全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４５(２): １６７￣１７４(２０１５)
收稿日期: ２０１３￣１０￣３０ꎻ 修回日期: ２０１４￣１２￣１１
基金项目: 公益性行业(农业)科研专项(２００９０３０４９￣０６)
通讯作者: 张海峰ꎬ副教授ꎬ主要从事植物病原真菌分子生物学研究ꎻＴｅｌ: ０２５￣８４３９６４３６ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｈｆｚｈａｎｇ＠ｎｊａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
第一作者: 王健生ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事真菌遗传与分子生物学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｊｓｗａｎｇ０１２４＠ｓｉｎａ.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０２.００７
大豆枯萎病菌尖孢镰孢遗传多样性及大豆品种抗性
王健生ꎬ 李 潇ꎬ 张海峰∗ꎬ 张正光ꎬ 郑小波
(南京农业大学植物保护学院 /农业部作物病虫害监测与防控重点开放实验室ꎬ南京 ２１００９５)
摘要:了解大豆枯萎病菌的群体遗传特征及明确大豆种质对大豆枯萎病的抗性ꎬ对抗病育种、抗性品种的合理布局以及制
定更有效的病害防治策略具有重要的参考价值ꎮ 本研究利用随机扩增多态性 ＤＮＡ( ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡꎬ
ＲＡＰＤ)ꎬ对采自我国不同地区的大豆枯萎病菌—尖孢镰孢菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ)进行遗传多样性分析ꎬ筛选到 １０个多态
性随机引物ꎬ共扩增出 ７５条 ＲＡＰＤ条带ꎬ其中 ５５条为多态性条带ꎬ占 ７３.３％ꎮ 利用 ＵＰＧＭＡ法对 ＤＮＡ扩增图谱进行聚类
分析ꎬ以相似系数 ０.６８为阈值ꎬ５５个分离物可分为 ９个遗传聚类组ꎬ表明我国大豆枯萎病菌具有丰富的种内遗传多样性ꎬ
所划分的群体与分离物来源地不相关ꎮ 同时ꎬ对上述分离物进行致病性分析ꎬ发现我国的大豆枯萎病菌具有明显的致病力
分化现象ꎮ 进一步利用 ３个代表性分离物对来自我国不同大豆产区的 １８０个大豆品种(资源)进行抗大豆枯萎病鉴定ꎬ发
现皖豆 ２８、中黄 １３、中黄 ５１、中作 Ｘ０８０７６和 ５Ｄ０３４等 ５个品种对大豆枯萎病具有良好抗性ꎬ占供试材料的 ２.８％ꎬ表明不同
大豆品种对枯萎病的抗性存在一定的差异ꎮ
关键词:大豆枯萎病ꎻ 尖孢镰孢菌ꎻ 遗传多样性ꎻ ＲＡＰＤ分析ꎻ 品种ꎻ 抗性
Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｓｏｙ￣
ｂｅａｎ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｗｉｌｔ ｏｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｌｉｎｅｓ　 ＷＡＮＧ Ｊｉａｎ￣ｓｈｅｎｇꎬ ＬＩ Ｘｉａｏꎬ ＺＨＡＮＧ Ｈａｉ￣ｆｅｎｇꎬ ＺＨＡＮＧ
Ｚｈｅｎｇ￣ｇｕａｎｇꎬ ＺＨＥＮＧ Ｘｉａｏ￣ｂｏ 　 (Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ / Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｒｏｐ
Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｐｅｓｔ Ｉｎｓｅｃｔｓꎬ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｎａｎｊｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９５ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｓｏｙｂｅａｎ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｗｉｌｔ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｄｅｖａｓｔａｔｉｎｇ ｓｏｙｂｅａｎ
ｄｉｓｅａｓｅｓ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ. Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ
ｓｏｙｂｅａｎ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｔｏ ｓｏｙｂｅａｎ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｗｉｌｔ ｗｉｌｌ ｂｅｎｅｆｉｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎꎬ ｒｅａｓｏｎａｂｌｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ
ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｗ ｄｉｓｅａｓｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ. Ｔｏ ｃｌａｒｉｆｙ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ
ａｍｏｎｇ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｉｓｏｌａｔｅｓꎬ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ ｏｆ ５５ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｓｏｙｂｅａｎ￣ｇｒｏｗｉｎｇ ａｒｅａｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ １０ ＲＡＰＤ ｐｒｉｍｅｒｓ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ７５ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ
ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ａｎｄ ａｍｏｎｇ ｔｈｅｍꎬ ５５ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ (７３. ３％) . Ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＵＰＧＭＡꎬ ｔｈｅ ５５ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ
ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｉｎｔｏ ９ ｇｒｏｕｐｓ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｓ ０.６８ꎬ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ
ｉｓｏｌａｔｅｓ ａｒｅ ｄｉｖｅｒｓｅ.Ｗｅ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｎ ｓｏｙｂｅａｎ ｌｉｎｅｓ
ａｎｄ ｓｏｙｂｅａｎ ｌｉｎｅｓ ａｌｓｏ ｓｈｏｗｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｉｓｏｌａｔｅｓ. Ｔｏ ｍａｋｅ ｃｌｅａｒ ｔｈｅ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｔｏ ｓｏｙｂｅａｎ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｗｉｌｔꎬ １８０ ｓｏｙｂｅａｎ ｌｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ｓｏｙｂｅａｎ￣ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｒｅａｓ ａｎｄ
ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｕｎｉｔｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ５ ｌｉｎｅｓ (Ｗａｎｄｏｕ２８ꎬ Ｚｈｏｎｇｈｕａｎｇ１３ꎬ Ｚｈｏｎｇｈｕａｎｇ５１ꎬ
ＺｈｏｎｇｚｕｏＸ０８０７６ ａｎｄ ５Ｄ０３４) ｗｅｒｅ ｈｉｇｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｓｏｙｂｅａｎ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｗｉｌｔꎬ ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ ｆｏｒ ２.８％ ｏｆ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ
ｍａｔｅｒｉａｌｓ. Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎꎬ ｏｕｒ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｙｂｅａｎ ｐｒｏ￣
ｄｕｃｉｎｇ ａｒｅａｓ ｉｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｓｏｙｂｅａｎ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｗｉｌｔꎻ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍꎻ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙꎻ ＲＡＰＤ ａｎａｌｙｓｉｓꎻ ｌｉｎｅꎻ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
　
植物病理学报 ４５卷
中图分类号: Ｓ４３２.４４　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０２￣０１６７￣０８
　 　 大豆枯萎病是大豆生产上的主要病害之一ꎬ在
大豆整个生育期均可发生[１]ꎬ发病植株表现为叶片
萎蔫、植株矮化、结荚少ꎬ最终植株死亡[２]ꎬ从而影响
大豆产量和品质ꎮ 该病害在我国各大豆产区发生日
趋严重ꎬ已成为我国大豆生产上的一种严重病害ꎮ
　 　 防治大豆枯萎病最经济有效的方法是选育和
合理使用抗病品种ꎮ 品种抗病性鉴定ꎬ不仅可为抗
病育种提供抗源或亲本材料ꎬ还可为生产上不同抗
病栽培品种的合理布局提供依据[３ꎬ４]ꎮ 由于尖孢
镰孢菌是一个遗传多变的物种ꎬ其种内形态和生理
变异大ꎬ种下专化型繁多ꎬ且与植物相互作用关系
十分复杂ꎬ因此不少尖孢镰孢菌专化型的研究相当
困难ꎬ研究进展缓慢ꎮ 对尖孢镰孢菌种下不同专化
型遗传多样性进行研究ꎬ明确群体遗传结构特点、
演化过程及影响因素、致病性特征ꎬ可为抗性品种
的改良提供信息[５ꎬ６]ꎬ也可为病原菌引起的病害进
行综合防治提供参考ꎮ 随机扩增多态性 ＤＮＡ
( ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡꎬＲＡＰＤ)是建
立于 ＰＣＲ基础之上的分子标记技术ꎬ具有简便、灵
敏、多态性较好等特点ꎬ该技术广泛应用于生物多
样性分析ꎬ也应用于真菌种间亲缘关系及种内不同
来源群体遗传多样性和生理小种鉴别等研究[７~９]ꎮ
　 　 关于大豆品种资源的抗性鉴定ꎬ前人己做了大量
的研究工作[１０~１５]ꎬ但是ꎬ关于大豆种质资源对大豆镰
刀枯萎病的抗性筛选研究非常少ꎮ 大豆尖孢镰孢菌
菌株对大豆致病力是否有分化ꎬ不同大豆品种抗性是
否有差异ꎬ目前均不清楚ꎮ 这些严重阻碍了大豆抗枯
萎病育种ꎬ因此明确大豆种质对枯萎病的抗性对于挖
掘抗病品种资源、提高抗病育种水平具有重要意义ꎮ
　 　 本研究通过 ＲＡＰＤ 技术对大豆尖孢镰孢菌进
行遗传多样性研究ꎬ初步了解了我国大豆枯萎病菌
的群体遗传结构ꎬ并通过人工接种和鉴定ꎬ明确了
不同大豆品种对枯萎病的抗、感性ꎬ研究结果为针
对尖孢镰孢菌群体特点制定有效的育种策略、抗病
品种的合理布局提供了参考ꎬ为控制该病害的流行
提供了试验依据ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 供试分离物和大豆品种
　 　 供试分离物:本课题组从我国不同地区大豆枯
萎病病株上分离纯化的尖孢镰孢菌ꎬ共 ５５ 株(部
分分离物由东北农业大学文景芝教授和中国农科
院作物所的朱振东研究员惠赠)ꎮ 通过致病性测
定ꎬ选取不同大豆产区的分离物 ＦＯ￣１、ＦＯ￣２１ 和
ＦＯ￣１００２致病力均较强ꎬ具有一定毒力代表性(表
１)ꎬ用于抗性鉴定ꎮ
　 　 供试大豆材料:我国部分大豆产区主栽品种及
新育成品种或品系ꎬ共 １８０份ꎮ
Ｔａｂｌｅ １　 Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｐｏｒｕｍ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｕｓｅｄ ｉｎ
ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ
Ｉｓｏｌａｔｅ ｃｏｄｅ Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｓｏｕｒｃｅ
１－１１ Ｊｉａｎｇｓｕ
１２－３３ Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ
３４－３９ Ｓｈａｎｄｏｎｇ
４０－４６ Ｆｕｊｉａｎ
４７－５２ Ａｎｈｕｉ
５３－５５ Ｈｅｎａｎ
Ｎｏｔｅ: Ｔｈｅ ｃｏｄｅ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅ ＦＯ￣１ꎬ ＦＯ￣２１ ａｎｄ ＦＯ￣１００２ ｉｓ １２ꎬ
１３ ａｎｄ ４０ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
１.２　 分离物 ＤＮＡ提取
　 　 将纯化的分离物接种到固体 ＰＤＡ培养基平板
上ꎬ在 ２５℃、光照条件下培养ꎬ待菌落生长到直径
２~３ ｃｍꎬ从菌落边缘切取 １０ ~ ２０ 块 １ ｍｍ×１ ｍｍ
大小的菌丝块ꎬ置于盛有 １５ ｍＬ 液体 ＰＤＢ 培养基
的培养皿中ꎬ２５°Ｃ、黑暗静置培养 ３~５ ｄꎬ滤纸过滤
收集菌丝体供 ＤＮＡ提取ꎮ ＤＮＡ提取参照 Ｒｉｓｔａｉｎｏ
等[１６]方法稍加改进ꎮ 将菌丝体加石英砂在液氮中
充分研磨获菌丝粉ꎮ 取少量菌丝粉置于 １.５ ｍＬ的
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 管中ꎬ加 ９００ μＬ ２％ ＣＴＡＢ 提取液ꎬ９０
μＬ １０％ ＳＤＳꎬ漩涡混匀ꎬ于 ６０°Ｃ水浴 １ ｈꎬ期间每
１０ ｍｉｎ上下颠倒几次ꎮ １２ ０００ ｒｐｍ离心 １０ ｍｉｎꎬ取
上清ꎬ加等体积酚 /氯仿 /异戊醇(２５ ∶ ２４ ∶ １)ꎬ颠
倒混匀ꎬ１２ ０００ ｒｐｍ离心 １０ ｍｉｎꎬ将上清液移至新
管ꎬ加等体积氯仿ꎬ轻轻颠倒混匀ꎬ１２ ０００ ｒｐｍ离心
５ ｍｉｎꎮ 将上清转移至新管中ꎬ加 ２ 倍体积的无水
乙醇和 １ / １０ 体积的 ３ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＮａＡｃ( ｐＨ ５.２)ꎬ
－２０℃沉淀(>１ ｈ)ꎮ １２ ０００ ｒｐｍ离心 １０ ｍｉｎꎬ倾去
８６１
　
　 ２期 王健生ꎬ等:大豆枯萎病菌尖孢镰孢遗传多样性及大豆品种抗性
上清ꎬ沉淀用 ７０％乙醇洗涤两次ꎬ室温晾干ꎮ 加适
量灭菌超纯水或 ＴＥ(ｐＨ ８.０)溶解沉淀(含 ２０ μｇ
􀅰ｍＬ－１ ＲＮａｓｅ)ꎬ３７°Ｃ处理 １ ｈꎬ利用紫外分光光度
计测量 ＯＤ２６０值ꎬ－２０°Ｃ保存备用ꎮ
１.３　 ＲＡＰＤ ＰＣＲ扩增
　 　 ＰＣＲ 反应混合液总体积为 ２５ μＬꎬ包括:１０×
ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２.５ μＬꎬ２５ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＭｇＣｌ２ １.５ μＬꎬ
２.５ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ｄＮＴＰ １. ０ μＬꎬ引物 ( ２０ μｍｏｌ􀅰
Ｌ－１)１. ０ μＬꎬＴａｑ ＤＮＡ 聚合酶 ０. ２５ μＬ ( ５ Ｕ􀅰
μＬ－１)ꎬ模板 ＤＮＡ ２ μＬ(１０ ｎｇ􀅰ｍＬ－１)ꎬ用灭菌水
补足体积ꎮ 所有试剂均购于 ＴａＫａＲａ公司ꎮ
　 　 ＰＣＲ扩增反应在 ＴａＫａＲａ ＰＣＲ扩增仪上进行ꎬ
反应程序为:９４°Ｃ 预变性 ５ ｍｉｎꎻ９４°Ｃ 变性 ３０ ｓꎬ
３６°Ｃ退火 ３０ ｓꎬ７２°Ｃ延伸 ３０ ｓꎬ共 ４５个循环ꎻ最后
７２°Ｃ延伸 １０ ｍｉｎꎮ 取 ５ μＬ扩增产物于 １.５％琼脂
糖凝胶中电泳(电压 ５ Ｖ􀅰ｃｍ－１)ꎬ在凝胶成像系统
上检测并拍照ꎮ
　 　 ＲＡＰＤ ＰＣＲ扩增采用上海生工公司生产的随
机引物ꎮ 经初筛后ꎬ选取扩增结果清晰、多态性丰
富的引物用于不同来源分离物的 ＰＣＲ扩增ꎮ
１.４　 数据统计分析
　 　 对琼脂糖凝胶电泳图谱进行记录ꎬ在相同位置
出现条带的记为 １ꎬ无条带的记为 ０ꎮ 为反映
ＲＡＰＤ标记的多态性ꎬ统计各引物的多态条带百分
率ꎮ 聚类分析时ꎬ对 ０ ~ １ 数据数量化处理ꎬ利用
ＳＬＴ＿ＮＴｓｙｓ＿２.１０ｅ 软件构建 ＵＰＧＭＡ( ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ
ｐａｉｒ－ｇｒｏｕｐ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ ａｖｅｒａｇｅｓ)系统树
状图谱ꎬ进行聚类分析[１７]ꎮ
１.５　 分离物致病性分化测定及大豆品种抗性鉴定
　 　 采用蘸根接种法对选择的 ２０ 个分离物
(ＦＯ￣１、 ＦＯ￣２１、 ＦＯ￣２３、 ＦＯ￣１００２、 ＦＯ￣１００６、 ＦＯ￣
１００７、 ＦＯ￣１００８、 ＦＯ￣１００９、 ＦＯ￣１０１０、 ＦＯ￣１０１５、 ＦＯ￣
１０１９、ＤＡＦ￣３１、ＤＡＦ￣３３、ＤＡＦ￣２２３、 ＦＪＡＴ￣８、 ＪＩＳＧＦ￣
１、ＪＩＦＧＳ￣３、ＨＬＪ￣１１、ＳＦＴ￣１４ 和 ＢＳ￣１０１７)进行致病
性测定ꎮ 将 ８ 个大豆品种(５Ｓ０１４、ＮＹ５６￣２９、南豆
１２、南豆 １６、南豆 ２０、长农 ２４、介交 ２０１１和父 １２９)
穴播 ６~７粒在装有蛭石土的花盆中ꎬ温室培养 ７ ｄ
后(苗高 ２０ ｃｍ 左右)蘸根接种法接种ꎮ 方法如
下:将大豆植株轻轻拔起后ꎬ将幼苗根部用清水洗
净ꎬ用刀片在待接种的幼苗根系一侧将植株的部分
根毛切断ꎬ给根系造成机械伤害ꎬ然后浸入特定浓
度(１×１０６个􀅰ｍＬ－１)的孢子悬浮液中浸泡ꎮ ３~ ５ ｄ
后观察结果ꎮ 每处理均设 ３株清水对照ꎮ
　 　 １８０ 个大豆品种(系)对分离物 ＦＯ￣１、ＦＯ￣２１
和 ＦＯ￣１００２的抗性鉴定方法同致病性测定方法ꎮ
　 　 抗性评价标准[１８]ꎬ０ 级:全株无病症ꎻ１ 级:全
株 １ / ３以下叶片变黄卷缩或萎蔫ꎻ２ 级:全株 １ / ３ ~
１ / ２叶片变黄卷缩或萎蔫ꎬ植株略矮ꎻ３ 级:全株 １ /
２~３ / ４叶片变黄卷缩或萎蔫ꎬ叶片脱落ꎬ茎秆大部
分变褐ꎬ植株明显变矮ꎻ４级:全株叶片变黄卷曲或
萎蔫ꎬ叶片脱落ꎬ茎秆变褐枯死ꎮ
　 　 发病级别为 ０级的为抗病(Ｒ)ꎬ发病级别在 １、
２级的为中抗(ＭＲ)ꎬ发病级别在 ３、４ 级的为感病
(Ｓ)ꎮ 抗病和中抗均进行 ３次重复鉴定ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 ＲＡＰＤ扩增引物筛选
　 　 对来自我国不同地区的 １０株大豆枯萎病病原
菌尖孢镰孢菌的基因组 ＤＮＡ 进行 ＲＡＰＤ 扩增分
析ꎬ从 １００条随机引物中筛选出 １０ 条扩增多态性
好且稳定的随机引物(表 ２)ꎮ 进一步利用这 １０ 条
引物在 ５５个分离物中进行扩增ꎬ结果发现扩增的
ＤＮＡ片段大小变化范围为 １５０ ~ ２ ０００ ｂｐꎬ共获得
７５ 个 ＲＡＰＤ 标记ꎬ其中多态性标记 ５５ 个ꎬ占
７３.３％ꎬ不同引物扩增的多态性条带数为 ５ ~ ７ 条
(图 １和表 ２)ꎮ
２.２　 ＲＡＰＤ 扩增结果聚类分析
　 　 利用 １０ 条引物对供试的不同大豆产区的 ５５
个大豆尖孢镰孢菌进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ对扩增结果用
ＳＬＴ＿ＮＴｓｙｓ＿２.１０ｅ 软件进行聚类分析ꎬ以遗传相似
系数 ０.６８为阈值ꎬ发现 ５５个供试分离物可划分为
９个遗传聚类组(图 ２)ꎬ表明我国的大豆尖孢镰孢
菌在 ＤＮＡ 水平具有丰富的遗传多样性ꎮ 同时结
果还显示ꎬ大豆尖孢镰孢菌的 ＲＡＰＤ 分组与其的
地理来源之间无明显的相关性ꎮ 在含有多个分离
物的 ８个聚类组中ꎬ除 Ｃ 组均由江苏的分离物构
成外ꎬ其余 ７ 个组(Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ)中都同时由
不同地区的分离物所构成ꎮ 此外ꎬ通过 ＲＡＰＤ 聚
类分析ꎬ同一地理来源的分离物多数被归入不同的
组中:黑龙江省的 ２２ 个分离物被划分在 ６ 个不同
的组内(Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ)ꎬ江苏省的 １１个分离物被
９６１
　
植物病理学报 ４５卷
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｓｃｏｒｅｄ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｏｐｈｉｃ ＲＡＰＤ ｂａｎｄｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ
Ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′￣３′) Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
Ｓ１０７１ ＣＡＧＴＧＴＧＣＴＣ ７ ５
Ｓ１１１４ ＴＧＧＴＴＧＣＧＧＡ ７ ５
Ｓ１２２８ ＧＧＣＴＧＣＣＡＧＴ ８ ７
Ｓ１２８３ ＴＧＴＡＧＣＣＧＴＧ ８ ６
Ｓ１３１３ ＣＴＡＣＧＡＴＧＣＣ ８ ５
Ｓ１３４２ ＴＧＣＧＡＡＧＧＣＴ ８ ６
Ｓ１３８３ ＴＴＡＧＣＧＣＣＣＣ ６ ５
Ｓ１４６８ ＣＴＧＧＣＴＣＡＧＡ ７ ５
Ｓ３７７ ＣＣＣＡＧＣＴＧＴＧ ８ ６
Ｓ４８ ＧＴＧＴＧＣＣＣＣＡ ８ ５
Ｔｏｔａｌ ７５ ５５
　
Ｆｉｇ. １　 ＲＡＰＤ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ｐｒｉｍｅｒｓ Ｓ１４６８ (Ａ) ａｎｄ Ｓ１０７１ (Ｂ)
Ｌａｎｅ Ｍ: ２ ｋｂ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒꎻ Ｌａｎｅｓ １－５５: Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ａｓ ｉｎ Ｔａｂｌｅ １.
划分在 ６个不同的组内(Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ)ꎮ 上述
结果表明ꎬ中国不同地区的大豆枯萎病病原菌发生
了广泛的遗传变异ꎬ局部地域范围内的大豆枯萎病
病原菌群体在遗传进化方向上具有多样性ꎮ
２.３　 分离物致病力分化及品种抗性分化鉴定
　 　 选取 ２０ 株尖孢镰孢菌 对 ８ 个不同大豆品种
的致病力进行测定ꎮ 结果显示:不同的尖孢镰孢菌
对同一大豆品种致病力不同ꎬ而同一株尖孢镰孢菌
对不同大豆品种的致病能力也不同(图 ３)ꎮ 上述
结果表明我国的大豆尖孢镰孢菌具有致病力分化
现象ꎬ我国的大豆资源具有品种抗性分化现象ꎮ
２.４　 大豆品种抗性鉴定
　 　 分离物 ＦＯ￣１、ＦＯ￣２１ 和 ＦＯ￣１００２ 来自我国不
同的大豆产区ꎬ对 １０ 多个大豆品种致病力较强且
稳定ꎬ且在遗传进化方向上具有多样性ꎬ因此具有
很好的代表性ꎮ 为全面了解我国大豆产区的大豆
品种(资源)对大豆枯萎病的抗性情况ꎬ将供试的
１８０个大豆品种对这 ３个分离物进行了抗性鉴定ꎮ
结果显示ꎬ３０ 个品种对分离物 ＦＯ￣１ 表现为抗病ꎬ
２６个品种为中抗ꎬ两者占 ３１％ꎻ２０ 个品种对分离
物 ＦＯ￣２１ 表现为抗病ꎬ２９ 个品种为中抗ꎬ两者占
２７％ꎻ４７ 个品种对分离物 ＦＯ￣１００２ 表现为抗病ꎬ
３６个品种为中抗ꎬ两者占 ４６％ꎮ 对 ＦＯ￣１和 ＦＯ￣２１
同时具有抗性(表现为抗病或中抗)的品种共有
１３个ꎻ对 ＦＯ￣１ 和 ＦＯ￣１００２ 同时具有抗性的共有
２８个ꎻ对 ＦＯ￣２１ 和 ＦＯ￣１００２ 同时具有抗性的共有
２２ 个ꎮ 对 ３ 个分离物同时具有抗性的品种有 ５
个:皖豆 ２８ꎬ中黄 １３ꎬ中黄 ５１ꎬ中作 Ｘ０８０７６ 和
５Ｄ０３４ꎬ占供试材料的２.８％ꎮ此外ꎬ还发现来自我
０７１
　
　 ２期 王健生ꎬ等:大豆枯萎病菌尖孢镰孢遗传多样性及大豆品种抗性
Ｆｉｇ. ２　 Ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｓｔｅｄ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｏｎ ５５ ＲＡＰＤ ｍａｒｋｅｒｓ
Ｆｉｇ. ３　 Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｓｔｅｄ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ
ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｙｂｅａｎ ｌｉｎｅｓ
１７１
　
植物病理学报 ４５卷
Ｆｉｇ. ４　 Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ｍｏｄｅｒａｔｅ ｏｒ ｈｉｇｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ
ＮＡＵ: Ｎａｎｊｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎻＣＡＳ: Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ ＳｃｉｅｎｃｅｓꎻＣＡＡＳ: Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ.
国不同省份大豆产区和种质资源库的大豆品种对
分离物 ＦＯ￣１、ＦＯ￣２１ 和 ＦＯ￣１００２ 的抗性比例各不
相同ꎮ 抗性材料所占比例均很低ꎬ中抗材料占供试
品种的比例最高仅为 １１.１％ꎬ其中河南省、江苏省、
安徽省、山西省和中国科学院(中科院)的抗枯萎
病大豆品种不到 ２％ꎮ 吉林省、河北省、山东省、浙
江省、南农大豆中心(南农)和中国农业科学院(农
科院)的大豆品种抗性材料比例相对较高ꎬ中抗比
例最高为 １１.１％(图 ４)ꎮ 该结果为大豆抗病育种
及指导品种合理布局提供了重要参考ꎮ
３　 讨论
　 　 ＲＡＰＤ技术是分析生物遗传多样性的一种十
分有效的手段ꎮ 本研究采用该方法对采自黑龙江、
山东、河南、江苏、安徽和福建六省的 ５５ 株大豆枯
萎病病原菌进行遗传多样性分析ꎬ发现供试分离物
具有丰富的遗传多样性ꎬ多态性检测率为７３.３％ꎮ
结合遗传距离的聚类图分析ꎬ这些分离物按照不同
的相似率可划分为不同的遗传聚类组ꎬ在 ＤＮＡ 水
平上证明了大豆枯萎病病原菌具有丰富的种内遗
传多态性ꎮ 从分离物来源区域来看ꎬ分离物的遗传
聚类组与区域来源间没有直接关系ꎬ即同一大豆产
区内分离物的遗传背景存在差异ꎬ不同大豆产区的
分离物也可划分为同一遗传聚类组ꎮ 这一研究结果
与 Ｃａｏ等[１９]对不同地区枯萎病病原菌研究结论一
致ꎮ 可见ꎬ我国的大豆枯萎病病原菌群体的遗传背
景已呈现复杂化和多态性ꎬ这可能与多年来不同抗
病品种的推广、环境变化及田间的耕作制度有关ꎬ从
而导致病原菌不断变异ꎬ小种多样性增加ꎮ
　 　 致病力分化和品种抗性分化结果表明ꎬ我国的
大豆枯萎病菌具有明显的致病力分化现象ꎬ同时我
国的大豆资源具有品种抗性分化现象ꎮ 品种抗性
鉴定结果表明ꎬ我国不同大豆产区主栽品种及新育
品种共 １８０个品种中ꎬ对 ３株来自不同区域的大豆
枯萎病菌同时具有抗性的品种有 ５ 份:皖豆 ２８、中
黄 １３、中黄 ５１、中作 Ｘ０８０７６和 ５Ｄ０３４ꎬ占供试材料
的 ２.８％ꎬ抗性品种所占比例小ꎮ 原因可能是由于
枯萎病病原菌生理小种不断发生变化ꎬ从而出现许
多新的致病类型ꎬ早期鉴定的抗性种质材料随时间
的推移抗性可能丧失ꎮ 因此ꎬ建立大豆枯萎病病原
菌生理小种长期监测机制ꎬ有利于科学鉴定与评价
大豆品系对大豆枯萎病的抗性ꎮ 同时ꎬ筛选、创造、
利用高抗抗源有助于大豆抗枯萎病育种ꎮ 从生产实
际需要来看ꎬ今后在抗病育种工作中既要保持对枯
萎病抗性的稳定ꎬ又要提高对枯萎病的抗性ꎬ使两者
结合起来ꎮ 此外ꎬ不同产区大豆种质对枯萎病的抗
性不同ꎬ吉林省、河北省、山东省和浙江省的主栽大
豆品种抗性材料比例相对较高ꎬ这可能与近几年这
些地区抗性品种的布局及当地病原菌群体相关ꎮ
　 　 抗病性鉴定是抗病育种的主要环节ꎬ建立准确
可靠的抗病性鉴定方法是提高抗病育种效率的重
要途径ꎮ 抗病性鉴定结果受植物和病原菌、温度和
２７１
　
　 ２期 王健生ꎬ等:大豆枯萎病菌尖孢镰孢遗传多样性及大豆品种抗性
湿度、接种方法和评价标准以及人为因素等多方面
的影响ꎮ 温室接种与大田试验存在很大差别ꎮ 温
室接种注重田间小气候ꎬ特别是在接种初期的湿度
和温度控制ꎬ有利于病害的发生ꎬ因而对抗性接种
鉴定影响很大ꎮ 这也可能是温室条件下抗性资源
比例小的重要原因之一ꎮ 因此ꎬ为了使鉴定结果更
加准确可靠ꎬ必须把温室和田间试验相结合ꎬ对在温
室条件下表现为中抗的材料在田间进行进一步试
验ꎬ最终筛选出可以在田间推广种植的抗性种质资
源ꎮ 对于镰孢菌引起的土传病害抗病性鉴定时ꎬ还
必须有正确的病情记载方法和病情分级标准ꎬ但目
前关于镰孢菌引起的作物枯萎病的病情分级方面ꎬ
在不少作物上还没有统一的标准ꎬ这需要进一步研
究ꎮ 此外ꎬ鉴定出的抗病材料并不是都具有较好的
农艺性状ꎬ有些材料也存在丰产性和品质等方面的
缺陷ꎬ因而也不能在生产中种植和推广ꎮ 所以ꎬ合理
利用这一部分材料ꎬ与主栽品种进行多次回交转育ꎬ
可望培育出具有较好农艺性状的抗病材料ꎮ
　 　 致谢:感谢东北农业大学文景芝教授和中国农
科院作物所的朱振东研究员提供了部分大豆尖孢
镰孢菌ꎻ感谢国内大豆产业技术体系的一些专家提
供了大豆品种(种质资源)ꎮ
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(Ｂ０８): ７４－７９.
责任编辑:李晖
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