全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
!"#$)"%)!-
&修改稿收到日期$
!"#$)")#-
基金项目$内蒙古农牧业科学院科技创新项目"
!"##23445"#)$
#&国家牧草产业体系"
2678)%*
#
作者简介$聂利珍"
#&(
#!女!在读博士研究生!助理研究员!主要从事植物抗逆基因工程的研究
9):;/<
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"
通信作者$刘永志!中国科学院博士后!研究员!主要从事草业科学研究工作
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E
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沙冬青脱水素基因转化紫花苜蓿的耐寒性研究
聂利珍!郭九峰!刘红葵!斯钦巴特尔!孙
!
杰!乔慧蕾!刘永志"
"内蒙古农牧业科学院!呼和浩特
"#""%#
#
摘
!
要$以紫花苜蓿品种(中苜
!
号)为野生型材料!采用农杆菌介导法将沙冬青脱水素基因"
FGC
@
FH/1
!
!"#$%
#
导入紫花苜蓿基因组中并获得转基因植株!通过
I27
和
8>?JCGH1K<>J
杂交鉴定转基因植株!利用
7L)I27
和
M
7L)I27
检测转基因植株中
!"#$%
基因及低温胁迫相关基因的表达量!并测定低温胁迫下苜蓿叶片的脯氨酸
"
IH>
#和丙二醛"
5N6
#含量!从分子水平和生理指标两个层面研究转基因植株的抗寒特性!为进一步获得抗寒性较
强的转基因苜蓿新材料提供依据结果显示$"
#
#
!"#$%
基因已整合在转基因苜蓿植株基因组中!而且在不同的
转基因株系中
!"#$%
的表达量也各不相同"
!
#低温"
$O
#处理后转基因植株中冷胁迫相关基因
&(!
*
&(%
*
)*+#$
和
&!,#
的表达量明显高于同期野生对照&
(!
*
&(%
和
&!,#
表达量在冷处理
*C
后都显著
增加并达到最大值!而
)*+#$
表达量在冷处理
F
时最高!它们的最高值分别是对照的
!,*
*
$
*
#,-
和
%
倍左右
"
%
#苜蓿叶片的
IH>
和
5N6
含量均随低温处理时间延长而逐渐增加!转
!"#$%
基因苜蓿叶片的
IH>
含量始终
高于同期野生型植株!而其
5N6
含量却始终低于同期野生型植株!且两类植株间差异均在胁迫
#$F
时达到显著
水平因此!推测转
!"#$%
基因苜蓿中积累的
6:NPQ
蛋白可能对一些酶的活性及膜系统起冷冻保护作用!从
而使得转
!"#$%
基因紫花苜蓿的植株抗寒性提高!同时
!"#$%
也可能通过调控与低温相关基因的表达间接
调节植物的耐低温能力
关键词$紫花苜蓿&转基因&沙冬青脱水素基因&胁迫相关基因&低温胁迫
中图分类号$
R+&
文献标志码$
6
$%&!

"()"*!+,%-.,,/"*.-0(1."2/-0(,
3
.(#14*20*20
"
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2
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-./012
3
+425062T,
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0JHG00)HG<;J/DG
A
G1G
&
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紫花苜蓿是世界上分布最广的优良牧草!同时
也是在中国种植面积最大的人工牧草中国苜蓿主
要种植在西北地区!而西北地区的气候特点是干旱*
少雨*严冬!这对苜蓿的正常生长发育非常不利!严
重制约了苜蓿产业发展深入开展苜蓿抗逆性研
究!培育优良的抗逆品种!对于克服冬寒和干旱等自
然条件!扩大种植范围!提高生产力!具有非常重要
的意义+#)%,近年来!国内外研究人员已分离克隆了
许多抗逆基因!但是在生产上能应用的基因少之又
少因此!分离克隆抗逆性强的基因!提高农作物及
牧草的生产能力势在必行
干旱*盐碱*低温等是限制作物生产的主要环境
因子随着人口的增加*经济发展以及全球气候的
变化!这些环境问题有日趋加重的趋势低温是主
要的胁迫因子之一!大部分植物都面临着低温胁迫
的危害!植物在低温胁迫下会遭到不同程度的伤害!
严重时甚至导致植株死亡同时!植物在长期的进
化过程中形成了对低温的适应能力!其通过调节自
身的生理和分子变化过程形成了对低温胁迫的适应
机制!从对信号的感知和传递到基因的表达调控!最
终对低温胁迫做出响应在这一过程中植物积累了
大量的可溶性糖*脱水素*游离氨基酸等一系列物
质!保护低温下细胞的结构稳定+$)*,!最终提高了植
物抵抗低温的能力
脱水素"
FGC
@
FH/1
!
NPQ
#存在于各种植物中!
受干旱*低温和盐碱等胁迫因子诱导表达+-,许多
研究表明植物在低温下脱水素的表达量与低温抗性
呈正相关+,虽然关于脱水素在植物体内的具体功
能还不是很清楚!但是根据细胞脱水过程中它们的
大量累积推测其可能参与胁迫条件下对细胞的保护
功能+,!它还可以保护生物大分子免受干旱*渗透胁
迫*离子毒害等的破坏+&,!能够清除植物细胞中的活
性氧自由基+#",研究表明小麦脱水素基因
72#$%)#
参与了小麦对干旱*高盐和低温胁迫的耐受调节过
程+##,体外研究表明脱水素主要具有低温保护特
性以及脂质和金属离子结合特性+#!,!基于以上结果
推测脱水素基因可能在参与植物抵御非生物胁迫中
具有重要的作用虽然植物中关于脱水素基因的研
究比较多!但是关于沙冬青脱水素基因的研究尚鲜
见报道
沙冬青"
!""+
8
0
8
5295:;4"+9
3
+<01;4
#是戈壁
荒漠唯一的常绿阔叶灌木!能生长于非常严寒的环
境中!并保持绿色!具有非常强的耐低温能力本研
究以课题组得到的转沙冬青脱水素基因"
!"=
#$%
#的紫花苜蓿为材料!以非转基因的-中苜
!
号.为野生型对照!通过对转基因植株鉴定以及在低
温胁迫下转基因植株中胁迫相关基因表达量*叶片
脯氨酸含量和丙二醛含量的测定!考察转基因紫花
苜蓿植株的耐低温能力!期望通过转基因技术提高
紫花苜蓿的耐寒性!也为其它作物的耐低温研究提
供理论依据和技术方法
#
!
材料和方法
<,<
!
材料与试剂
试验所用材料是紫花苜蓿"
-./012
3
+425062
T,
#品种(中苜
!
号)!种子由中国农业科学院草原
研究所于林青研究员馈赠农杆菌
TZ6$$"$
和带
有脱水素基因的植物表达载体"
E
ZS)NPQ
#由本课
题组构建!
E
ZS#!#
植物表达载体由内蒙古农业大学
李国婧教授馈赠
8>?JCGH1K<>J
试剂购自
7>=CG
公司!
I27
和
M
7L)I27
引物由上海生工生物工程
有限公司合成
M
7L)I27
试剂盒购自
L;Y;H;
公司
8[Z7IHG:/_9_72
>
"
N77$!"8
#!
M
7L)I27
相关
耗材购自
Z/>
E
<;0J/=0
公司!
M
7L)I27
仪器为
7>=CG
$+"7G;<)L/:GI278
@
0JG:0

<,=
!
材料培养与处理
!
#
"无菌苗培养
!
详见聂利珍等+#%,的方法
!"低温处理
!
转基因植株移植至装有蛭石的
+!#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
花盆中!将花盆放入植物人工气候室进行培养!同时
用同样的条件培养野生型植株作为对照!当植株长
至
$
"
*
片真叶时!挑选长势良好*生长一致的转基
因植株和对照植株进行低温处理在
$O
条件下处
理
"
**
#!
*
!$
*
!C
及
%
*

*
#$F
后!分别收集各处
理时间的苜蓿叶片置于液氮中速冻!
("O
保存!
用于荧光定量
I27
测定&在
$O
条件下处理
"
*
%
*

*
#$F
后!分别剪下植株叶片称量
#
A
!用滤纸包好
后液氮速冻!
("O
保存!用于脯氨酸和丙二醛含
量的测定
<,>
!
遗传转化及分子鉴定
!
#
"遗传转化
!
将
E
ZS)NPQ
表达载体通过农
杆菌介导法转入紫花苜蓿(中苜
!
号)中!获得
!"=
#$%
超表达转基因苜蓿!详见聂利珍等+#%,方法
!"分子鉴定
!
利用
!"#$%
基因的特异引物
进行鉴定
8>?JCGH1K<>J
$采用的植物材料为经
I27
检测为阳性的抗性再生植株叶片
8>?JCGH1
杂交试剂盒为
7>=CG
公司的
NSUNQ6T;KGA
;1FNGJG=J/>1a/J
!尼龙膜为
7>=CG
公司
Q
@
<>1
5G:KH;1G0
E
>0/J/DG<
@
=C;H
A
GF
"
##!"&!!""#
#!探
针制备根据
7>=CG
公司的地高辛探针标记及检测
试剂盒说明书进行探针标记
NQ6
提取采用
2L6Z
法!
"
#
A
NQ6
经过
2"P
$
过夜酶切!电
泳后将
NQ6
转移至尼龙膜上!按试剂盒说明进行
杂交*洗膜和检测等
<6?
!
!5678
基因表达分析
!
#
"提取
7Q6
!
利用
LH/B><
法提取
7Q6
!
7Q6
样品用
NQ6;0GS
消化!以除去基因组
NQ6
的污染将提取的苜蓿总
7Q6
经分光光度计检测
浓度!保证所得样品的
WN
!-"
%
!+"
介于
!,"
"
!,#
之
间!总
7Q6
进行琼脂糖凝胶电泳!确保提出的总
7Q6
完整性较好!且无基因组污染!满足后续的反
转录和
M
7L)I27
分析的要求
!"
7L)I27
!
从每个样品中取
",*
#
A
总
7Q6
反转录成
=NQ6
!
=NQ6
第一链合成试剂盒购自天
根公司!操作根据
=NQ6
第一链合成试剂盒说明进
行反转后的
=NQ6
产物于
(!"O
保存将
=N)
Q6
进行
I27
!
I27
反应体系及程序设定与
I27
扩增反应相同
!
%
"实时定量
7L)I27
分析
!
实时定量
7L)
I27
反应在
&-
孔板中进行!
#"
#
T
反应体系$
!b
8[Z7
E
HG:/_*
#
T
!上下游引物"
#"
#
:><
%
T
#各
#
#
T
!稀释
*
倍后的
=NQ6
模板
#
#
T
!
P
!
W!
#
T
反
应条件$
&*O
预变性
!:/1
!
&*O
变性
%"0
!
**O
退
表
<
!
定量
@)A
分析所用基因引物序列
L;K!
8G
M
?G1=G0>XJCG
E
H/:GH0?0GFJ>
M
?;1J/J;J/DGI27;1;<
@
0/0
引物名称
IH/:GH1;:G
引物序列
8G
M
?G1=G>XJCG
E
H/:GH
!"#$%
*c)26LU2L6U2U2LU22LLLL6)%c
*c)6U26LU26LULU22LLLLL6)%c
-4&!,#
*c)6262L62LUU2L6LUU66U)%c
*c)22LL2LL62L26666626U)%c
-4!1509
*c)62U6U2ULLL26U6LU)%c
*c)622L22U6L226U626)%c
-4&(!
*c)U6662LL6U6L666LUUULU)%c
*c)UL6U26U6UULUU666L6U)%c
-4&(%
*c)2662U6UU6U6LU2U6LL6)%c
*c)6LU226LLU26U26626L)%c
-4)*+#$
*c)6L2U266L2L2666UULL)%c
*c)LULL66LUU2L2LUUL2L2)%c
火
%"0
!
!O
延伸
#:/1
!
$"
个循环反应结束后进
行溶解曲线分析!溶解曲线根据仪器
7>=CG$+"
标
准程序进行
<,B
!
低温胁迫相关基因的表达
采用荧光定量
7L)I27
方法!以
$O
处理
"
**
#!
*
!$
和
!C
及
%
*

*
#$F
的
=NQ6
为模板!
-4!1=
509
作为内参基因!检测转基因苜蓿中内源低温胁迫
相关基因
-4&(!
*
-4&!,#
*
-4&(%
*
-4)*+#$
的表达量!相对表达量用以下公式计算$
!
(
$
2J
d
!
(
+
2J
!
J(2J
!
H
,
在定量
I27
分析中所用基因引物序列
见表
#

<,C
!
脯氨酸和丙二醛含量
脯氨酸"
IH>
#含量测定采用茚三酮法!具体操作
按试剂盒说明书操作"南京建成公司#丙二醛
"
5N6
#含量测定采用
LZ6
法!具体操作按试剂盒
说明书操作"南京建成公司#
<,D
!
数据处理
实时定量
I27
数据计算和作图采用
5/=H>0>XJ
9_=G
!
!
结果与分析
=6<
!
!5678
基因遗传转化
试验所用的植物表达载体是
E
ZS#!#
!携带有
%*8
启动子和卡那霉素抗性!从沙冬青中扩增了
!"#$%
基因全长
-"%K
E
"图
#
!
6
#&连接
L
载体测
序后!分别用
,21
$
和
,
8
.
$
将
!"#$%
基因与表
达载体
E
ZS#!#
双酶切"图
#
!
Z
#!然后连接转化
NP*
%
!构建了重组载体
E
ZS)NPQ
"图
#
!
2
#&验证正
确后!转入农杆菌
TZ6$$"$
菌株中"图
#
!
N
#&然后
利用农杆菌介导法将
8
?=#$%
导入紫花苜蓿(中
苜
!
号)中!经过种子*胚状体和再生植株过程获得
&!#
&
期
!!!!!!!!!!!
聂利珍!等$沙冬青脱水素基因转化紫花苜蓿的耐寒性研究
图
#
!
全长
!"#$%
基因克隆及再生植株获得
5,NQ6:;HYGH
&
6,I27
扩增全长
!"#$%
片段&
Z,!"#$%
和载体
E
ZS#!#
酶切&
2,
重组载体
E
ZS)NPQ
的
酶切鉴定&
N,I27
鉴定重组载体
E
ZS)NPQ
&
9,
抗性再生植株
e/
A
,#
!
6:
E
1>X!"#$%XH;
A
:G1J0;1F
E
<;0:/F0HG=>:K/1;1J
6,6:
E
1>X!"#$%XH;
A
:G1J0K
@
I27
&
Z,!"#$%;1F
E
ZS#!#F/
A
G0JGFK
@
HG0JH/=J/>1G1B
@
:G
&
2,SFG1J/X/=;J/>1>XJCG
HG=>:K/1;1J
E
<;0:/F
E
ZS)NPQK
@
G1B
@
:GF/
A
G0J/>1
&
N,SFG1J/X/=;J/>1>XJCGHG=>:K/1;1J
E
ZS)NPQK
@
I27
&
9,7G0/0J;1J
E
<;1J
抗性再生植株"图
#
!
9
#
=,=
!
抗性再生植株的分子鉴定
=6=6<
!
@)A
鉴定
!
取抗性植株叶片提取基因组
NQ6
!利用
!"#$%
特异引物!通过
I27
的方法
鉴定获得的抗性植株试验结果如下$抗性再生植
株中均扩增出一条约
-"%K
E
的特异片段"图
!
#!说
明
!"#$%
基因可能已整合在紫花苜蓿基因组中
=6=6=
!
$"&%8.-(:*"%
杂交鉴定
!
选取获得的经
I27
检测呈阳性
L
"
代转化植株!提取其基因组
NQ6
!同时选用未转化的受体植株作阴性对照!利
用限制性内切酶
2"P
$
对
NQ6
进行酶切!并通
过
8>?JCGH1K<>J
方法检测
!"#$%
在植物基因组
中的整合情况!结果见图
%
从图中可以看出!经杂
交处理后!抗性植株中
#
*
!
*
$
* 和
-
号植株出现较
为明显的杂交信号!而
%
号植株和阴性对照则无杂
交信号产生!说明
%
号植株是非转基因植株这些
试验结果足以说明!目的基因
!"#$%
已经成功地
与紫花苜蓿基因组发生了整合!而且
*
个株系都是
单拷贝插入!插入的位点也不同
图
!
!
紫花苜蓿
L
"
代抗性植株的
I27
检测
2,
阳性对照"沙冬青基因组
NQ6
#&
#
"
-,
抗性植株
e/
A
,!
!
I27;1;<
@
0/0>XL
"
HG0/0J;1J
E
<;1J0>X-@425062
2,I>0/J/DG=>1JH><
"
6,:>1
A
>A
G1>:/=NQ6
#&
#(-,L
"
HG0/0J;1J
E
<;1J0
=6>
!
!5678
基因表达分析
=6>6<
!
A/+@)A
分析
!
选取
*
个转基因植株!并以
其幼嫩叶片为材料提取
7Q6
!进行反转录以
!"#$%I#
%
I!
为特异引物!检测
!"#$%
基因
的表达情况"图
$
#结果表明!
*
个转基因植株均能
扩增到目的基因特异性片段
-"%K
E
由此可以得
出$
!"#$%
基因在
L
"
代转基因苜蓿中得到了正
常表达
=6>6=
!
实时定量
A/+@)A
分析
!
为了研究
!"=
#$%
在不同株系中的表达量!进一步对获得的不
同株系的转基因紫花苜蓿进行实时定量
7L)I27
分析结果表明!所有的转基因株系中都能表达
!"#$%
基因!但各植株的表达量也各不相同!其
中以株系
*
中的基因表达量最高!且显著高于其余
株系!而其余株系间无显著差异"图
*
#
=,?
!
胁迫相关基因的表达量分析
为了研究转基因苜蓿的耐低温能力!利用
M
7L)
图
%
!
紫花苜蓿
L
"
代抗性植株的
8>?JCGH1K<>J
检测
2a,
阳性对照"脱水素基因
I27
产物#&
`,
阴性对照
"非转基因株系#&
#
"
-,
抗性植株
e/
A
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!
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西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
I27
方法分析了
$O
低温胁迫下苜蓿内源低温胁
迫相关基因
&(!
*
&(%
*
)*+#$
和
&!,#
的表
达量"图
-
#结果显示!苜蓿内源低温胁迫相关基
因
&(!
*
&(%
的表达量表现相似"图
-
!
6
*
Z
#!即
在不进行低温处理时!两类苜蓿株系内
&(!
和
图
$
!
7L)I27
分析
L
"
代转基因植株
!"#$%
表达量
2a,
阳性对照"沙冬青
=NQ6
#&
#
*
!
*
$
"
-
$转基因苜蓿
L
"
代植株
e/
A
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A
G1/=
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A
G1/=
E
<;1J0
图
*
!M
7L)I27
分析转基因苜蓿植株中
!"#$%
基因的表达水平
J`,
野生型株系"非转基因株系#&
#
*
!
*
$
"
-,
不同转基因
株系&不同小写字母表示不同的转基因株系间
在
","*
水平上存在显著性差异
e/
A
,*
!
!"#$%G_
E
HG00/>1A
G1/=
@M
7L)I27
J`,`/@E
G
E
<;1J
"
1>1)JH;10
A
G1/=
#!
#
!!
$(-,LH;10
A
G1/=&
JCGF/XXGHG1JA
1/X/=;1JF/XXGHG1=G
;:>1
A
F/XXGHG1JJH;10
A
G1/=
E
<;1J0;J","*图
-
!
低温处理后转基因苜蓿中胁迫相关基因的表达模式分析
J`,
非转基因株系&
T/1G*,
转基因株系&
6,
基因
&(!
&
Z,
基因
&(%
&
2,
基因
)*+#$
&
N,
基因
&!,#
&
不同小写字母表示转基因和非转基因株系间在
","*
水平上存在显著性差异&下同
e/
A
,-
!
9_
E
HG00/>1
E
H>X/@
0/0>X0JHG00)HG<;J/DG
A
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A
G1/=
E
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E
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G
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<;1J
&
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A
G1/=
E
<;1J
&
6,UG1G&(!
&
Z,UG1G&(%
&
2,UG1G)*+#$
&
N,UG1G&!,#
&
LCGF/XXGHG1JA
1/X/=;1JF/XXGHG1=GKGJ^GG1JH;10
A
G1/=;1F1>1)JH;10
A
G1/=
E
<;1J0;J","*^
#%#
&
期
!!!!!!!!!!!
聂利珍!等$沙冬青脱水素基因转化紫花苜蓿的耐寒性研究
图

!
低温处理后转基因苜蓿叶片中脯氨酸和丙二醛含量的变化
e/
A
,
!
IH>1JG1J/1JCGJH;10
A
G1/=
E
<;1J0/1HG0
E
>10GJ>=>&(%
几乎不表达&低温处理
*C
时!
&(!
和
&(%
均迅速表达!转基因株系中的表达量显著高
于对照!此时
&(!
表达量约是对照的
!,*
倍!
&(%
表达量约是对照的
$
倍&低温处理
!$C
后!各
株系两基因表达量开始迅速大幅降低!且转基因株
系与对照无显著差异同时!在不进行低温处理时!
苜蓿植株内
)*+#$
也能够正常表达!只是表达量
较低!且植株间无显著性差异&随低温胁迫时间的延
长!两类苜蓿植株
)*+#$
的表达量明显增加!且表
现出先增后降的趋势!并均在低温处理
F
时达到
最大值!此时转基因株系的表达量显著高于对照!约
是对照的
#,-
倍&低温胁迫
#$F
后!
)*+#$
的表达
量均开始下降!但对照下降幅度较大!转基因株系仍
显著高于对照!约是对照的
!,#
倍"图
-
!
2
#另外!
无低温处理时!
&!,#
在转基因株系和对照中都有
少量表达&随低温处理时间延长!
&!,#
的表达量
在转基因株系持续增加!而在对照株系中先增后减&
处理
!$C
和
!C
时!转基因株系表达量分别约是
对照的
!,&
倍和
%,%
倍!且均达到显著性水平"图
-
!
N
#以上结果说明转基因苜蓿的耐低温能力明
显比对照强
=,B
!
低温对苜蓿叶片内脯氨酸和丙二醛含量的影响
图

显示!野生对照和转基因紫花苜蓿叶片脯
氨酸"
IH>
#和丙二醛"
5N6
#含量均随着低温胁迫时
间的延长而呈现一致的逐渐增加的趋势&在胁迫过
程中!转基因植株叶片的
IH>
含量始终高于同期野
生对照!而其
5N6
含量始终低于同期野生对照!且
在处理
#$F
时均达到显著水平&随着低温处理时间
的延长!野生对照与转基因紫花苜蓿叶片
IH>
和
5N6
含量差异逐渐加大其中!低温处理
#$F
时!
转基因苜蓿叶片中的
IH>
和
5N6
含量分别是胁迫
前的
#,#
倍和
,#
倍!对照叶片则分别是低温胁迫
前的
&,!
倍和
&,$
倍&此时转基因苜蓿叶片中的
IH>
含量比野生对照显著增加
#"*,$f
!其
5N6
含
量则比野生对照显著降低
$",-f
可见!在低温胁
迫条件下!野生对照和转基因紫花苜蓿叶片都会做
出积极渗透调节响应!也均受到不同程度的氧化伤
害!但转基因植株响应更敏感*受到的伤害更小
%
!
讨
!
论
脱水素属于
T96
"
T;JGG:KH
@
>
A
G10/0;K?1)
F;1J
!胚胎发育晚期丰富#蛋白
N##
家族!在植物中
普遍存在最早在胚胎发育后期的棉花子叶中检测
到
T96
蛋白+#$,研究初期发现
T96
蛋白是在种
子发育后期伴随着种子成熟过程而产生的!而在胚
胎发育早期和幼苗期没有表达随着研究的不断深
入发现脱水素受
6Z6
诱导表达!并且在植物生理胁
迫造成的细胞缺水时诱导表达
ZH;D>
等+#*,研究表
明大麦的脱水素蛋白
NPQ*
和
I)+"
在体外能够保护
冻融过程中
TNP
"
<;=J;JGFGC
@
FH>
A
G1;0G
#的活性过
表达柽柳
T96
可提高转基因越橘对低温的抗性+#-,
马铃薯
NPQ!$
转入黄瓜后增加了黄瓜的抗寒性+#,
沙冬青
!"#$%
受干旱*渗透胁迫及
6Z6
诱导表
达+,因此!推测脱水素基因参与了植物的抗逆
过程
在自然界中遭受环境胁迫!如干旱*低温和盐等
胁迫时!植物体通过自身的防御网络来调控相关的
代谢途径!产生渗透调节物质以降低或消除胁迫的
伤害已有的研究发现!植物体内的游离脯氨酸可
作为渗透调节剂和冰冻保护剂对受低温胁迫的植物
抗寒性有非常重要的作用!并且随着低温胁迫时间
的延长其含量增加!证实了植物的抗寒性与游离脯
!%#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
氨酸含量密切相关+#+,本研究表明!低温处理后!
转基因苜蓿叶片中的脯氨酸含量显著高于非转基因
苜蓿!其胁迫相关基因
)*+#$
的表达量也明显增
加
)*+#$
是
IH>
降解的关键酶!主要参与
IH>
的
降解!低温处理过程中
)*+#$
的表达量随低温处
理时间延长而增加!由于
)*+#$
受底物
IH>
诱导
表达+#&,!因此转基因苜蓿中
)*+#$
表达的上调可
能源于低温胁迫后
IH>
含量的增加同时!低温处
理后!转基因苜蓿中
&!,#
的表达量也明显增加
&!,
基因表达量的增加可能形成大量的
268
蛋
白!
268
属于脱水素家族!它可能参与了低温过程
中保护细胞的结构和胞内蛋白的稳定性!从而提高
植物的抗冻性+!",所以!我们推测低温处理后转基
因苜蓿
&!,#
基因表达量增加!说明细胞内
268
蛋白的积累增加!一方面
268
蛋白可能作为低温保
护物质直接保护冷冻过程中细胞的结构和大分子的
活性!另一方面可能调控了渗透物质如
IH>
的合成!
使苜蓿更好地对低温做出响应!从而提高苜蓿对低
温的抗性+!#,
植物体内活性氧含量在低温胁迫下会大幅增
加!破坏生物膜系统!造成植物体内渗透调节失衡!
其体内活性氧自由基的积累超出一定限度时!就会
引起膜质过氧化!其产物
5N6
就会大量积累
5N6
含量高低反映了脂质的氧化程度!是膜系统
受损害的重要指标之一+!!,在低温胁迫过程中!本
研究中转基因苜蓿叶片的
5N6
含量显著低于野生
型对照!说明转基因苜蓿在低温胁迫下细胞膜受损
害较轻!表现出较好的耐低温能力另外!低温处理
后!转基因苜蓿
&(!
和
&(%
的表达量也明显增
加在正常条件下!转基因和非转基因苜蓿的冷胁
迫相关基因的表达量相似!而在低温处理之后
&(
基因都上调表达!但转基因株系相对于非转基因植
株上调的幅度更大这些结果与前人的研究结果是
一致的+#!,拟南芥中抗寒性的增强一般都伴随着
耐寒相关基因表达量的提高!如超表达
&(#
后!
&AB#*2
*
&AB$
和
&AB+
的表达量都增加!转基
因拟南芥的抗低温能力提高+!!)!*,&过表达小麦
72,9BC!,+
后!拟南芥
&(!
和
&(%
的表达量
增加!转基因拟南芥的耐低温能力提高+!-,另据
]C;1
A
等+!,研究发现!苜蓿中
-5&!,%#
的表达与
低温抗冻性密切相关!过表达
-5&!,%#
拟南芥中
&(!
和
&(%
的表达量增加!提高了拟南芥对冷
害的抗性
转基因苜蓿具有较强的耐低温能力!这可能是
由于转基因苜蓿中积累的
!"#$%
可能对一些酶
的活性及膜系统起冷冻保护作用!从而使得转基因
植物抗寒性提高!同时
!"#$%
也可能通过调控与
低温相关基因的表达间接调节植物的耐低温能力
本研究发现在苜蓿中超表达
!"#$%
基因提高了
低温对
&(!
和
&(%
基因的诱导作用但是!关
于
!"#$%
基因和
&(
基因表达的相互关系到目
前为止不是很清楚!还有待于今后进一步的验证
参考文献!
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大白菜叶中游离脯氨酸含量的变化及其与耐寒性的关系+
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