主要从事蛋白质与酶学的研究
2*34/5
$
5/361
7
")!#&&
!
#!+,893
"
通信作者$陈
!
鹏!博士!教授!主要从事蛋白质与酶学的研究
2*34/5
$
:
61
7
8;61
!
1<0=4>,6?=,81
苦荞二氢黄酮醇
$%
还原酶的原核表达
与多克隆抗体制备
李
!
蒙!陈芳霞!吕
!
宁!陈
!
鹏"
"西北农林科技大学 生命科学学院!陕西杨陵
-#!#""
#
摘
!
要$苦荞二氢黄酮醇
*
还原酶"
@AB
#是花青素合成途径的关键酶该研究以苦荞种子灌浆期
8@CD
为模板!
采用
BE*FGB
方法克隆苦荞
@AB
编码基因!并将其连接到表达载体
:
2E-H
上!转化获得苦荞
@AB
编码基因的大
肠杆菌
!"!#
"
@2%
#工程菌!通过
IFEJ
诱导表达!用
K@K*FDJ2
分析表达产物!用亲和层析方法纯化蛋白!制备苦
荞
@AB
多克隆抗体
BE*FGB
技术获得了苦荞
@AB
编码基因的开放阅读框!重组表达载体经
FGB
和测序鉴定!
表明表达载体构建成功!
K@K*FDJ2
分析表达产物分别以可溶和不可溶的形式高效表达!亲和层析纯化得到融合
蛋白!
L60M6N1H59MM/1
7
显示!制备的多克隆抗体能特异识别其对应的抗原!天然的苦荞
@AB
蛋白在苦荞种子灌浆
期中大量表达苦荞
@AB
编码基因的原核表达与多克隆抗体的制备!为进一步开展
@AB
编码基因功能的研究奠
定了基础
关键词$苦荞&二氢黄酮醇
*
还原酶&原核表达&多克隆抗体
中图分类号$
O-&$
文献标志码$
D
&"()
*
"+#,-.
/
011#"2"34)+)
*
56,(780)+9#8
*
!"3:);"2":
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PIQ61
7
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GR2CA41
7
S/4
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PTC/1
7
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GR2CF61
7
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G956
7
69>P/>6K8/61860
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C9NM;<60MDUAV1/W6N0/M
X
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Y41
7
5/1
7
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!
G;/14
#
=>1+),+
$
@/;
X
?N9>54W9195*N6?=8M406
"
@AB
#
/04Z6
X
61[
X
36/1M;6H/90
X
1M;60/09>41M;98
X
41/10/1M4NM4N
X
H=8Z<;64M,E;6@AB89?/1
77
616<4043
:
5/>/6?>N93M;6066?*>/5/1
7:
6N/9?8@CD9>M4NM4N
X
H=8Z<;64MH
X
BE*FGB41?5/
7
4M6?M9M;66S
:
N600/91W68M9N
:
2E-H,E;6#$%&(!"!#
"
@2%
#
84NN
X
/1
7
M;6@AB89?/1
7
7
616<409HM4/16?41?/1?=86?H
X
IFEJ,E;66S
:
N600/91
:
N9?=8M0<6N64145
X
[6?H
X
K@K*FDJ2
!
:
=N/>/6?H
X
4>>/1/M
X
8;N934M9
7
N4
:
;41?M;6;/
7
;M/M6N
:
95
X
85914541M/06N=3N4/06?4
7
4/10MN4HH/M<409HM4/16?,E;69
:
61
N64?/1
7
>N4369>@AB89?/1
77
616<409HM4/16?H
X
BE*FGB,D04145
X
[6?H
X
FGB41?@CD06
=618/1
7
,
E;6N6893H/141M
:
N9Z4N
X
9M/86S
:
N600/91W68M9N<408910MN=8M6?0=88600>=5
X
,D04145
X
[6?H
X
K@K*FDJ2
!
M;6@AB;4?H661;/
7
;*6>>/8/618
X
6S
:
N6006?/1#$%&(/1M;6>9N39>095=H56
:
N9M6/141?/185=0/91H9?/60,
F=N6>=0/91
:
N9M6/1<409HM4/16?H
X
4>>/1/M
X
8;N934M9
7
N4
:
;
X
,L60M6N1H59MM/1
7
4145
X
0/00;9<6?M;6N4/06?
41M/H9?
X
89=5?0
:
68/>/845
X
N648M7
6141?14M/W6@AB6S/0M6?/1M9M45
:
N9M6/19>066?>/5/1
7:
6N/*
9?9>H=8Z<;64M,E;606N60=5M09NM;6>=NM;6N0M=?
X
91M;6H/959
7
/845>=18M/919>@AB,
?0
*
7"!1
$
M4NM4N
X
H=8Z<;64M
&
@AB
&
:
N9Z4N
X
9M/86S
:
N600/91
&
:
95
X
85914541M/H9?
X
!!
苦荞"
)*
+
&
,-
./01*1*.(%/0
#作为一种健康食 品资源正风靡世界!主要在于其含有高生物价的蛋
白质和丰富的维生素(#)!近年来的研究表明!黄酮类
化合物是苦荞中重要的营养保健功能因子!芦丁*儿
茶素*花青素作为主要黄酮类化合物!具有抗氧
化(!)*抗癌(%*)*降血脂($)等一系列药理功效
在植物类黄酮代谢途径中!无色花青素是花青
素*儿茶素以及原花色素的共同前体二氢黄酮醇
*
还原酶"
?/;
X
?N9>54W9195*N6?=8M406
!
@AB
#可将
二氢黄酮醇还原为无色花青素!是调控植物体内类
黄酮代谢物积累的关键功能基因和重要的限速酶之
一!催化立体结构专一的三种黄酮醇"二氢山奈酚*
二氢槲皮素和二氢杨梅素#生成花色素的前体物(+)!
进而通过花色素合成酶"
DCK
#和类黄酮糖基转移
酶"
%*JE
或
$*JE
#形成各种花青素苷(-)由于它的
重要性!研究发现不同物种的
@AB
对
%
种底物的偏
爱性也存在差异!但
@AB
氨基酸序列在很多区域有
较高的同源性!而且在植物的进化过程中
@AB
的功
能没有变化(&)研究酿酒葡萄
@AB
三维结构发现!
底物特异性结合区域由
!+
个氨基酸组成!其中任何
一个氨基酸的突变都会改变酶对底物的特异性(+)!
根据特异区
#%%
位氨基酸的不同!可分为
D01
型*
D0
:
型和非
D01
%
D0
:
型())
目前已基本探明类黄酮花青素的生物合成途
径!由于
@AB
编码基因是花色改良和提高生物胁迫
的关键基因之一!该基因已经在不同种得到分离!在
拟南芥*大麦*金鱼草*葡萄*水稻*番茄中以单拷贝
存在!毛果杨*非洲菊!苜蓿是以功能特性不同的多
拷贝存在(#"*##)毛果杨
@AB
双基因转化的烟草中
发现!
@AB#
可以通过积累花青素而改变花的颜色!
而
@AB!
只积累浓缩的丹宁"原花青素#(##)因此!
高等植物在适应环境的过程中!
@AB
同工酶分别由
不同的转录因子调控!在促进植物进化中起着关键
作用(#!)植物
@AB
的过量表达都会提高黄酮的含
量和生物的抗氧化能力(#%*#$)
作为类黄酮代谢中关键酶!
@AB
对植物体内花
青素合成积累起到关键调节作用李小华等(#+)对
不同苦荞品种间与花青素合成相关的
$
个酶表达差
异的分析表明!
@AB
编码基因的表达量与苦荞黄酮
类化合物积累相关目前!关于苦荞
@AB
的研究主
要集中于转录水平(#-)!而关于翻译后
@AB
蛋白质
的研究未见报道本文利用
BE*FGB
方法!克隆获
得苦荞
@AB
编码基因!成功将它导入大肠杆菌中!
在优化表达基础上分离纯化苦荞
@AB
重组蛋白!进
行多克隆抗体的制备为从翻译水平分析
@AB
的
表达与苦荞黄酮类化合物累积的关系奠定基础
#
!
材料和方法
@,@
!
材
!
料
苦荞品种榆
+*!#
"榆林农业学校提供#!于大田
种植!开花
%?
后采集灌浆期样品!样品采集后立即
分装!液氮速冻后于
(&"]
冰箱保存原核表达载
体
:
2E-H
*大肠杆菌菌株
!"!#
"
@2%
#和
E^ F#"
均由本实验室保存
@,A
!
方
!
法
@BAB@
!
苦荞总
CD=
的提取及
,9D=
合成
!
苦荞种
子灌浆期总
BCD
的提取参照陈鹏等(#&)的方法进
行!以提取所得总
BCD
为模板!
5^/
7
9
"
?E
#
#&
为引
物!按照
B6W6NMD/?A/N0MKMN41?8@CDK
X
1M;60_/M
"
E;6N39K8/61M/>/8
公司#操作说明书合成
8@CD

@BABA
!
9EC
表达载体构建
!
据
J61`41Z
中苦荞
@AB
编码基因"
JV#+)+&,#
#
3BCD
全长信息!针
对其
B^A
设计了
#
对特异引物$上游引物
A
#
"
$a*
DGEJJGGJGJJJJJJEEJGEJDJJJDJDJD*
EGJEG*%a
!下划线为
2*%
"
酶切位点#!下游引物
B
#
"
$a*DGDGGJGEGJDJEGDDEJJGGDEEDG*
GDEEEDGD*%a
!下划线为
34&
#
酶切位点#!以合
成的
8@CD
为模板进行
FGB
扩增!扩增条件$
)&]
预变性
#3/1
!
)&]
变性
#"0
!
$)]
退火
!"0
!
-!]
延伸
#3/1
!
%"
个循环!扩增产物琼脂糖凝胶电泳检
测*纯化"北京百泰克生物科技有限公司回收试剂
盒#和双酶切!酶切产物经
E

@CDP/
7
406
连接到
表达载体
:
2E-H
后!
_GQ
方法转化大肠杆菌
E^ F#"
!阳性克隆菌经
FGB
和测序"北京奥科鼎盛
公司#鉴定
@,A,F
!
序列比对与分析
!
在
CG`I
数据库中
P`DKE
"
;MM
:
$%%
H540M,18H/,153,1/;,
7
9W
%
5`40M
#进
行核苷酸序列比对应用
@CDQDC
软件对推导
的氨基酸进行多序列比对利用
2SFDK
X
在线软
件对其进行等电点及分子量预测"
;MM
:
$%%
<<<,6S*
:
40
X
,9N
7
%#
@,A,$
!
重组蛋白的表达
!
_GQ
方法将测序正确
的重组表达载体
:
2E-H*@AB
转化大肠杆菌
P`!#
"
@2%
#!挑取阳性克隆单菌落接种到
_414
"
$"
$
7
%
3P
#的
P`
培养基中!
%-]
培养至
@^
+""
值达
",+
%
",&
时!加入
IFEJ
至终浓度
#3395
%
P
!
%-]
诱导
%
;
!收集
#,$3P
菌体!加入
#bK@K*FDJ2
上样缓冲
液悬浮菌体!沸水保温
#"3/1
后进行
K@K*FDJ2

@,A,G
!
重组蛋白的可溶性分析
!
参照文献(
#)
)的
方法优化表达条件!鉴定的重组表达单菌落接种到
$&&
$
期
!!!!!!!!!!
李
!
蒙!等$苦荞二氢黄酮醇
*
还原酶的原核表达与多克隆抗体制备
_414
"
$"
$
7
%
3P
#的
P`
培养基中!
%- ]
培养至
@^
+""
值达
",+
%
",&
时!分别加入
IFEJ
至终浓度
为
",#$3395
%
P
*
",!$3395
%
P
*
",$3395
%
P
和
#
3395
%
P
!置于
!!]
*
%"]
和
%-]
摇床中震荡培
养!每
;
*
&;
和
#!;
取样!用
K@K*FDJ2
检测重
组蛋白表达情况!参照文献(
!"
)进行可溶性分析!收
集剩余菌体后加入超声裂解缓冲液"
:
R-,$
!
!"
3395
%
PEN/0*RG5
!
$"3395
%
PC4G5
#!超声破碎!
#!"""N
%
3/1
!
]
离心
#"3/1
后!上清和沉淀分别
进行
K@K*FDJ2
分析
@,A,H
!
钴离子螯合层析纯化目的蛋白
!
收集诱导
菌体超声破碎后!
#!"""N
%
3/1
!
]
离心
#"3/1
!上
清与等体积的
!bF` K
"
:
R-,$
!
",#3395
磷酸二
氢钠!
",+395
%
PC4G5
#混合!缓慢上样经
#bF` K
平衡的
E4591N60/1
柱上!先
#bF` K
洗脱杂蛋白!
然后用含
!"3395
%
P
咪唑(!#)的
F` K
再次洗脱杂蛋
白!最后用含
#$"3395
%
P
咪唑的
F` K
洗脱目标蛋
白目标蛋白经
:
R-,$
的透析液"
!"3395
%
P
EN/0*RG5
!
$"3395
%
PC4G5
#透析后!再通过
F2J*
+"""
浓缩!电泳检测!
(!"]
保存
@,A,I
!
重组蛋白抗体的制备
!
将浓缩后的蛋白与
!bK@K*FDJ2
上样缓冲液混合!
#"" ]
煮沸
#"
3/1
!进行电泳!将凝胶用考马斯亮蓝
B!$"
染色
灭菌水洗涤后!切取目的条带置于研钵中!加入液氮
充分研磨成粉末状加入
#3P#bF` K
"
:
R-,$
#
充分溶解(!!)*混匀后!将制备好的抗原与等体积弗
氏完全佐剂"
K/
7
34
#充分乳化后!皮下多点注射免
疫
!
只大耳朵雄兔!每只兔抗原剂量
#3
7
(
!%
)
!初次
免疫后
!
周!抗原与弗氏不完全佐剂"
K/
7
34
#等体
积充分混匀!免疫剂量减至
$""
$
7
!皮下多点注射
之后每隔
!
周加强免疫
#
次!剂量如二免
%
次加
强免疫后测抗血清效价!当达到满意值后!兔心脏穿
刺取血!所取血液
%-]
静置
#;
!之后室温静置至抗
血清析出!收集血清!即得到
@AB
的多克隆抗体!
(!"]
冻存备用
@BABJ
!
抗体的
K01+02>:"++#2
L
检测
!
取
#
7
灌浆
期的苦荞种子!参考李玉萍等(!")加入
!3P
可溶蛋
白提取液"
:
R-,$
!
#"3395
%
PEN/0*RG5
!
$3395
%
PC4G5
#!研钵中充分研磨*混匀后置于
]
过夜!
#""""N
%
3/1
!
]
离心
#"3/1
!上清即为种子总蛋
白!
(!"]
保存参考文献(
!
)方法
L60M6N1H59M*
M/1
7
分析!苦荞总蛋白和原核表达蛋白经
K@K*
FDJ2
分离后转移至
",#$
$
3
的
CG
膜上!
$"3D
电流下转移
#;
!辣根过氧化酶"
RBF
#标记的山羊
抗兔
I
7
J
为二抗"
#c#"""
!北京博奥森生物科技有
限公司#进行蛋白质印迹分析!印迹信号采用化学发
光显色试剂盒"北京康为世纪生物科技有限公司#进
行显色!并利用化学发光成像仪"
G;63/@98dBK
K
X
0M63
!
/`9*B4?
#记录结果
!
!
结果与分析
AB@
!
苦荞
9EC
编码基因片段的扩增
用设计的引物进行
@AB
编码基因
FGB
扩增!
扩增产物通过
#e
"
5
%
6
#琼脂糖凝胶电泳检测!显
示一条
#"!+H
:
的特异性扩增片段"图
#
#!与预期
大小一致测序结果表明!本研究扩增获得的苦荞
二氢黄酮醇
*
还原酶基因全长
#"!+H
:
!编码
%#
个氨基酸!利用在线软件预测该蛋白分子量为
%&,$%
Z@
!等电点为
$,-&
!重组蛋白分子量为
%),+$Z@
!等
电点为
+,!#

A,A
!
重组表达载体的鉴定与表达
将构建好的重组载体进行
FGB
鉴定!琼脂糖电
泳结果"图
!
#显示
FGB
扩增的片段与预期大小一
图
#
!
@AB
编码基因的
FGB
扩增
Q,@P!"""
&
#
*
!,@AB
编码基因的
FGB
扩增结果
A/
7
,#
!
FGB43
:
5/>/84M/919>M;689?/1
7
06
=61869>7)8
Q,@P!"""
&
#
!
,FGB
:
N9?=8M9>7)8
图
!
!
@AB
的质粒
FGB
扩增
Q,@P!"""
&
#
%
$,@AB
的质粒
FGB
扩增
A/
7
,!
!
K8N661/1
7
9>
:
90/M/W6N6893H/141M
:
5403/?H
X:
5403/?FGB
Q,@P!"""
&
#($,F5403/?FGB9>>/W6N6893H/141M
:
5403/?0
+&&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
%
!
7)8
诱导表达的
K@K*FDJ2
分析
Q,
蛋白
34NZ6N
&
#
*
%,
诱导前对照菌&
!
*
,
诱导表达菌体
A/
7
,%
!
K@K*FDJ24145
X
0/09>M;66S
:
N600/919>7)8
Q,FN9M6/134NZ6N
&
#
!
%,V1/1?=86?8650891M4/1/1
7
:
2E-H*@AB
&
!
!
,I1?=86?8650891M4/1/1
7:
2E-H*@AB
图

!
目的蛋白的可溶性表达分析
Q,
蛋白
34NZ6N
&
#,
未诱导的菌体蛋白&
!,
诱导的菌体蛋白&
%,
诱导菌株超声波裂解后的沉淀&
,
诱导菌株超声波裂解后的上清
A/
7
,
!
E;6095=H/5/M
X
4145
X
0/09>N6893H/141M
Q,FN9M6/134NZ6N
&
#,V1/1?=86?8650891M4/1/1
7:
2E-H*@AB
&
!,I1?=86?8650891M4/1/1
7:
2E-H*@AB
&
%,I1095=H56
:
N9M6/1
>N93/1?=86?865891M4/1/1
7:
2E-H*@AB
&
,K95=H56
:
N9M6/1>N93/1?=86?865891M4/1/1
7:
2E-H*@AB
图
$
!
纯化蛋白的
K@K*FDJ2
分析
Q,
蛋白
34NZ6N
&
#
%
%,
纯化的目的蛋白
A/
7
,$
!
K@K*FDJ24145
X
0/09>
:
=N/>/6?@AB
Q,FN9M6/134NZ6N
&
#(%,F=N/>/6?
:
N9M6/1
图
+
!
@AB
的
L60M6N1H59MM/1
7
分析
#,
诱导后的目的蛋白&
!,
未重组表达载体的
菌体蛋白&
%,
苦荞种子灌浆期中总蛋白
A/
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的原核表达载体构建成
功重组表达载体转化到表达菌
!"!#
"
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#!诱导
后经
K@K*FDJ2
分析!在
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%
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之间有明显的
诱导表达条带!其大小与预测的重组蛋白分子量大
小相符"图
%
#!说明重组蛋白诱导表达成功为了
获得最大可溶性目的蛋白产量!获得
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表达菌株最佳诱导条件!诱导温度
!!]
*诱导时间
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*
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浓度
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K@K*FDJ2
分析目
的 蛋白在大肠杆菌
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"
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#中分别以上清与包
涵体形式存在"图

#
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!
重组蛋白的纯化与抗体制备
将含重组蛋白的上清经过钴离子螯合层析柱纯
化后!
K@K*FDJ2
检测结果表明钴柱
E4591N60/1
实
现了该重组蛋白的高效纯化"图
$
#为彻底除去目
的蛋白中可能存在的微量杂蛋白!将纯化的目的蛋
白
K@K*FDJ2
"
!"83b!"83
#电泳!考马斯亮蓝染
色后切取目标条带!灭菌水洗涤后进行兔抗苦荞
@AB
多克隆抗体制备
AB$
!
多克隆抗体的
K01+02>:"++#2
L
检测
利用
L60M6N1H59MM/1
7
检测制备抗体的特异
性!结果显示原核表达的融合蛋白*苦荞种子灌浆期
总蛋白与抗血清杂交显示单一条带!而未重组表达
载体的菌体蛋白没有杂交出任何条带"图
+
#!说明
该抗体具有较高的特异性!且在灌浆期的苦荞种子
中含有大量的
@AB
蛋白由于重组蛋白
@AB
含有
组氨酸标签!
L60M6N1H59MM/1
7
中灌浆期苦荞种子杂
交的蛋白条带较原核表达的蛋白分子量略小
%
!
讨
!
论
苦荞种子富含氨基酸均衡的蛋白质和高生物活
性的黄酮类物质!是典型的药粮兼用作物灌浆期
是苦荞营养物质累积与合成的关键时期!研究该时
期籽粒中各种营养物质累积及次生代谢相关基因的
-&&
$
期
!!!!!!!!!!
李
!
蒙!等$苦荞二氢黄酮醇
*
还原酶的原核表达与多克隆抗体制备
表达规律对于提高苦荞的营养保健价值具有重要理
论和应用价值(#&)二氢黄酮醇
*
还原酶是苦荞次
生代谢途径中的关键酶和一个重要的调控位点!不
但参与黄酮类化合物的累积(#$!$)!而且参与显花植
物雄性能育过程(!+)植物
@AB
与哺乳动物
%
&
*
羟
基类固醇脱氢酶通过蛋白序列比对!发现它们由同
一个祖先演化而来(!-)!至今人们从多种植物分离并
鉴定出
@AB
编码基因!研究结果显示!
@AB
同源基
因都具有一个典型的
CD@F
结合位点和
!+
个氨基
酸组成的底物特异性结构域(!&)祝婷等(!))首次克
隆了苦荞
@AB
编码基因!到目前关于其蛋白质相关
的研究还未有报道!本研究从苦荞灌浆期种子中克
隆得到
@AB
编码基因!利用
@CDQDC
软件分析!
发现其具有
@AB
同源基因的典型特征和关键结构
域!推测苦荞
@AB
编码基因编码蛋白具有催化活
性!相关文献表明大肠杆菌和酵母中表达的
@AB
也
都具有酶活和底物偏爱性(#)!%"*%#)由于目前对大肠
杆菌的遗传背景和生理特性研究了解得比较清楚!
无未知干扰蛋白的产生!为获得高纯度融合蛋白提
供有力工具因此!本研究通过构建
@AB
原核重组
表达载体!转化大肠杆菌
!"!#
"
@2%
#!实现了该基
因的原核表达!但原核高效的表达系统!使部分蛋白
不能有效正确折叠形成了包涵体!通过优化表达条
件!找到了获得大量可溶性蛋白的途径$首先菌体的
活化过程!严格控制菌液
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值达
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进行
诱导!诱导温度
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*诱导时间
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浓度
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!使用固定化钴离子结合
RIK
标签纯
化蛋白!适宜浓度咪唑洗脱!最终获得高纯度
@AB
融合蛋白!为深入研究苦荞
@AB
的反应动力学*催
化特性奠定了基础
真核生物次生代谢相关基因的表达调控包含转
录水平和翻译水平等多个层次!目前关于
@AB
编码
基因转录调控机制的研究在许多植物中都已经取得
了突破!通过转录因子调控结构基因的表达!进而影
响植物次生代谢物的合成和累积(#!!%!)而探讨苦
荞次生代谢物的累积与
@AB
表达的关系!从翻译水
平入手更具现实意义!免疫学技术是研究蛋白质表
达水平的有效方法!本研究通过原核表达获得大量
的目的蛋白!通过亲和层析!得到高纯度目的蛋白作
为抗原!免疫兔后获得
@AB
多克隆抗体!
L60M6N1
H59MM/1
7
显示获得的抗体特异性好!背景低!可以为
进一步开展
@AB
蛋白酶在不同苦荞品种*不同生长
发育时期和不同组织内的蛋白表达谱以及蛋白定位
等方向的研究提供有利工具
参考文献!
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