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文章编号：1001-8689(2016)11-0829-05
越南槐内生真菌TRPH-21的抗菌活性及其鉴定
姚裕群1,2 桂雄1 黄荣韶2 李良波2,*
(1 广西科技大学医学院，柳州 545005；2 广西大学农学院，南宁 530004)
摘要：目的 为新型抗生素的研究提供有价值的菌种资源。方法 以2株病原细菌大肠埃希菌ATCC25922和产肠毒素性大
肠埃希菌多重耐药临床分离株为靶标菌，采用琼脂块法和改良的微量肉汤稀释法测定越南槐内生真菌TRPH-21的抗菌活性；根
据形态和分子特征鉴定该菌株的分类学地位。结果 该菌株的活菌块对大肠埃希菌ATCC25922的抑菌圈直径比阳性对照大；
其代谢产物对2株病原细菌的最小抑菌浓度均为16μg/mL，仅为阳性对照的16倍；初步鉴定该菌株为尖孢镰孢菌。结论 菌株
TRPH-21鉴定为尖孢镰孢菌，对参试病原细菌均显示强的抗菌活性，具有较大的开发应用潜力。
关键词：越南槐；内生真菌；抗菌活性；抑菌圈；最小抑菌浓度；尖孢镰孢菌
中图分类号：R978 文献标志码：A
Antibacterial activities and taxonomic identifi cation of endophytic fungus
TRPH-21 isolated from Sophora tonkinensis Gapnep
Yao Yu-qun1,2, Gui Xiong1, Huang Rong-shao2 and Li Liang-bo2
(1 School of Medicine, Guangxi University of Science and Technology, Liuzhou 545005;
2 Guangxi University, College of Agriculture, Nanning 530004)
Abstract Objective To provide a valuable strain resource for the research of novel antibiotics. Methods
The in vitro antibacterial activity of endophytic fungus TRPH-21 isolated from Sophora tonkinensis Gapnep against
two pathogenic bacteria including Escherichia coli ATCC25922 and multidrug-resistant enterotoxigenic E. coli
in clinical was evaluated using the agar plug method and modified broth microdilution method; the taxonomic
identifi catio n of this strain was based on morphological characters and molecular characters. Results The diameter
of the inhibition zone from the mycelial plug of this strain against E. coli ATCC25922 was greater than that of the
positive control. The minimal inhibitory concentration values of the metabolites from this strain against pathogenic
E. coli ATCC25922 and enterotoxigenic E. coli were both 16μg/mL and were sixteen times higher than that of the
positive control. This strain was preliminarily named as Fusarium oxysporum. Conclusion Strain TRPH-21 was
preliminarily identifi ed as F. oxysporum and exhibited strong antibacterial activity against pathogenic bacteria E. coli
ATCC25922 and enterotoxigenic E. coli. It should be an interesting isolate for further exploration and utilization.
Key words Sophora tonkinensis Gapnep; Endophytic fungus; Antibacterial activity; Inhibition zone; Minimal
inhibitory concentration; Fusarium oxysporum
收稿日期：2016-06-06
基金项目：广西自然科学基金项目(No. 2015GXNSFAA139091)
作者简介：姚裕群，女，生于1979年，在读博士研究生，讲师，主要从事药用植物内生真菌资源与利用研究。E-mail: yaoyuqun2005@126.com
*通讯作者，E-mail: llb100@126.com
中国抗生素杂志2016年11月第41卷第11期
大肠埃希菌是革兰阴性无芽孢杆菌，也是人和
温血动物重要的条件性致病菌。致病性大肠埃希菌
能引起严重的呕吐腹泻、新生儿脑膜炎、腹腔感染
及菌血症，是尿路感染、新生儿败血症以及院内感
染的主要病因，持续威胁着幼儿、妇女、老人以及
免疫力低下个体的健康[1]。疫苗和抗生素是防治大
微生物药物筛选
DOI:10.13461/j.cnki.cja.005804
. 830 .
肠埃希菌的重要措施，但因大肠埃希菌具有易变异
和多种血清型的特点[2]，疫苗不能满足对该菌的防
治要求，所以抗生素在防治大肠埃希菌方面有着不
可替代的作用。但是随着抗生素在临床治疗中的广
泛、持续及大量使用，大肠埃希菌出现了严重的耐
药甚至多重耐药现象[3]。因此，为了公共卫生安全，
急需研制新型抗生素。近10年来，源于药用植物的
新型抗菌物质日益减少，人们把目光投向了药用植
物内生真菌。内生真菌和植物长期互惠共生、协调
发展，其次生代谢产物具有多样性、独特性、丰富
性，从中容易发现结构新颖、生物学活性多样的化
合物[4-5]。许多源于药用植物内生真菌的次生代谢产物
被鉴定出具有抗菌[6]、杀虫[7]、抗肿瘤[8]、抗氧化[9]、
抗HIV[10]以及酶抑制剂[11]等多种生物学活性。药用植
物内生真菌所产生的新颖抗菌物质可为新型抗菌药
物的发现提供重要的先导化合物和新的药物作用靶
点[12]。本研究以大肠埃希菌ATCC25922和产肠毒素
性大肠埃希菌多重耐药临床分离株为靶标菌，首次
从药用植物越南槐内生真菌中筛选鉴定拮抗菌，以
期为新型抗菌物质的研究提供有价值的菌株资源。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
筛选菌株，2014年6月自广西野生越南槐的健
康根中分离的238株内生真菌，保存在广西大学
农学院；测试菌株，大肠埃希菌Escherichia coli
ATCC25922，购自美国菌种保存库(ATCC)，产肠毒
素性大肠埃希菌(ETEC)临床分离株，自急诊腹泻患
者的新鲜粪便分离并经Bio-Merieux细菌生化鉴定条
AP120E生化鉴定及PCR基因鉴定，对氨苄西林、替
卡西林、环丙沙星耐药，对头孢西丁、头孢噻肟、
头孢吡肟敏感，保存在广西科技大学医学院。
1.1.2 培养基
PDA培养基，购自广东环凯微生物科技有限公
司；MHA培养基、 MH肉汤，均购自北京陆桥生物
技术有限公司。所有培养基在121℃，1×105 Pa下湿
热灭菌25min备用。
1.1.3 主要试剂
头孢西丁、刃天青，均购自中国食品药品检定
研究院；2×Taq Master Mix，购自北京康为世纪生
物科技有限公司；引物ITS1和ITS4，由华大基因合
成；甲醇、二甲基亚砜(DMSO)等试剂，均为市售分
析纯产品。
1.1.4 仪器与设备
生物安全柜，Thermo 1381；立式压力蒸汽灭菌
器，上海博讯YXQ-LS-100SII；恒温培养箱，上海
福玛DPX-9082B-2；旋转蒸发仪，Heidolph G3；奥
林巴斯生物光学显微镜，OLYMPUS CX21；PCR扩
增仪，BIO-RAD C1000；凝胶成像系统，Bio-Best
200E；电泳仪，DYY-6C。
1.2 菌株活菌体对大肠埃希菌的拮抗活性筛选
如图1所示，采用琼脂块法[13]筛选供试内生真菌
活菌体对大肠埃希菌的拮抗活性。将大肠埃希菌制
成含106cfu/mL接种物的MHA筛选平板并将6mm直径
的内生真菌菌块接入筛选平板，每皿接5个菌块，阳
性对照为含6μg头孢西丁的等径琼脂块，所有平板置
于(35±2)℃培养16~18h后，观察菌块或阳性对照周
围有无抑菌圈，并测量抑菌圈的直径。
1.3 菌株代谢产物对大肠埃希菌的拮抗活性
1.3.1 菌株的发酵和发酵产物的提取
将菌株接种于无菌固体培养基(400g马铃薯、
20g右旋糖和20g蔗糖)并于28℃黑暗发酵30d；发酵
完成后，用超声波辅助甲醇提取发酵物，纱布过
滤，重复两次，合并两次滤液进行减压浓缩成浸
膏，用水 悬浮并用乙酸乙酯萃取得有机相，减 压浓
缩有机相得到菌株代谢产物。
1.3.2 菌株代谢产物对大肠埃希菌的最小抑菌浓度
(MIC)
参照CLSI M07-A9和Sarker的研究[14]，用改良的
肉汤稀释法测定菌株代谢产物对大肠埃希菌的最小
抑菌浓度。测试在无菌的U型底的96孔培养板进行，
测试体积为0.1mL，测试培养基为MH肉汤，接种菌
分别为E. coli ATCC25922和ETEC，测试终浓度为
5×105cfu/mL，所有处理和对照进行两倍系列稀释。
1% DMSO溶解的代谢产物为处理，测试终浓度范围
为1~2048μg/mL；头孢西丁为阳性对照，测试终浓度
范围为0.25~512μg/mL；DMSO为生长对照，测试终
浓度范围为0.00048%~1%；以不接菌的代谢产物系列
稀释浓度列为无菌对照；所有测试重复3次。培养板
置于(35±2)℃培养16h后，10μL 1mg/mL的刃天青溶
液加入每孔，(35±2)℃继续培养4h后观察颜色的变
化，蓝色或紫色指示接种菌完全被抑制，紫红色指示
接种菌部分被抑制，粉红色指示接种菌生长。最小抑
菌浓度为完全抑制接种菌生长的最低药物浓度。
1.4 菌株的鉴定
真菌的分类基于3个准则：形态特征，系统发育
越南槐内生真菌TRPH-21的抗菌活性及其鉴定 姚裕群等
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地位以及与GenBank中参考序列的相似性。当一个特
定序列与系统发育相关的参考序列之间的相似性，
大于95%则被认为是同属，而明显高于属内其它种
时，则被认为是同种[15-16]。
1.4.1 菌株形态特征
将待鉴定菌株接种在PDA培养基上，置于28℃
培养，观察其菌落形态，并在光学显微镜下观察其
孢子形态。
1.4.2 菌株ITS序列及其系统发育学分析
参照Guo的方法提取真菌基因DNA[17]，参照
White的研究，用通用引物ITS1和ITS4从真菌基因组
DNA扩增ITS序列[18]，PCR产物的纯化和测序由华
大基因进行，将所测的ITS序列与GenBank基因库中
已测定真菌的ITS序列进行比对，根据比对结果下载
相似性高的菌株序列，以近缘属菌株为外群，通过
MEGA 6.0的邻接算法(Neighbor-joining NJ)，自展数
(Bootstrap)为1000构建系统进化树，用MatGAT v.2.01
计算序列间的相似性。
2 结果与分析
2.1 菌株活菌体对大肠埃希菌的拮抗活性筛选
以E. coli ATCC25922为靶标菌，对238株越南槐
内生真菌进行活菌体的拮抗活性测定，结果20株有
抑菌圈，5株的抑菌圈直径大于或等于阳性对照，其
中菌株TRPH-21的抑菌圈直径最大，其测定结果如
图1及表1所示，其活菌块对E. coli ATCC25922的抑菌
圈直径大于6μg头孢西丁阳性对照，表明该菌株活菌
体对大肠埃希菌具有非常显著的抑制作用，因此，
确定其为潜在的活性菌株，进一步测定其代谢产物
的抑菌作用。
2.2 菌株代谢产物对大肠埃希菌的最小抑菌浓度(MIC)
测试中，无菌对照孔显紫色，表明培养板没有
被杂菌污染；生长对照孔显粉红色，表明代谢产物
的溶剂，即0.00048%~1% DMSO不抑制测试病原细
菌生长，处理可正确反映代谢产物的抑菌活性；阳
性对照头孢西丁的最小抑菌浓度为1μg/mL，表明
测试菌对阳性对照敏感，测试菌株在质量控制范围
内；处理中，菌株TRPH-21的 代谢产物在8μg/mL
时，部分抑制ETEC的生长，在16μg/mL时，完全抑
制E. coli ATCC25922和ETEC的生长。最小抑菌浓度
为完全抑制接种菌生长的最低药物浓度，如表2所
示，菌株TRPH-21的代谢产物对E. coli ATCC25922和
ETEC的最小抑菌浓度均为16μg/mL，仅为阳性对照
头孢西丁的16倍。测试结果表明，菌株TRPH-21的
代谢产物对E. coli ATCC25922和ETEC均具有很强的
抑制作用。
2.3 菌株的鉴定
2.3.1 菌株形态特征
如图2所示，菌株TRPH-21在PDA培养基上培
养3d后，菌落直径为5.3~5.5cm，菌落圆形，略有
轮纹，边缘透明放射状生长，气生菌丝白色至淡
紫色，生长致密，棉絮状，有紫红色色素分泌；光
学显微镜下，小型分生孢子椭圆型或卵型，孢子
大小为(2.50~3.75)μm×(7.5~10.63)μm，大型分
生孢子镰刀型，两端尖，3~5分隔，孢子大小为
图1 用琼脂块法筛选菌株TRPH-21对大肠埃希菌的拮抗活性
Fig. 1 The antagonistic activity of the strain TRPH-21 against E.
coli using the agar block testing
表1 菌株TRPH-2的活菌块对大肠埃希菌ATCC25922的抑菌圈
Tab. 1 The inhibition zone of the mycelial plug from strain
TRPH-21 against E. coli
处理 病原菌 抑菌圈直径 /mm
6 μg 头孢西丁 E. coli ATCC25922 14
TRPH-21菌块 E. coli ATCC25922 19
表2 菌株TRPH-21的代谢产物对大肠埃希菌的最小抑菌浓度
Tab. 2 The minimal inhibitory concentration (MIC) of the
metabolites from strain TRPH-21 against E. coli
处理
MIC/(μg/mL)
E.c oli ATCC25922 ETEC
头孢西丁 1 1
TRPH-21代谢产物 16 16
注：a:菌落形态，b:分生孢子形态(×400)
图2 株系TRPH-21在PDA培养基上的形态
Fig. 2 Morphology of strain TRPH-21 in PDA medium
TRPH-21
10μm
a b
cefoxitin
中国抗生素杂志2016年11月第41卷第11期
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(3.75~5.00)μm×(21.25~31.88)μm，该菌株在PDA培
养基上的菌落形态及孢子形态特征符合相关文献对
尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)的描述[19-20]。
2.3.2 菌株ITS序列及其系统发育学分析
从菌株TRPH-21获得ITS序列(450bp)，基因登录
号为KT935175。在基于ITS序列构建的系统进化树
(图3)中，菌株TRPH-21与尖孢镰孢菌(KR708632)聚
在一起形成支持强度为100%的末端分支。碱基相似
性比较显示，该菌株与尖孢镰孢菌(KR708632)的碱
基序列没有差异，序列相似性为100%。因此，综合
形态学和分子生物学特征，将菌株初步鉴定为尖孢
镰孢菌。
3 讨论
根据目前的研究，尖孢镰孢菌有致病株和非致
病株。致病性尖孢镰孢菌是一种重要的植物病原真
菌，是引起多种农作物枯萎病[21]、根腐病[22]的主要
病原。而非致病性尖孢镰孢菌则可以防治由致病性
尖孢镰孢菌[23]或其它病原真菌[24]引起的病害，其多
为内生真菌。到目前为止，从尖孢镰孢菌的发酵物
中，分离得到两个新的C型伏马菌素(fumonisins)[25]，
一个新的抗真菌化合物(oxysporidinone)[26]，一个具
抗肿瘤活性的鬼臼毒素(podophyllotoxin)[27]，一个具
抗氧化活性的多糖(polysaccharides)[28]，但未见有抗
细菌活性化合物被分离的报道。来自于内生真菌的
非致病性尖孢镰孢菌可以抑制致病性大肠埃希菌的
研究鲜有报道。一株来自于伊犁贝母的内生尖孢镰
孢菌在SDA培养基上培养时具有分泌抑菌活性物质
的能力，其乙酸乙酯浸膏对大肠埃希菌的最小抑菌
浓度为62.5μg/mL。而本研究的越南槐内生尖孢镰孢
菌TRPH-21在PDA培养基上培养时具有分泌抑菌活
性物质的能力，其乙酸乙酯浸膏对致病性大肠埃希
菌ATCC25922和产肠毒素性大肠埃希菌临床分离株
的最小抑菌浓度均为16μg/mL，仅为阳性对照头孢西
丁的16倍，表明本研究的TRPH-21是一株拮抗活性
更强的尖孢镰孢菌。该菌株代谢产物显示了强的抗
菌活性，因此其中的一些化合物可能具有更显著的
抗菌性。大量的研究表明，内生真菌的次级代谢产
物受宿主和培养条件的影响极大[29]。因此，越南槐
内生真菌TRPH-21在本研究的发酵培养下，可能生
成一些结构新颖的抗真菌物质。为此，下一步将扩
大培养该菌株，以抗菌活性为导向，通过各种色谱
手段从中分离化合物，以期获得一些新的或活性强
的抑菌成分，有望为新型抗生素的研发提供重要的
先导化合物和新的药物作用靶点。
参 考 文 献
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图3 用MEGA6.0构建的菌株TRPH-21基于ITS序列的系统进化树
Fig. 3 Phylogenetic tree of strain TRPH-21 generated from the ITS sequences using the software of MEGA version 6.0
0.02
100
90
91
87
77
100
100
100
100
100
Thelonectria trachosa (KF569842)
Thelonectria westlandica (KF569844)
Fusarium solani (KR047066)
Fusarium fujikuroi (LC034164)
Fusarium avenaceum (FJ478097)
Fusarium acuminatum (JX534371)
Fusarium proliferatum (DQ016239)
Fusarium verticillioides (KJ801959)
Fusarium oxysporum (KR708632)
Fusarium langsethiae (AF414969)
Fusarium culmorum (EF187910)
Fusarium graminearum (KP691045)
TRPH-21
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