全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(４): ３４９￣３５６(２０１４)
收稿日期: ２０１２￣０９￣０８ꎻ 修回日期: ２０１３￣１１￣２３
基金项目: 宁波检验检疫局科研项目(甬 Ｋ０７￣２０１１)ꎻ 国家质检总局科研项目(２０１１ＩＫ１６９ꎬ ２０１２ＩＫ２９７)ꎻ 宁波市社会发展科研项目
(２０１２Ｃ５００４１)ꎻ 国家科技支撑计划(２０１２ＢＡＫ１１Ｂ０２)ꎻ 宁波市科研项目(２０１１Ｃ５００８０)
通讯作者: 段维军ꎬ高级农艺师ꎬ主要从事植物检疫研究ꎻ Ｔｅｌ: ０５７４￣８７０２２９５１ꎬ Ｆａｘ: ０５７４￣８７１１３５８４ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｗｅｉｊｕｎｄｕａｎ＠ｙａｈｏｏ.ｃｏｍ.ｃｎ
第一作者: 郭立新ꎬ女ꎬ湖南双峰人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事植物检疫研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｇｕｏｌｘ７６４９＠ ｔｏｍ.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０４.００２
逆转录环介导等温扩增技术检测南方菜豆花叶病毒
郭立新１ꎬ 段维军２∗ꎬ 徐亚飞１ꎬ 徐 颖１ꎬ 张永江３ꎬ 张吉红２
( １北仑出入境检验检疫局ꎬ 宁波 ３１５８００ꎻ２宁波出入境检验检疫局ꎬ 宁波 ３１５０１２ꎻ
３中国检验检疫科学研究院植物检疫研究所ꎬ 北京 １０００２９)
摘要:根据南方菜豆花叶病毒外壳蛋白基因序列设计并合成了 ４ 组 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 引物ꎬ通过引物筛选试验ꎬ确定 ＳＢ１ 组引物
为最佳引物ꎬ并进行了引物特异性与灵敏度检测试验ꎬ最终建立了南方菜豆花叶病毒的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ检测方法ꎮ 灵敏度检测
试验显示ꎬＲＴ￣ＬＡＭＰ方法比普通 ＲＴ￣ＰＣＲ法灵敏度高 １０倍ꎬ而检测时间明显缩短ꎬ整个反应过程只需 ４０ ｍｉｎꎮ 此外ꎬ体系
中加入钙黄绿素ꎬ反应结束后ꎬ可裸眼观察颜色变化来判定结果ꎮ 本研究所建立的 ＳＢＭＶ ＲＴ￣ＬＡＭＰ 方法具有快速、稳定、
灵敏、特异、操作简单的特点ꎬ适合于 ＳＢＭＶ的现场快速检测ꎮ
关键词:南方菜豆花叶病毒ꎻ 逆转录环介导等温扩增ꎻ 检测
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｅｍ ｂｅａｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ
ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ 　 ＧＵＯ Ｌｉ￣ｘｉｎ１ꎬ ＤＵＡＮ Ｗｅｉ￣ｊｕｎ２ꎬ ＸＵ Ｙａ￣ｆｅｉ１ꎬ ＸＵ Ｙｉｎｇ１ꎬ
ＺＨＡＮＧ Ｙｏｎｇ￣ｊｉａｎｇ３ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｊｉ￣ｈｏｎｇ２ 　 ( １ Ｂｅｉｌｕｎ Ｅｎｔｒｙ￣ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕꎬ Ｎｉｎｇｂｏ ３１５８００ꎬ Ｃｈｉ￣
ｎａꎻ ２ Ｎｉｎｇｂｏ Ｅｎｔｒｙ￣ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕꎬ Ｎｉｎｇｂｏ ３１５０１２ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００２９ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｆｏｕｒ ｓｅｔｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｅｍ
ｂｅａｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ (ＳＢＭＶ) ｆｏｒ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ (ＲＴ￣ＬＡＭＰ) ａｓｓａｙ.
Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｔｈｅ ｓｅｔ ＳＢ１ ｗａｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ
ｔｈｅ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ. Ａｎ ｏｎｅ ｓｔｅｐꎬ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ ＳＢＭＶ. Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｆｉｎｉｓｈｅｄ ｗｉｔｈｉｎ ４０ ｍｉｎｕｔｅｓꎬ ａｎｄ ｉｔ
ｗａｓ ｔｅｎ ｔｉｍｅｓ ｍｏｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｈａｎ ＲＴ￣ＰＣＲ ａｓｓａｙ. Ｍｏｒｅｏｖｅｒꎬ ａｄｄｉｎｇ ｃａｌｃｅｉｎ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｕｂｅꎬ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ａｍｐｌｉ￣
ｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅｄꎬ ｔｈｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｌｏｒ ｏｆ ｒｅａｃｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｄａｙｌｉｇｈｔ ａｌｌｏｗｅｄ ｖｉｓｕａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ ＳＢＭＶ. Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｒａｐｉｄꎬ ｓｔａｂｌｅꎬ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅꎬ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅꎬ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｆｉｅｌｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ ＳＢＭＶ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｓｏｕｔｈｅｍ ｂｅａｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ (ＳＢＭＶ)ꎻ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
(ＲＴ￣ＬＡＭＰ)ꎻ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
中图分类号: Ｓ４１２　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０４￣０３４９￣０８
　 　 南方菜豆花叶病毒(Ｓｏｕｔｈｅｍ ｂｅａｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓꎬ
ＳＢＭＶ)是南方菜豆花叶病毒属(Ｓｏｂｅｍｏｖｉｒｕｓ)的典型
成员[１]ꎬ主要分布在美洲和非洲的温热带地区ꎬ法国
和印度也有报道ꎬ该病毒主要通过豆科作物的种子
进行远距离传播[２]ꎬ给经济带来了严重影响ꎬ造成的
平均产量损失为 １７.４％[３]ꎮ 目前已将该病毒列入我
国进境植物检疫性有害生物名录ꎮ
环介导等温扩增 ( ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ
　
植物病理学报 ４４卷
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬ ＬＡＭＰ)是一种新的核酸扩增技术ꎬ该
技术依赖于能够识别靶序列上 ６个特异区域的引物
和一个具有链置换特性的 ＤＮＡ 聚合酶(Ｂｓｔ ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ)ꎬ在等温条件下高效扩增靶基因ꎬ灵敏度
和特异性高[４]ꎮ 目前该方法已应用于病毒[５~１５]、类
病毒[１６]、细菌[１７]、真菌[１８]及转基因[１９]的检测ꎮ 而
迄今尚无应用该技术检测南方菜豆花叶病毒的报
道ꎮ 本研究根据南方菜豆花叶病毒外壳蛋白基因序
列设计特异性引物ꎬ首次建立了 ＳＢＭＶ 的逆转录环
介导等温扩增 ( ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ
ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬ ＲＴ￣ＬＡＭＰ)检测方法ꎬ为
ＳＢＭＶ的检测提供一种新的检测方法ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 材料
１.１. １ 　 病毒分离物 　 南方菜豆花叶病毒(美国
ＡＴＣＣ ＰＶ￣１２１)接种在大豆叶片上ꎬ其植物总 ＲＮＡ
由中国检科院植物检疫研究所提供ꎬ简称为 ＳＢ￣ＡＴꎻ
２份感染南方菜豆花叶病毒的植物叶片分别购自美
国 Ａｇｄｉａ公司和德国 ＤＳＭＺ 公司ꎬ简称为 ＳＢ￣Ａ 和
ＳＢ￣Ｄꎮ 感染菜豆荚斑驳病毒(Ｂｅａｎ ｐｏｄ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉ￣
ｒｕｓꎬＢＰＭＶ)的大豆种子由宁波出入境检验检疫局植
物检疫实验室提供ꎻ感染南芥菜花叶病毒(Ａｒａｂｉｓ
ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓꎬＡｒＭＶ)的植物叶片购自德国 ＤＳＭＺ公
司ꎻ分别感染烟草环斑病毒(Ｔｏｂａｃｃｏ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓꎬ
ＴＲＳＶ)、番茄环斑病毒 ( Ｔｏｍａｔｏ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓꎬ
ＴｏＲＳＶ)的 ２份植物叶片购自美国 Ａｇｄｉａ公司ꎮ
１.１.２　 分子生物学试剂　 ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ 购
自 Ｑｉａｇｅｎ 公司ꎬＴａＫａＲａ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ
(ＡＭＶ) 购自大连宝生物公司ꎬＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
Ｒｅａｇｅｎｔ(即:钙黄绿素)、ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ 购
自日本荣研公司ꎮ ＲＴ￣ＬＡＭＰ 引物及 ＲＴ￣ＰＣＲ 引
物[２０]由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成ꎮ
１.２　 主要仪器
ＬＡ￣３２０Ｃ 实时浊度仪 ( Ｌｏｏｐａｍｐ􀅺 Ｒｅａｌｔｉｍｅ
Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｅｒ ＬＡ￣３２０Ｃ)ꎮ
１.３　 方法
１.３.１　 总 ＲＮＡ的提取　 分别对病毒分离物及健康
大豆叶片ꎬ使用 ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ 进行植物总
ＲＮＡ提取ꎬ具体操作见试剂盒说明书ꎮ 用核酸蛋白
分析仪测 ＯＤ２６０及 ＯＤ２８０ꎬ计算核酸的浓度和纯度ꎮ
１.３.２　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 引物的设计和合成　 从 ＧｅｎＢａｎｋ
调出所有南方菜豆花叶病毒外壳蛋白基因序列ꎬ利
用ＤＮＡＭＡＮ ６.０.４０软件进行比对分析ꎬ找出 ＳＢＭＶ
外壳蛋白基因序列的保守区ꎬ利用 ＬＡＭＰ引物设计
软件 ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ４ (ｈｔｔｐ: / / ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ. ｊｐ /
ｅｌａｍｐ４.０.０ / ｉｎｄｅｘ.ｈｔｍｌ) 设计了 ５组特异性引物ꎬ其
中有 １组引物不满足设计原则ꎬ故合成 ４组(表 １)ꎮ
１.３.３ 　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 引物的筛选 　 以 ＳＢ￣ＡＴ、ＳＢ￣Ｄ、
ＳＢ￣Ａ的总ＲＮＡ为模板ꎬ健康大豆叶片总 ＲＮＡ 为阴
性对照ꎬ利用各组引物进行 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 检测ꎬ即在
２５ μＬ反应体系中加入 ２ μＬ ＳＢ￣ＦＩＰ (２０ μｍｏｌ / Ｌ)ꎬ２
μＬ ＳＢ￣ＢＩＰ (２０ μｍｏｌ / Ｌ)ꎬ０.２５ μＬ ＳＢ￣Ｆ３ (２０ μｍｏｌ /
Ｌ)ꎬ０.２５ μＬ ＳＢ￣Ｂ３ (２０ μｍｏｌ / Ｌ)ꎬ１２.５ μＬ ２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ
Ｍｉｘꎬ１ μＬ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘꎬ２.５ μＬ ＲＮＡꎬ无 ＲＮＡ 酶的
ｄｄＨ２Ｏ补至 ２５ μＬꎮ 反应条件为:６３℃ ６０ ｍｉｎꎮ
１.３. ４ 　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 引物特异性检测 　 以 ＳＢ￣Ａ、
ＢＰＭＶ、ＴＲＳＶ、ＡｒＭＶ 和 ＴｏＲＳＶ 的总 ＲＮＡ 为模
板ꎬ按 １.３.３体系和条件进行 ＲＴ￣ＬＡＭＰ反应ꎮ
１.３.５　 灵敏度对比试验　 以 ＳＢ￣ＡＴ 总 ＲＮＡ 为模
板ꎬ用无 ＲＮＡ酶的 ｄｄＨ２Ｏ 稀释总 ＲＮＡ 进行相对
灵敏度检测ꎬ在 ２５ μＬ 反应体系中ꎬ总 ＲＮＡ 分别
为 ２０ ｎｇ、２ ｎｇ、２００ ｐｇ、２０ ｐｇ、２ ｐｇ、２００ ｆｇ和 ２０ ｆｇꎬ
进行实时 ＲＴ￣ＬＡＭＰ反应ꎮ 同时对稀释的 ＲＮＡ按
ＴａＫａＲａ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ (ＡＭＶ)说明书进
行普通 ＲＴ￣ＰＣＲ检测ꎬ ＰＣＲ产物用 １.５％的琼脂糖
凝胶电泳检测ꎮ
１.３.６　 ＳＢＭＶ的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ目视检测　 以 ＳＢ￣ＡＴ、
ＳＢ￣Ｄ、ＳＢ￣Ａ 的总 ＲＮＡ 为模板ꎬ健康大豆叶片总
ＲＮＡ为阴性对照ꎬ水为空白对照ꎬ进行 ＲＴ￣ＬＡＭＰ
目视荧光检测ꎬ即在 ２５ μＬ 反应体系中加入 ２ μＬ
ＳＢ１￣ＦＩＰ (２０ μｍｏｌ / Ｌ)ꎬ２ μＬ ＳＢ１￣ＢＩＰ (２０ μｍｏｌ /
Ｌ)ꎬ０.２５ μＬ ＳＢ１￣Ｆ３ (２０ μｍｏｌ / Ｌ)ꎬ０.２５ μＬ ＳＢ１￣
Ｂ３ (２０ μｍｏｌ / Ｌ)ꎬ１２.５ μＬ ２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘꎬ１ μＬ
Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘꎬ１ μＬ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔꎬ２.
５ μＬ ＲＮＡꎬ无 ＲＮＡ酶的 ｄｄＨ２Ｏ补至 ２５ μＬꎮ 反应
条件为:６３℃ ６０ ｍｉｎꎬ９５℃ ２ ｍｉｎꎮ
０５３
　
　 ４期 郭立新ꎬ等:逆转录环介导等温扩增技术检测南方菜豆花叶病毒
书书书
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１５３
　
植物病理学报 ４４卷
２　 结果与分析
２.１　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ引物的筛选
本研究所合成的 ４ 组引物ꎬ其中 ＳＢ３ 组引物
仅能检出 ＳＢ￣Ａ分离物ꎬＳＢ２组和 ＳＢ５组引物仅能
检出 ＳＢ￣Ａ与 ＳＢ￣Ｄ两个分离物ꎬ而 ＳＢ１ 组引物能
检出 ＳＢ￣Ａ、ＳＢ￣Ｄ和 ＳＢ￣ＡＴ ３ 个分离物(图 １)ꎬ故
选择 ＳＢ１组引物作为 ＳＢＭＶ ＲＴ￣ＬＡＭＰ 检测的最
佳引物(图 ２)ꎮ
２.２　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ引物特异性检测
检测结果可知ꎬＳＢ１组引物有较强的特异性(图
３)ꎬ５ 种大豆病毒中仅能检出 ＳＢＭＶꎬ不能检出
ＢＰＭＶ、ＴＲＳＶ、ＡｒＭＶ和 ＴｏＲＳＶꎬ与预期结果相符ꎮ
２.３　 灵敏度对比试验
灵敏度试验结果显示ꎬ本试验所建立的实时
ＲＴ￣ＬＡＭＰ检测方法检测低限为 ２ ｐｇ (图 ４)ꎬ而
ＲＴ￣ＰＣＲ法检测限为 ２０ ｐｇ(图 ５)ꎬ说明实时 ＲＴ￣
ＬＡＭＰ方法的灵敏度比普通 ＲＴ￣ＰＣＲ 方法高 １０
倍ꎮ
２.４　 ＳＢＭＶ的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ目视检测
ＲＴ￣ＬＡＭＰ扩增结束后ꎬ在正常光照条件下ꎬ
肉眼可观察到:ＳＢ￣Ａ、ＳＢ￣Ｄ 和 ＳＢ￣ＡＴ ３ 个阳性分
离物反应管颜色明显变为黄绿色ꎬ而空白对照与阴
性对照反应管颜色没有改变(图 ６)ꎬ表明所建立的
目视荧光方法可用于 ＳＢＭＶ的检测ꎮ
Ｆｉｇ. １　 ＲＴ￣ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔｓ
２５３
　
　 ４期 郭立新ꎬ等:逆转录环介导等温扩增技术检测南方菜豆花叶病毒
Ｆｉｇ. ２　 Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｃ￣ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ
ｓｅｌｅｃｔｅｄ ＳＢＭＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｂ(ＡＲＫ)ꎬ Ｓꎬ Ｓａｏ Ｐａｕｌｏꎬ Ｊꎬ Ｂｅａｎꎬ ａｎｄ ＥＭ２ꎬ
ｓｈｏｗｉｎｇ ｔｈｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｔｈｅ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｂ(ＡＲＫ)ꎬ Ｓꎬ Ｓａｏ Ｐａｕｌｏꎬ Ｊꎬ Ｂｅａｎꎬ ａｎｄ ＥＭ２ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ:
ＮＣ＿００４０６０ꎬ ＡＦ０５５８８ꎬ ＤＱ８７５５９４ꎬ ＤＱ８３６７１４ꎬ Ｌ３４６７２ꎬ ａｎｄ ＪＮ０５３４６２ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
Ｆｉｇ. ３　 Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＢＭＶ
Ｎｏ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＢＰＭＶꎬ ＴＲＳＶꎬ ＡｒＭＶꎬ ａｎｄ ＴｏＲＳＶ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
３　 讨论
ＬＡＭＰ法的特征是针对目标 ＤＮＡ链上的 ６个
区段设计 ４条不同的引物ꎬ然后再利用具有链置换
特性的 Ｂｓｔ ＤＮＡ 聚合酶在一定温度下进行反
应[４]ꎮ 对于同一病毒的不同分离物ꎬ要找到完全
一致的序列设计 ＬＡＭＰ 引物较难ꎬ其最有效的办
法是找到较为保守的序列ꎬ多设计、合成几组引物ꎬ
采用尽可能多的分离物来筛选引物ꎬ最终确定最合
适的引物ꎮ 本研究共合成了 ４ 组 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 引物ꎬ
通过对不同分离物的检测ꎬ最终发现仅 １组引物合
适ꎮ
本研究建立的 ＳＢＭＶ 实时浊度 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 检
测方法ꎬ在 ２５ μＬ反应体系中ꎬ总 ＲＮＡ含量达到 ２
ｐｇ就能检测出来ꎬ具有较高的灵敏度ꎮ Ｌｅｅ 等[７]
建立的建兰花叶病毒 (Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓꎬ
ＣｙｍＭＶ)ＲＴ￣ＬＡＭＰ方法的检测低限是 ２５ μＬ 反
应体系中ꎬ病毒 ＲＮＡ含量 １ ｐｇ以上ꎮ Ｖａｒｇａ等[９]
３５３
　
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. ４　 Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＢＭＶ
Ｎｏ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ＲＮＡ ｏｆ ２００ ｆｇꎬ ２０ ｆｇꎬ ａｎｄ ｗａｔｅｒ.
Ｆｉｇ. ５　 Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＲＴ￣ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＢＭＶ
Ｍ: ＤＬ２０００ꎻ Ｌａｎｅ １￣７: ２０ ｎｇꎬ ２ ｎｇꎬ ２００ ｐｇꎬ ２０ ｐｇꎬ ２ ｐｇꎬ ２００ ｆｇꎬ ２０ ｆｇ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡꎻ Ｌａｎｅ ８: Ｗａｔｅｒ.
Ｆｉｇ. ６　 Ｖｉｓｕａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＳＢＭＶ ＲＴ￣ＬＡＭＰ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ
１: Ｗａｔｅｒꎻ ２: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ ３: ＳＢ￣ＡＴꎻ ４: ＳＢ￣Ｄꎻ ５: ＳＢ￣Ａ.
建立的李痘病毒(Ｐｌｕｍ ｐｏｘ ｖｉｒｕｓꎬ ＰＰＶ)ＲＴ￣ＬＡＭＰ
检测方法灵敏度与通过 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ进行的实时
荧光 ＲＴ￣ＰＣＲ一致ꎮ Ｗｅｎ 等[６]建立的菜豆荚斑驳
病毒的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ 方法的检测灵敏度比 ＲＴ￣ＰＣＲ
方法高 １ ０００倍ꎮ Ｂｏｕｂｏｕｒａｋａｓ等[１６]建立的桃潜隐
花叶类病毒(Ｐｅａｃｈ ｌａｔｅｎｔ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｏｉｄꎬＰＬＭＶｄ)
的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ检测方法、Ｆｕｋｕｔａ等[８]建立的番茄黄
曲叶病毒(Ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓꎬ ＴＹＬＣＶ)
ＲＴ￣ＬＡＭＰ检测方法ꎬ灵敏度均较普通 ＲＴ￣ＰＣＲ 法
高 １００ 倍ꎮ Ｇｕｏ 等[５] 建立的豇豆重花叶病毒
(Ｃｏｗｐｅａ ｓｅｖｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓꎬ ＣＰＳＭＶ ) 的 ＲＴ￣
ＬＡＭＰ方法的检测灵敏度比 ＲＴ￣ＰＣＲ 方法高 １０
４５３
　
　 ４期 郭立新ꎬ等:逆转录环介导等温扩增技术检测南方菜豆花叶病毒
倍ꎬ与本研究所得结论一致ꎮ
以往相关研究ꎬＲＴ￣ＬＡＭＰ 检测方法主要通过
电泳观察[７~１３]、酶切鉴定[７]及反应产物中加入染
料[７ꎬ １１~１３]等来判断结果ꎬ其弊端是极易污染ꎮ 也
有学者报道ꎬ根据 ＬＡＭＰ 反应后反应管中副产物
焦磷酸镁的浑浊沉淀目视来判断是否有扩增产
物[８ꎬ １０~１１]ꎬ这虽然克服了开盖的不足ꎬ但重复性不
高[１４]ꎮ 本研究利用实时浊度仪将扩增和检测两个
环节同步完成ꎬ通过测量扩增反应副产物产生的浑
浊物即焦磷酸镁来判断目标 ＤＮＡ 是否存在ꎬ整个
检测过程完全闭管ꎬ不需 ＰＣＲ后处理ꎬ消除了 ＰＣＲ
产物的污染ꎮ 此外ꎬ钙黄绿素是一种螯合剂ꎬ反应
前与试剂中的锰离子结合处于淬灭状态ꎬ扩增反应
的副产物焦磷酸离子与锰离子结合释放钙黄绿素ꎬ
淬灭状态解除ꎬ发出黄绿色荧光ꎬ通过观察荧光的
有无可判断是否有扩增[２１]ꎮ 本研究在体系中加入
钙黄绿素进行反应ꎬ建立了 ＳＢＭＶ 的 ＲＴ￣ＬＡＭＰ
目视检测法ꎮ 该方法非常适合基层单位进行田间
ＳＢＭＶ的普查ꎬ尤其适合现场检测ꎬ具有较强的推
广价值ꎮ
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ｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａ￣
ｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ ｍｏｓａｉｃ ｖｉ￣
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ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈ￣
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责任编辑:张宗英
６５３