全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(２): １２１￣１２８(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣０１￣０６ꎻ 修回日期: ２０１３￣１１￣１５
基金项目: 国家质检总局科研项目(２００９ＩＫ２５９)ꎻ 浙江省科技厅重大科技专项重点农业项目(２００９ｃ１２０５４)
通讯作者: 易建平ꎬ研究员ꎬ主要从事检疫性细菌有害生物检测研究ꎻ Ｔｅｌ: ０２１￣３８６２０５７５ꎬ Ｆａｘ: ０２１￣６８５４６４８１ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｙｉｊｐ＠ｓｈｃｉｑ.ｇｏｖ.ｃｎ
第一作者: 叶露飞ꎬ男ꎬ湖北人ꎬ主要从事进境粮谷有害生物检测ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｙｌｆ＠ｚｓ.ｚｉｑ.ｇｏｖ.ｃｎꎮ
进境玉米中玉米内州萎蔫病菌的 ＰＣＲ检测
叶露飞１ꎬ 粟 寒２ꎬ 周国梁３ꎬ 印丽萍３ꎬ 李孝军１ꎬ 杨赛军１ꎬ 易建平３∗
( １舟山出入境检验检疫局ꎬ 浙江 ３１６０００ꎻ ２江苏出入境检验检疫局ꎬ 南京 ２１０００１ꎻ
３上海出入境检验检疫局ꎬ 上海 ２００１３５)
摘要:为了快速准确检测进境玉米样品中的玉米内州萎蔫病菌 Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ. ｎｅｂｒａｓｋｅｎｓｉｓ(Ｃｍｎ)ꎬ根据
ＧｅｎＢａｎｋ中 Ｃｍｎ的 １６Ｓ￣２３Ｓ序列设计引物 ＣＭ１ / ＣＭ４和引物 ＰＳＭ１ / ＣＭ３ꎮ 引物 ＰＳＭ１ / ＣＭ３仅能从供试的 ４株 Ｃｍｎ菌株
中扩增获得 ２０８ ｂｐ的预期产物ꎬ而其他 ３６ 株对照菌株均不能扩增出预期条带ꎮ 灵敏度测试结果表明引物 ＣＭ１ / ＣＭ４ 和
ＰＳＭ１ / ＣＭ３组合的巢式 ＰＣＲ方法的检测灵敏度高于常规 ＰＣＲꎬ检测灵敏度可达 ４０ ｆｇ ＤＮＡ 或 ６.８ ＣＦＵ 目标细菌ꎮ 常规
ＰＣＲ和巢式 ＰＣＲ方法对进境美国玉米样品的阳性检出率分别为 ８％和 ２４％ꎬ试验结果表明所建立的 ＰＣＲ方法可用于玉米
样品中 Ｃｍｎ的快速检测ꎮ
关键词:玉米ꎻ 玉米内州萎蔫病菌ꎻ 检测ꎻ ＰＣＲ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ. ｎｅｂｒａｓｋｅｎｓｉｓ ｉｎ ｉｍｐｏｒｔｅｄ ｃｏｒｎ ｂｙ ＰＣＲ
ＹＥ Ｌｕ￣ｆｅｉ１ꎬ ＳＵ Ｈａｎ２ꎬ ＺＨＯＵ Ｇｕｏ￣ｌｉａｎｇ３ꎬ ＹＩＮ Ｌｉ￣ｐｉｎｇ３ꎬ ＬＩ Ｘｉａｏ￣ｊｕｎ１ꎬ ＹＡＮＧ Ｓａｉ￣ｊｕｎ１ꎬ ＹＩ Ｊｉａｎ￣ｐｉｎｇ３
( １ Ｚｈｏｕｓｈａｎ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕꎬ Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３１６０００ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２Ｊｉａｎｇｓｕ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕꎬ Ｎａｎｊｉｎｇ
２１０００１ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕꎬ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２００１３５ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ＣＭ１ / ＣＭ４ ａｎｄ ＰＳＭ１ / ＣＭ３ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ
Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ. ｎｅｂｒａｓｋｅｎｓｉｓ(Ｃｍｎ) . Ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ＰＳＭ１ / ＣＭ３ ｃｏｕｌｄ ａｍｐｌｉｆｙ ４ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ
Ｃｍｎ ａｎｄ ｇｅｔ ａｎ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ２０８ ｂｐ ｐｒｏｄｕｃｔꎬ ｂｕｔ ｎｏ ｔａｒｇｅｔ ｂａｎｄ ｆｏｒ ｏｔｈｅｒ ３６ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ. Ｔｈｅ ｎｅｓｔｅｄ
ＰＣＲ ｂｙ ｐｒｉｍｅｒｓ ＣＭ１ / ＣＭ４ ａｎｄ ＰＳＭ１ / ＣＭ３ ｃｏｕｌｄ ｄｅｔｅｃｔ ａｓ ｌｏｗ ａｓ ４０ ｆｇ ＤＮＡ ｏｒ ６.８ ＣＦＵ ｂａｃｔｅｒｉａ ｏｆ Ｃｍｎ
ｗｉｔｈ ａ ｂｅｔｔｅｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｈａｎ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｐｒｉｍｅｒｓ ＰＳＭ１ / ＣＭ３. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ １００
ｃｏｒｎ ｓａｍｐｌｅｓ ｉｍｐｏｒｔｅｄ ｆｒｏｍ ＵＳＡ ｓｈｏｗｅｄ ２４％ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｙ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ ａｎｄ ８％ ｆｏｒ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ. Ｔｈｅｓｅ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃｍｎ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒｏｕｔｉｎｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｏｒｔｅｄ ｃｏｒｎ ｓａｍｐｌｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｃｏｒｎꎻ Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ. ｎｅｂｒａｓｋｅｎｓｉｓꎻ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎꎻ ＰＣＲ
中图分类号:Ｓ４３５.１３１ 　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０２￣０１２１￣０８
　 　 玉米内州萎蔫病菌(Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ
ｓｕｂｓｐ. ｎｅｂｒａｓｋｅｎｓｉｓꎬ Ｃｍｎ)又名密执安棒形杆菌内
布拉斯加亚种ꎬ隶属于厚壁菌门 Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓꎬ厚壁菌
纲 Ｆｉｒｍｉｂａｃｔｅｒｉａꎬ棒型杆菌属 Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒꎮ 美国内
布拉斯加州 １９６９年首次报道该病菌引起的玉米内
州萎蔫病 (Ｇｏｓｓ′ ｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｗｉｌｔ ａｎｄ ｌｅａｆ ｂｌｉｇｈｔ ｏｆ
ｃｏｒｎ) [１]ꎬ至 １９７２ 年病害已扩展至邻近 ５ 个州[１]ꎮ
近年来随着转基因品种的推广ꎬ病害蔓延至美国中
西部各州ꎬ包括内布拉斯加州、堪萨斯州、南达科他
州、科罗拉多州、怀俄明州、密歇根州、威斯康星州、
爱荷华州、伊利诺斯州、印第安那州[２]、明尼苏达
州[３]、德科萨斯州[４]及加拿大安大略省、曼尼托巴
省[５]ꎬ成为北美地区玉米生产上的严重病害ꎮ 病
害严重发生时产量损失可达 ５０％[６ꎬ ７]ꎮ
Ｃｍｎ可随种子传播[８] ꎬ而且我国大部分玉米
种植区适合该病害的发生[９] ꎮ 病菌一旦传入定
　
植物病理学报 ４４卷
殖ꎬ容易暴发造成病害流行ꎬ且病害防治难度大ꎮ
我国玉米产量和种植面积均居世界第二ꎬ在国民
经济中占有重要地位ꎮ ２０１１ 年ꎬ我国进口饲用玉
米超过 １００ 万 ｔꎮ 因此ꎬ该病菌传入我国并扩散
传播的潜在风险巨大ꎮ 目前国内外对 Ｃｍｎ 的检
测方法主要包括分离培养、血清学检测和分子生
物学检测等ꎬ分离培养和血清学检测方法耗时较
长且灵敏度低ꎬ分子生物学检测具有快速、准确
和灵敏的特点ꎬ越来越多地应用于有害生物的初
步检测中ꎮ 国内外针对 Ｃｍｎ的分子检测方法ꎬ如
ｒｅｐ￣ＰＣＲ、常规 ＰＣＲ 和实时荧光 ＰＣＲ 等[１０~ １２] ꎬ多
集中于对纯培养细菌的检测ꎬ尚未见进境玉米样
品中 Ｃｍｎ检测的报道ꎮ 本研究根据 ＧｅｎＢａｎｋ 中
Ｃｍ不同亚种及其近似种间 １６Ｓ￣２３Ｓ 序列差异ꎬ
设计了种通用引物 ＣＭ１ / ＣＭ４ 和特异性引物
ＰＳＭ１ / ＣＭ３ꎬ并对近两年收集的江浙沪口岸进境
美国玉米样品进行检测ꎬ以期建立特异、灵敏、快
速和实用的 ＰＣＲ检测方法ꎬ应对口岸对玉米样品
中微量 Ｃｍｎ的检疫需求ꎬ提高病菌检出率ꎬ有效
防止该有害生物传入我国ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 供试玉米样品和菌株
供试玉米样品为美国进境饲用玉米ꎬ进境时间
为 ２０１１年 ７月~２０１２年 ３月ꎬ进境口岸为上海、舟
山和镇江ꎬ共计 １００个样品ꎬ每个样品 ２ ｋｇꎮ
供试菌株共计 ４０株ꎬ包括 ４株 Ｃｍｎꎬ菌株除来
源于 ＡＴＣＣ(Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎꎬ美国
典型菌种保藏中心)和 ＮＣＰＰＢ(Ｔｈｅ ｎａｔｉｏｎａｌ ｃｏｌｌｅｃ￣
ｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａꎬ英国植物病原细菌
保藏中心)外ꎬ宁波、甘肃、天津出入境检验检疫
局ꎬ山西省农科院、云南农业大学和中国检验检疫
科学研究院等单位提供部分试验菌株ꎬ另有 １０ 株
从进境饲用玉米样品上分离的革兰氏阳性菌菌株ꎮ
供试菌株及其来源见表 １ꎮ
１.２　 细菌培养及 ＤＮＡ提取
供试菌株在营养琼脂(ＮＡ)平板上划线ꎬ２８℃
培养 ４８~７２ ｈꎬ无菌水洗脱ꎬ取菌液 １ ｍＬꎬ１２ ０００ ｒ /
ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎꎬ收集菌体ꎬ用植物基因组 ＤＮＡ 提
取试剂盒提取 ＤＮＡ(ＴＩＡＮＧＥＮ ＤＰ３０５)ꎬ用核酸测
定仪测定 ＤＮＡ浓度ꎮ
１.３　 供试引物
根据 ＧｅｎＢａｎｋ中 Ｃｍｎ及其近缘种 １６Ｓ￣２３Ｓ序
列差异ꎬ 分别设计了 Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ
(Ｃｍ)种通用引物 ＣＭ１ / ＣＭ４ 和 Ｃｍｎ 特异性引物
ＰＳＭ１ / ＣＭ３ꎮ 引物序列和扩增片段大小见表 ２ꎮ
引物委托上海生工生物技术服务有限公司合成ꎮ
１.４　 引物特异性检测
用引物 ＰＳＭ１ / ＣＭ３ 分别扩增供试的 ４０ 个菌
株 ＤＮＡꎬ测试其特异性ꎬＰＣＲ试剂均购于上海生工
生物技术服务有限公司ꎮ ＰＣＲ反应体系 ２５ μＬꎬ包
括 ２. ５ μＬ １０ × ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ (Ｍｇ２＋ ｐｌｕｓ)ꎬ ２. ５ μＬ
ｄＮＴＰ(各 ２５０ μｍｏｌ / Ｌ)ꎬ１ μＬ 上下游引物 ( １００
ｐｍｏｌ / Ｌ)ꎬ ２ μＬ 模板 ＤＮＡꎬ １. ５ Ｕ Ｔａｑ 聚合酶
(５ Ｕ / μＬ)ꎬ加水至 ２５ μＬꎮ 反应程序为: ９４℃
３ ｍｉｎꎻ９４℃ ３０ ｓꎬ６３℃ (引物 ＣＭ１ / ＣＭ４ 为 ５５℃)
３０ ｓꎬ７２℃ ３０ ｓꎬ循环 ３５次ꎻ最后 ７２℃ ５ ｍｉｎꎮ 扩增
产物用 １.５％琼脂糖凝胶 １×ＴＡＥ 缓冲液电泳ꎬＥＢ
染色后用凝胶成像系统分析ꎮ
１.５　 引物灵敏度测试
１.５.１ 　 常规 ＰＣＲ 　 取 Ｃｍｎ 菌株 ＡＴＣＣ２７８２２ 的
ＤＮＡ和菌悬液ꎬ调整 ＤＮＡ浓度至 ２０ ｎｇ / μＬꎬ系列
稀释为 ２ ｎｇ / μＬ、２００ ｐｇ / μＬ、２０ ｐｇ / μＬ、２ ｐｇ / μＬꎻ
调整菌悬液浓度至 ３.４×１０８ ＣＦＵ / ｍＬꎬ系列稀释为
３.４×１０７ ＣＦＵ / ｍＬ、３.４×１０６ ＣＦＵ / ｍＬ、３.４×１０５ ＣＦＵ /
ｍＬ、３.４×１０４ ＣＦＵ / ｍＬꎮ 分别取 ２ μＬ ＤＮＡ 和菌悬
液作为 ＰＣＲ 反应模板ꎮ 用引物 ＰＳＭ１ / ＣＭ３ 分别
对以上 ＤＮＡ和菌悬液进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ反应体系、
程序、电泳及成像分析同 １.４ꎮ
１.５.２　 巢式 ＰＣＲ　 取菌株 ＡＴＣＣ２７８２２ 的 ＤＮＡ系
列稀释为 ２ ｐｇ / μＬ、２００ ｆｇ / μＬ、２０ ｆｇ / μＬ、２ ｆｇ / μＬꎬ
菌悬液系列稀释为 ３. ４ × １０５ ＣＦＵ / ｍＬ、３. ４ × １０４
ＣＦＵ / ｍＬ、３.４×１０３ ＣＦＵ / ｍＬ、３.４×１０２ ＣＦＵ / ｍＬꎮ 引
物 ＣＭ１ / ＣＭ４ 和 ＰＳＭ１ / ＣＭ３ 组合的巢式 ＰＣＲ 分
别对系列稀释的菌株 ＤＮＡ 和菌悬液进行扩增ꎮ
第一轮扩增引物 ＣＭ１ / ＣＭ４ꎬ取 ２ μＬ ＤＮＡ或菌悬
液作为 ＰＣＲ 反应模板ꎬ反应程序为 ９４℃ ３ ｍｉｎꎻ
９４℃ ３０ ｓꎬ５５℃ ３０ ｓꎬ７２℃ ４５ ｓꎬ循环 ２５ 次ꎻ最后
７２℃ ５ ｍｉｎꎮ 取第一轮扩增产物 ２ μＬ 作为第二轮
模板ꎬ引物 ＰＳＭ１ / ＣＭ３进行第二轮扩增ꎬ反应程序
为 ９４℃ ３ｍｉｎꎻ９４℃ ３０ ｓꎬ６３℃ ３０ ｓꎬ７２℃ ３０ ｓꎬ循
２２１
　
　 ２期 　 　 叶露飞ꎬ等:进境玉米中玉米内州萎蔫病菌的 ＰＣＲ检测
Ｔａｂｌｅ １　 Ｉｓｏｌａｔｅｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ
Ｉｓｏｌａｔｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｎｏ.
ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ
ＰＳＭ１ / ＣＭ３ ＣＭ１ / ＣＭ４
Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ. ｎｅｂｒａｓｋｅｎｓｅ ＡＴＣＣ２７８２２ ＋ ＋
ＡＴＣＣ２７７９４ ＋ ＋
ＡＴＣＣ２７７９５ａ ＋ ＋
ＮＣＰＰＢ２５７８ｂ ＋ ＋
Ｃ. ｍ. ｓｕｂｓｐ. ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ＡＴＣＣ４４５０ａ － ＋
ＡＴＣＣ１１４５６ｃ － ＋
ＮＣＰＰＢ２９７９ｂ － ＋
Ｃ. ｍ. ｓｕｂｓｐ. ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｓ ＡＴＣＣ１０２５３ｃ － ＋
ＮＣＰＰＢ８３ｂ － ＋
Ｃ. ｍ. ｓｕｂｓｐ. ｓｅｐｅｄｏｎｉｃｕｓ ＣＭ２０ｃ － ＋
ＣＭ３１ｄ － ＋
Ｃ. ｍ. ｓｕｂｓｐ. ｔｅｓｓｅｌｌａｒｉｕｓ ＡＴＣＣ３３５６６ － ＋
ＮＣＰＰＢ３６６５ｂ － ＋
Ｐａｎｔｏｅａ ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ｓｕｂｓｐ. ｓｔｅｗａｒｔｉｉ ＡＴＣＣ２９２３１ － －
ＡＴＣＣ８１９９ － －
ＡＴＣＣ８２００ － －
Ｐ. ｓ. ｓｕｂｓｐ. ｉｎｄｏｌｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ５１７８５ － －
ＡＴＣＣ３５３９６ － －
Ｐ. ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ ＡＴＣＣ３３２４４ － －
Ｐ. ａｎａｎａｔｉｓ ＡＴＣＣ１１５３０ － －
Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｃｃｕｍｆａｃｉｅｎｓ ｐｖ. ｆｌａｃｃｕｍｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ５１８７６ － －
Ｃ. ｆ. ｐｖ. ｂａｓｅｌｌａｅ ＡＴＣＣ ＢＡＡ￣１４３ － －
Ｃ. ｆ. ｐｖ. ｂｅｔｉｃｏｌａ ＡＴＣＣ ＢＡＡ￣１４４ － －
Ｃ. ｆ. ｐｖ. ｏｏｒｔｉｉ ＡＴＣＣ２５２８３ － －
Ｃ. ｆｌａｃｃｕｍｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ２３８２７ － －
Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ ＡＴＣＣ２９８５０ － －
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚｉｃｏｌａ Ｘｏｃ１６ｅ － －
Ｘ. ｏ. ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ ５３ｅ － －
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ ＡＴＣＣ１１３５５ｆ － －
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌａｄｉｏｌｉ ＡＴＣＣ１０８５４ － －
Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ. ８９６６￣１ｇ － －
Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ. ８９６６￣２ｇ － －
８９６６￣５ｇ － －
Ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｓｐｐ. ８９６６￣６ｇ － －
Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｕｓｉｌｌｕｍ ８９６６￣１２ｇ － －
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ １０５７￣９１７ｇ － －
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ. １０５７￣６ｇ － －
Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ. １０５７￣４ｇ － －
Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ. １０５７￣９２２ｇ ＋∗ ＋∗
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ. １０５７￣１２ｇ － －
ａ: ＺＨＡＮＧ Ｈｕｉ￣ｌｉꎬ Ｎｉｎｇｂｏ Ｅｎｔｒｙ￣Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕꎻ ｂ: ＬＩＵ Ｑｉｎꎬ Ｇａｎｓｈｕ Ｅｎｔｒｙ￣Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕꎻ ｃ: ＺＨＡＯ Ｗｅｎ￣ｊｕｎꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅꎻ ｄ: ＷＡＮＧ Ｒｕｉ￣ｘｉａꎬ
Ｓｈａｎｘｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎻ ｅ: ＪＩ Ｇｕａｎｇ￣ｈａｉꎬ Ｙｕｎｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎻ ｆ: ＬＩＵ Ｐｅｎｇꎬ Ｔｉａｎｊｉｎ Ｅｎｔｒｙ￣
Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕꎻ ｇ: Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｉｍｐｏｒｔｅｄ ｃｏｒｎ ｓｅｅｄｓ. “ ＋”: Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅａｃｔｉｏｎꎻ “ ￣”: Ｎｅｇａｔｉｖｅ
ｒｅａｃｔｉｏｎ. “∗”:Ｎｏｎ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ.
３２１
　
植物病理学报 ４４卷
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｔｅｓｔ
Ｐｒｉｍｅｒ
Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ(５′￣３′)
Ｐｏｓｉｔｉｏｎ Ａｍｐｌｉｃｏｎ / ｂｐ
ＣＭ１ ａｔｇｔｇｃａｃｃｔｃｔｃｃｔｃｔｇｔ ３６￣５４ａ ４９７
ＣＭ４ ｃｃｇａｇｇｃｔｔａｔｃｇｃａｇａｔ ５３４￣５１７ａ
ＰＳＭ１ ｃｃｔｔｔｃｃｇｔｃｇｔｃｃｔｔｔｃ ２９７￣３１４ｂ ２０８
ＣＭ３ ｇｃａｔｃｃａｃｃｇｔｔｔｇｃｔｃｔ ４８４￣４６７ａ
ａ:Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ ＤＱ３７４１５４ꎻ ｂ: Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｕ０９３８１.
环 ３５ 次ꎻ最后 ７２℃ ５ ｍｉｎꎮ 反应体系、程序、电泳
及成像分析同 １.４ꎮ
１.６　 玉米样品中细菌 ＤＮＡ提取与 Ｃｍｎ检测
玉米样品混匀ꎬ取 １００ ｇ 加入 ２００ ｍＬ ＰＢＳ 缓
冲液(ｐＨ ７.２)中ꎬ４℃浸泡过夜ꎻ纱布过滤ꎬ滤液静
置 １５ ｍｉｎꎬ上清液 １０ ０００ ｒ / ｍｉｎ离心 ２０ ｍｉｎꎬ１ ｍＬ
ＰＢＳ悬浮沉淀并转入 ＥＰ 管 １２ ０００ ｒ / ｍｉｎ 离心 ５
ｍｉｎꎬ沉淀用植物基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒提取
ＤＮＡ(ＴＩＡＮＧＥＮ ＤＰ３０５)ꎮ
分别取 ２ μＬ玉米样品中细菌提取 ＤＮＡꎬ用常
规 ＰＣＲ和巢式 ＰＣＲ分别检测ꎬ反应体系、程序、电
泳及成像分析同 １.４和 １.５ꎬ重复 ３次ꎮ
１.７　 ＰＣＲ产物序列分析
ＰＣＲ扩增产物送至上海生工生物技术服务有
限公司进行双向测序ꎬ序列核实拼接后和 ＧｅｎＢａｎｋ
中 Ｃｍｎ及其相关种序列进行比对分析ꎬ同时和供
试 ４株 Ｃｍｎ菌株的相应序列进行比对分析ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 引物特异性
引物 ＣＭ１ / ＣＭ４ 分别对 ４０ 株供试菌株 ＤＮＡ
进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ１３ 株 Ｃｍ 菌株均可扩增得到 ４９７
ｂｐ的预期产物ꎻ其他供试菌株无预期扩增产物
(表 １)ꎬ仅玉米样品中分离的菌株 １０５７￣９２２ 有约
８００ ｂｐ的非特异性扩增ꎬ但产物大小和预期目标
条带不同ꎮ
引物 ＰＳＭ１ / ＣＭ３分别对 ４０ 株供试菌株 ＤＮＡ
进行 ＰＣＲ扩增ꎬ供试 ４株 Ｃｍｎ 菌株均有特异性扩
增ꎬ得到 ２０８ ｂｐ 的预期目标片段ꎻＣｍ 种下其他 ４
个亚种及其他供试菌株均无预期扩增产物(表 １)ꎻ
仅玉米样品中分离的菌株 １０５７￣９２２有约 ５００ ｂｐ的
非特异性扩增ꎬ与预期扩增产物大小不同ꎮ 试验结
果表明引物 ＰＳＭ１ / ＣＭ３ 可用于 Ｃｍｎ 的特异性检
测ꎮ
２.２　 引物灵敏度
２.２.１　 常规 ＰＣＲ 检测　 引物 ＰＳＭ１ / ＣＭ３ 扩增系
列稀释的菌株 ＡＴＣＣ２７８２２ ＤＮＡꎬ试验结果表明ꎬ
引物 ＰＳＭ１ / ＣＭ３ 对 ４ ｎｇ、４００ ｐｇ、４０ ｐｇ、４ ｐｇ 的
ＤＮＡ都能扩增出 ２０８ ｂｐ 的预期目的片段ꎬ而 ０.４
ｐｇ的 ＤＮＡ扩增没有得到预期条带(图 １￣Ａ)ꎬ有效
检测 ＤＮＡ的灵敏度为 ４ ｐｇꎮ 对系列稀释的菌株
ＡＴＣＣ２７８２２菌悬液的扩增结果表明ꎬ引物 ＰＳＭ１ /
ＣＭ３对 ６.８×１０５ ＣＦＵ、６.８×１０４ ＣＦＵ、６.８×１０３ ＣＦＵ、
６.８×１０２ ＣＦＵ的菌悬液都能扩增得到 ２０８ ｂｐ 目标
产物ꎬ６８ ＣＦＵ 的菌悬液经扩增后无扩增产物(图
１￣Ｂ)ꎬ有效检测菌悬液的灵敏度为 ６８０ ＣＦＵꎮ
２.２. ２ 　 巢式 ＰＣＲ 检测 　 引物 ＣＭ１ / ＣＭ４ 和
ＰＳＭ１ / ＣＭ３ 组合的巢式 ＰＣＲ 扩增系列稀释的菌
株 ＡＴＣＣ２７８２２ ＤＮＡꎬ试验结果表明巢式 ＰＣＲ对 ４
ｐｇ、４００ ｆｇ、４０ ｆｇ 的 ＤＮＡ 都能扩增出预期 ２６８ ｂｐ
的目的片段ꎬ而 ４ ｆｇ的 ＤＮＡ不能扩增出预期目的
片段(图 ２￣Ａ)ꎬＤＮＡ 的有效检测灵敏度为 ４０ ｆｇꎮ
对系列稀释的菌株 ＡＴＣＣ２７８２２ 菌悬液的扩增结
果表明ꎬ巢式 ＰＣＲ 对 ６８０ ＣＦＵ、６８ ＣＦＵ、６.８ ＣＦＵ
的菌悬液能扩增得到 ２０８ ｂｐ 目标产物ꎬ而 ０. ６８
ＣＦＵ的菌悬液无扩增产物(图 ２￣Ｂ)ꎬ菌悬液的有
效检测灵敏度为 ６.８ ＣＦＵꎮ 同时试验结果表明针
对病菌 ＤＮＡ或菌悬液的检测ꎬ巢式 ＰＣＲ灵敏度比
常规 ＰＣＲ高 １００倍ꎮ
４２１
　
　 ２期 　 　 叶露飞ꎬ等:进境玉米中玉米内州萎蔫病菌的 ＰＣＲ检测
Ｆｉｇ. １　 Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＣＲ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｍｎ
Ｌａｎｅ Ｍ: Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ ２０００(ＴａＫａＲａ)ꎻ
Ａ: Ｌａｎｅ １￣５: ４ ｎｇꎬ ４００ ｐｇꎬ ４０ ｐｇꎬ ４ ｐｇꎬ ０.４ ｐｇ ＤＮＡ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ２７８２２ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ Ｌａｎｅ ６: Ｎｏ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ.
Ｂ: Ｌａｎｅ１￣５: ６.８×１０５ ＣＦＵꎬ ６.８×１０４ ＣＦＵꎬ ６.８×１０３ ＣＦＵꎬ ６.８×１０２ ＣＦＵꎬ ６８ ＣＦＵ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ２７８２２ꎬ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ Ｌａｎｅ ６: Ｎｏ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ.
Ｆｉｇ. ２　 Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ ｆｏｒ ＤＮＡ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｍｎ
Ｌａｎｅ Ｍ: Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ ２ ０００(ＴａＫａＲａ)ꎻ
Ａ: Ｌａｎｅ １￣４: ４ ｐｇꎬ ４００ ｆｇꎬ ４０ ｆｇꎬ ４ ｆｇ ＤＮＡ ｏｆ ＡＴＣＣ ２７８２２ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ Ｌａｎｅ ５: Ｎｏ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ.
Ｂ: Ｌａｎｅ １￣４: ６.８×１０２ ＣＦＵꎬ ６８ ＣＦＵꎬ ６.８ ＣＦＵꎬ ０.６８ ＣＦＵ ｏｆ ＡＴＣＣ ２７８２２ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ Ｌａｎｅ ５: Ｎｏ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ.
２.３　 美国玉米样品中 Ｃｍｎ的检测
美国玉米样品 １０５８￣１、１０５８￣３、１０５８￣４、１０５８￣６
经 ＰＢＳ浸泡过夜ꎬ离心取沉淀ꎬ提取 ＤＮＡꎬ用引物
ＰＳＭ１ / ＣＭ３扩增 ３５个循环ꎬ仅样品 １０５８￣６出现阳
性扩增ꎬ其余 ３个样品均无扩增产物(图 ３￣Ａ)ꎮ 巢
式 ＰＣＲ检测玉米样品ꎬ样品 １０５８￣１、１０５８￣３、１０５８￣６
均出现 ２０８ ｂｐ的预期目标条带ꎬ样品 １０５８￣４ 无扩
增产物(图 ３￣Ｂ)ꎬ表明样品 １０５８￣６中 Ｃｍｎ的 ＤＮＡ
含量较高ꎬ常规 ＰＣＲ检测可扩增得到目标产物ꎻ样
品 １０５８￣１和 １０５８￣３中 Ｃｍｎ 的 ＤＮＡ 含量较低ꎬ需
巢式 ＰＣＲ 检测才可得到目标产物ꎻ而样品 １０５８￣４
经常规 ＰＣＲ和巢式 ＰＣＲ检测均为阴性ꎬ表明样品
１０５８￣４中无 Ｃｍｎ的 ＤＮＡ或含量低于检测限以下ꎮ
供试的 １００个美国玉米样品分别用常规 ＰＣＲ
和巢式 ＰＣＲ进行检测ꎬ常规 ＰＣＲ 检测出 ８ 个阳性
样品ꎬ阳性检出率为 ８％ꎻ巢式 ＰＣＲ检测出 ２４ 个阳
性样品ꎬ阳性检出率为 ２４％ꎻ巢式 ＰＣＲ方法对 Ｃｍｎ
的检出率高于常规 ＰＣＲꎬ检测结果与 ２种检测方法
的灵敏度不同有关ꎬ灵敏度高的检测方法其阳性检
出率比较高ꎮ
５２１
　
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. ３　 Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｍｎ ｉｎ ｃｏｒｎ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ ａｎｄ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ
Ａ: Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲꎻ Ｂ: Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲꎻ
Ｌａｎｅ Ｍ: Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ ２ ０００(ＴａＫａＲａ)ꎻ Ｌａｎｅ １￣５: Ｓａｍｐｌｅ １０５８￣６ꎬ Ｓａｍｐｌｅ １０５８￣１ꎬ Ｓａｍｐｌｅ １０５８￣３ꎬ
Ｓａｍｐｌｅ １０５８￣４ꎬ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｌａｎｅ ６: Ｎｏ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ.
２.４　 ＰＣＲ产物序列分析
选取常规 ＰＣＲ 和巢式 ＰＣＲ 检测阳性的玉米
样品 １０５８￣１、１０５８￣３ 和 １０５８￣６ 的 ＰＣＲ 扩增产物ꎬ
双向测序后均得到 ２０８ ｂｐ 的序列且序列一致ꎬ与
ＧｅｎＢａｎｋ中 Ｃｍｎ 菌株 ＫＡＣＣ２０７８８ 的 １６Ｓ￣２３Ｓ 序
列 ( ＪＮ６１３８３５ ) 和 供 试 ４ 株 Ｃｍｎ 菌 株
(ＡＴＣＣ２７８２２、 ＡＴＣＣ２７７９４、 ＡＴＣＣ２７７９５、 ＮＣＰＰＢ￣
２５７８) 的 １６Ｓ￣２３Ｓ 序 列 ( ＪＸ２１６８３６、 ＪＸ２１６８３７、
ＪＸ２１６８３８、 ＪＸ２１６８３９ ) 相似性均为 １００％ꎻ而与
ＧｅｎＢａｎｋ 中 １５ 个 Ｃ. ｍ. ｓｕｂｓｐ. ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ
(Ｃｍｍ)菌株的 １６Ｓ￣２３Ｓ序列相似性为 ９７％~９９％ꎬ
序列差异为 ３ ~ ７ ｂｐꎻ与 ＧｅｎＢａｎｋ 中 ３ 个 Ｃ. ｍ.
ｓｕｂｓｐ. ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｓ (Ｃｍｉ)菌株的 １６Ｓ￣２３Ｓ 序列相似
性为 ９７％~９８％ꎬ序列差异 ４~ ７ ｂｐꎻ与 ＧｅｎＢａｎｋ 中
４ 个 Ｃ. ｍ. ｓｕｂｓｐ. ｓｅｐｅｄｏｎｉｃｕｓ(Ｃｍｓ)菌株的 １６Ｓ￣
２３Ｓ序列相似性为 ９７％~９８％ꎬ序列差异均为 ５ ｂｐꎻ
与 ＧｅｎＢａｎｋ中 １个 Ｃ. ｍ. ｓｕｂｓｐ. ｔｅｓｓｅｌｌａｒｉｕｓ(Ｃｍｔ)
菌株 ＫＡＣＣ２０８００的 １６Ｓ￣２３Ｓ 序列差异较大ꎬ序列
相似性仅为 ６０％ꎻ测序结果验证了检测引物的特
异性和检测结果的准确性ꎬ也表明美国进境玉米样
品中存在玉米内州萎蔫病菌ꎮ
３　 讨论
目前植物病原棒形细菌分布于 ６个属内ꎬ分别
是棒形杆菌属 Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ、拉氏杆菌属 Ｒａｔｈａｙｉ￣
ｂａｃｔｅｒ、赖氏细菌属 Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ、短小杆菌属 Ｃｕｒｔｏ￣
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、节杆菌属 Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ 和红球菌属
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ [１３]ꎬ均为革兰氏阳性细菌ꎮ Ｃｌａｖｉ￣
ｂａｃｔｅｒ目前只包含一种植物病原菌 Ｃｍꎬ根据其寄
主专化性分为 ５个亚种ꎬ包括番茄细菌性溃疡病菌
(Ｃｍｍ)、马铃薯环腐病菌 (Ｃｍｓ)、苜蓿萎蔫病菌
(Ｃｍｉ)、玉米内州萎蔫病菌(Ｃｍｎ)和小麦花叶病菌
(Ｃｍｔ) [１０]ꎬＣｍｍ、Ｃｍｓ 和 Ｃｍｉ 是 ＥＰＰＯ 的检疫性
有害生物ꎬ而我国将 Ｃｍｎ、Ｃｍｍ、Ｃｍｓ 和 Ｃｍｉ 列入
检疫性有害生物名录ꎮ Ｃｍｎ 可为害马齿玉米、甜
玉米、硬粒玉米、爆玉米、狗尾草、稗草和甘蔗ꎮ 其
症状易与玉米细菌性枯萎病 ( Ｓｔｅｗａｒｔ′ ｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｗｉｌｔ)相混淆ꎬ二者均可引起玉米叶片枯萎ꎬ植株矮
化[１０]ꎮ
１９７９年ꎬＧｒｏｓｓ 等[１１]报道了一种半选择性培
养基 ＣＮＳꎬ可从新鲜玉米组织、干燥病残体和土壤
中分离 Ｃｍｎꎮ 后来发现 ＣＮＳ 中的氯化锂对 Ｃｍｎ
的生长有抑制作用[１５]ꎬ１９８６ 年ꎬＳｈｅｐｈｅｒｄ 将 ＣＮＳ
改进为 ｓＣＮＳ培养基ꎬ提高了病菌回收率ꎬ菌落形
成时间缩短为 ４~７ ｄ[１３]ꎮ 但是不同 Ｃｍｎ菌株的菌
落颜色和形态有一定差异[１４]ꎬ且其他革兰氏阳性
棒形细菌ꎬ如 Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｃｃｕｍｆａｃｉｅｎｓ ｐｖ.
ｂｅｔａｅ、Ｃ. ｆ. ｐｖ. ｏｏｒｔｉｉ、 Ｃ. ｆ. ｐｖ. ｆｌａｃｃｕｍｆａｃｉｅｎｓ也可
在 ｓＣＮＳ培养基上生长ꎬ在进境玉米样品的分离试
验中发现 Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ.的部分菌落形态特征
与 Ｃｍｎ非常相似ꎬ容易对分离结果造成干扰ꎮ
国外已有商品化的免疫试纸条和 ＥＬＩＳＡ
(ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙꎬ酶联免疫吸
附测定)检测试剂盒ꎬＫｅｖｉｎ Ａ. Ｋｏｒｕｓ用美国 Ａｇｄｉａ
６２１
　
　 ２期 　 　 叶露飞ꎬ等:进境玉米中玉米内州萎蔫病菌的 ＰＣＲ检测
公司、Ｎｅｏｇｅｎ公司的免疫试纸条和 ＥＬＩＳＡ 检测试
剂盒测试了 ９３ 株细菌ꎬ结果发现 Ｃｍｍ 免疫试纸
条与所有 Ｃｍ菌株均有交叉反应ꎬ在实际应用中可
能会对结果造成误判ꎬ检测灵敏度仅为 １ × １０４
ＣＦＵ / ｍＬ[１５]ꎮ
分子生物学检测方法在植物病原菌的初步检
测中发挥着越来越重要的作用ꎮ Ｌｏｕｗｓ 等应用
Ｒｅｐ￣ＰＣＲ技术分析了 Ｃｍ 不同亚种间的基因组指
纹图谱ꎬ不同亚种形成独特的指纹图谱ꎬ而同一亚
种内不同菌株间的指纹图谱稳定而一致[１６]ꎬ并将
该方法用于 Ｃｍ 不同亚种间的鉴别ꎮ Ｐａｓｔｒｉｋ 等根
据 Ｃｍ亚种间 １６Ｓ￣２３Ｓ序列差异设计特异引物ꎬ可
将 Ｃｍｎ 与其他亚种进行区分[１７]ꎮ Ｂａｃｈ 等引入
ＴａｑＭａｎ探针建立了 Ｃｍ种下 ５ 个亚种的实时荧光
ＰＣＲ方法[１８]ꎮ 这些报道多集中于对纯培养细菌的
检测ꎬ并未涉及进境玉米样品中 Ｃｍｎ的检测ꎮ
本试验根据 ＧｅｎＢａｎｋ 中 Ｃｍ 不同亚种及其近
似种间 １６Ｓ￣２３Ｓ 序列差异ꎬ设计了种通用引物
ＣＭ１ / ＣＭ４ 和特异引物 ＰＳＭ１ / ＣＭ３ꎬ引物 ＰＳＭ１ /
ＣＭ３的特异性测试中发现玉米样品中分离菌株
１０５７￣９２２ 出现约 ５００ ｂｐ 的非特异性扩增 (引物
ＣＭ１ / ＣＭ４的扩增片段约 ８００ ｂｐ)ꎬ但无 ２０８ ｂｐ 的
预期扩增产物ꎬ分离物 １０５７￣９２２ 经 １６Ｓ 序列分析
后鉴定为 Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ.ꎬ测试中扩增产物电
泳后条带较弱ꎬ说明引物 ＣＭ１ / ＣＭ４ 和 ＰＳＭ１ /
ＣＭ３对其扩增效率不高ꎬ且扩增产物与目标产物
大小不一ꎬ因此对实际样品的检测结果影响有限ꎮ
对 ＤＮＡ和菌悬液的灵敏度试验表明ꎬ巢式 ＰＣＲ灵
敏度大大高于常规 ＰＣＲꎮ 检测玉米样品时ꎬ前者
的阳性检出率高于后者ꎬ２ 种方法的检出率分别为
２４％和 ８％ꎬ同时表明玉米样品中的带菌率和带菌
量都比较低ꎮ ＰＣＲ产物测序结果表明样品扩增产
物序列和 Ｃｍｎ 菌株 １６Ｓ￣２３Ｓ 序列一致ꎬ表明美国
进境玉米样品中存在 Ｃｍｎꎬ但多次分离试验均未
分离到活菌ꎬ同时表明玉米样品中 Ｃｍｎ 的数量较
少ꎬ而且活菌数量有限ꎮ 整个检测过程控制在 ２ 个
工作日之内ꎬ该 ＰＣＲ 检测方法可以满足口岸对进
境玉米样品中 Ｃｍｎ的检疫要求ꎮ
致谢:宁波出入境检验检疫局张慧丽、甘肃出入境
检验检疫局刘箐、天津出入境检验检疫局刘
鹏、中国检验检疫科学院赵文军、山西省农科
院王瑞霞和云南农业大学姬广海提供试验菌
株材料ꎮ
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责任编辑:于金枝
８２１