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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第8期
改良逆转录环介导等温扩增检测技术快速实时检测
H9亚型禽流感病毒
但晓雅1，2 董英1 邹明强2 薛强2 杜景娇2
（1 江苏大学，镇江 212013 ；2 中国检验检疫科学研究院，北京 100123）
摘 要： 利用改良逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）技术建立一种快速、灵敏的检测方法用于 H9亚型禽流感病毒检测。
根据 H9亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因保守区序列中的 8个区段设计 6条特异性引物，在恒温条件下进行核酸扩增反应，并
以琼脂糖凝胶电泳和目视检查绿色荧光两种方法对扩增结果进行判定。结果表明，RT-LAMP的最小检测限为 100 fg，灵敏度比 PT-
PCR高 100倍，且与 H5亚型、H7亚型禽流感病毒，新城疫病毒（NDV）无交叉反应。目视检查绿色荧光与常规琼脂糖凝胶电泳
的判定结果一致。整个扩增检测过程在 35 min内即可完成。利用临床样本对 RT-LAMP法进行验证，结果与 RT-PCR一致。由实时
浊度分析得到的标准曲线，计算出临床样本中的病毒质粒拷贝数均在 2×107-2×104之间。因此，本研究建立的 RT-LAMP 方法快速、
灵敏、特异性强，是 H9 亚型禽流感病毒的一种高效检测方法。
关键词： H9亚型禽流感病毒 逆转录环介导等温扩增 快速检测 实时
Rapid and Real-time Detection of H9 Subtype Avian Influenza Virus by
Improved Reverse Transcriptase Loop-mediated Isothermal
Amplification Assay
Dan Xiaoya1，2 Dong Ying1 Zou Mingqiang2 Xue Qiang2 Du Jingjiao2
（1Jiangsu University，Zhenjiang 212013；2 Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing 100123）
Abstract: It was to develop a rapid and high sensitive detection method for H9 subtype avian influenza virus by the improved reverse
transcriptase loop-mediated isothermal amplification（RT-LAMP）. According to the sequences of H9 subtype AIV hemagglutinin gene, six
primers specific to the eight site of HA gene were designed, and the reactions were under isothermal conditions. Detection of gene amplification
could be accomplished by agarose gel electrophoresis as well as visualized by adding fluorescent reagent. The results showed that the detection
limit of RT-LAMP assay was 100 fg, which was 100-fold higher than that of RT-PCR. The assay had no cross reaction with H5, H7 subtype AIV
and Newcastle disease virus（NDV）. Detection results were identical to using gel electrophoresis and fluorescent reagent. The amplification
method can be completed within 35 min. The comparative evaluation of the RT-LAMP assay for clinical diagnosis revealed 100% concordance
with RT-PCR. The copies of virus in clinical samples was 2×107-2×104, as determined from standard curve based on the time of positivity.
These results suggested that the newly developed RT-LAMP assay is a sensitive and specific method for rapid detection of H9 subtype AIV
infield conditions.
Key words: H9 subtype avian influenza virus Reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification（RT-LAMP） Rapid
detection Real-time
禽流感（avian influenza，AI）是由 A 型流感病
毒（avian influenza virus，AIV）引起的一种禽类传
染病，被列入国际生物公约动物类传染病名单［1］。
根据血凝素（Hemagglutinin，HA）的抗原差异可将
收稿日期 : 2012-02-13
基金项目 : 国际科技合作项目（2009DFA32720）,“十一五”国家科技支撑计划（2009BAK61B04）
作者简介 : 但晓雅 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 食品安全检测 ; E-mail: xiaoya.dan@163.com
通讯作者 : 邹明强 , 男 , 博士 , 研究方向 : 分析科学及装备的研究与开发 ; E-mail: mingqiangz@sina.com
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期126
AIV 分为 16 个 HA 亚型。其中，H9 亚型病毒从 20
世纪 90 年代初开始在家禽中广泛传播［2］。20 世纪
90 年代后期，韩国、南亚、中东、南非和欧洲国家
均发现 H9 病毒［3-7］。在我国，H9 亚型病毒主要在
鸡鸭中传染［8］。因此，建立 H9 亚型病毒快速检测
技术，将对禽流感的监测与防控发挥重要作用。
目前，对 AIV 的诊断主要依靠流行病学与临床
诊断，确诊依赖于病毒分离、病毒抗原与血清抗体
等监测。病毒分离和血凝抑制试验是检测 AIV 和鉴
定其亚型的标准方法，但费时费力［9］。此外，分子
生物学方法有逆转录 - 聚合酶链式反应（RT-PCR），
实时定量 PCR［10］。但是这些方法耗时长，操作繁琐，
很难应用到众多小型的一线实验室。环介导恒温扩
增（LAMP）是 2000 年由 Notomi 等［11］发明的一种
核酸扩增技术，在恒温下即可实现快速、高效、灵敏、
特异的检测。目前，该技术已成功应用于多种病原
微生物的检测［12-15］。本研究对之前报道的逆转录环
介导逆转录等温扩增（RT-LAMP）方法［16］的条件
进行优化改良，建立了 H9-RT-LAMP 体系，并以两
种不同的判定方法对扩增产物进行定性分析。旨为
H9 亚型禽流感病毒的快速检测提供一种有效的新
途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 毒株 H9 亚型禽流感病毒尿囊液（血凝效价
为 28）为中国检验检疫科学研究院检测技术与装备
研究所实验室保存。
1.1.2 主要试剂与仪器 病毒 RNA 提取试剂盒、
pGM-T 克隆试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天根
公司 ；RT-PCR 扩增试剂盒 Access QuickTM RT-PCR
System 购自 Promege 公司 ；甜菜碱购自 Sigma 公司 ；
dNTP Mix、10×ThermoPol Buffer、BstDNA 聚合酶（大
片段）购自 Biolabs 公司 ；DNA Marker D2000 购自天
根公司 ；PCR 仪购自德国 Eppendorf 公司 ；电泳仪购
自美国 Bio-Rad 公司 ；凝胶成像系统购自美国 Kadak
公司 ；DK-8D 型电热恒温水槽购自上海一恒科技公
司 ；LA320-C 实时浊度检测仪购自日本荣研公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 利用 AIV 通用型引物
F3/B3［17］对病毒 RNA 进行 RT-PCR 反应，反应产
物大小为 151 bp，将其送至 Invitrogen 公司测序。测
序结果在 GenBank 上进行 BLAST 分析，选择同源性
为 99% 的 H9N2 HA 基因序列 A/chicken/Guangdong/
GZ02/2008（H9N2）（GenBank 登 录 号 EU926627）。
运用Oligo 6.0软件设计能扩增出HA基因全序列的上
游引物 5-AGGGGAATTTCACAACCACTC-3和下游
引物 5-ACAAGGGTGTTTTTGCCAATTA-3，RT-PCR
反应后产物大小为 1 700 bp，测序后得到的结果与
EU926627 同源率达到 97%。经基因序列对比后，
选择 H9 亚型禽流感病毒 HA 基因的一段高度保守
片段作为靶序列，应用在线软件 PrimerExplorer V4
（http：//primerexplorer.jp/e/）设计 6 条特异性引物（表
1）并合成。
引物名称 引物序列 （5-3）
F3 CATTCTACAGAAGCATGAGATG
B3 AATGGTTTGAAGGCCCTAT
FIP GCCCCACATGAAAAGAATGTTCTTTGTTGACTCAAA-
AGAACAACGC
BIP AATCACCCACCCACTGATACTATCTTCTGTTGCCAC-
ACTTG
LF GTGTATTGGGCGTCTTGAATAGG
LB ACGCAGACAGATCTGTACACA
表 1 H9亚型禽流感病毒 RT-LAMP引物序列
1.2.2 病毒 RNA 的提取及阳性质粒的构建 参照病
毒 RNA 提取试剂盒说明书对试验所用的毒株进行
RNA 提取，-80℃保存备用。紫外分光光度法测量
RNA 溶液在 260 nm 处的 OD 值并根据以下公式计算
其浓度 ：
RNA 浓度（μg/μL）=OD260×40×10-3×X
式中，X 为样品的稀释倍数。将提取后的 RNA 进行
RT-PCR 扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳观察结果后切
胶回收，参照 pGM-T 克隆试剂盒、质粒小提试剂盒
的说明构建阳性质粒，测序鉴定。
1.2.3 RT-LAMP 方法的优化及建立 通过对反应温
度、反应时间，特异性引物浓度、MgSO4 溶液浓度、
甜菜碱浓度等条件的优化，建立 H9 亚型 AIV 的
RT-LAMP 反应体系 25 μL：10× ThermoPoL Buffer 2.5
μL，8 U/μL Bst DNA 聚合酶 1 μL，5 U/μL AMV 反转
录酶 1 μL，10 mmol/L dNTPs 1 μL，5 mmol/L 甜菜碱
2012年第8期 127但晓雅等 ：改良逆转录环介导等温扩增检测技术快速实时检测 H9 亚型禽流感病毒
5 μL，100 mmol/L MgSO4 1 μL，40 μmol/L FIP/BIP 各
1 μL、10 μmol/L F3/B3 各 0.5 μL、20 μmol/L LF/LB 各
1 μL，钙黄绿素染料1 μL，RNA模板5 μL，DEPC水2.5
μL。阴性对照不加模板 RNA，加 DEPC 水 5 μL。试
管中加入各组分后混匀，短暂离心，然后立即放入
65℃水浴锅中反应 30 min，再置于 80℃水浴锅中作
用 5 min 终止反应。取扩增产物 3 μL，于 1% 琼脂糖
凝胶进行检测，观察梯形条带，以证实是否发生了
反应。此外，在反应体系中加入 1 μL 钙黄绿素作为
荧光指示剂，反应结束后肉眼可见阳性管溶液变绿，
阴性对照管溶液为较浅的桔红色。
1.2.4 RT-PCR 反应 上、下游引物分别是 RT-LAMP
的外引物 F3 和 B3，以 5 μL 提取的 RNA 作为模板，
反应程序 ：45℃ 反转录 45 min ；94℃ 预变性 3 min ；
94℃变性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃延伸 1 min，30
个循环 ；72℃延伸 10 min。取扩增产物 3 μL，进行
琼脂糖凝胶电泳，得到大小为 176 bp 的条带。
1.2.5 RT-LAMP 的灵敏度试验 将从病毒尿囊液中
提取的 H9RNA 模板进行系列 10× 倍比稀释，最低
稀释倍数到 10-7，并使用紫外分光光度计测定稀释
前各个梯度的 RNA 浓度，计算出 RNA 质量分别为
100 ng、 10 ng、 1 ng、 0.1 ng、10 pg、 1 pg、 100 fg、10
fg。分别取各稀释倍数的 RNA 5 μL 进行 RT-LAMP
和 RT-PCR 反应，确定该方法的灵敏度。
1.2.6 RT-LAMP 的特异性试验 利用优化好的 RT-
LAMP 反应体系，以 H9 亚型 AIV、H5 亚型 AIV、
H7 亚型 AIV 及 NDV 核酸为待检样品进行检测，检
验 RT-LAMP 方法的特异性。
1.2.7 实时浊度法判定 RT-LAMP 的结果 将 RT-
LAMP 体系置于实时浊度检测仪，设定好反应时间
和温度后启动程序。反应结束后根据图像判定扩增
结果，浊度达到 0.1 时即为阳性。
1.2.8 临床样本检测 对中国农大提供的 8 份临床
样本（6 份阳性，2 份阴性）进行 RT-LAMP 检测，
并与 RT-PCR 检测法的检测结果进行比较。
2 结果
2.1 RT-LAMP方法的优化及建立
通过对反应中各条件的优化，建立 H9 亚型
AIV 的 RT-LAMP 反应体系，反应结束后的可视结果
图 1 目视检查绿色荧光
1. 阳性 ；2. 阴性
2.2 RT-LAMP的灵敏度
分别以各稀释度的 RNA 为模板，进行 RT-
LAMP 扩增，利用 1% 琼脂糖凝胶电泳及目视检查绿
色荧光判定 RT-LAMP 结果（图 2-A，图 2-B）显示，
所建立的 RT-LAMP 方法检测灵敏度为 10-6 稀释倍
数，即可检测到 100 fg 的 RNA。以 1% 琼脂糖凝胶
电泳判定 RT-PCR 的扩增结果（图 2-C）显示，RT-
PCR 的灵敏度为 10-4 稀释倍数，即检测到 10 pg 的
RNA。可见RT-LAMP的灵敏度是RT-PCR的 100倍。
2.3 RT-LAMP的特异性
分别以 H9 亚型 AIV、H5 亚型 AIV、H7 亚型
AIV 及 NDV 核酸为模板进行 RT-LAMP 扩增，经
1％琼脂糖凝胶电泳及目视检查绿色荧光判定，RT-
LAMP 结果（图 3-A，图 3-B）显示，只有 H9 亚型
AIV 出现特征性梯形条带，其他病毒均扩增不到条
带，表明本试验针对 H9 亚型禽流感病毒设计的 RT-
LAMP 引物具有较好的特异性。
2.4 实时浊度法判定RT-LAMP的结果
除了上述的凝胶电泳成像和目视检查绿色荧
光，亦可利用实时浊度检测仪监测反应液的浊度变
化，从而判定 RT-LAMP 反应的扩增效果。结果（图
4）显示，在 2×108-2×104 拷贝数的范围内，模板
DNA每个稀释度拷贝数与其浊度达到阳性检出值0.1
时的时间呈现出良好的线性相关性，因而可以绘制
出标准曲线，如图 5 所示。
2.5 临床样本检测
将采集到的 6 份被感染 H9-AIV 样本和 2 份未
感染样本利用上述体系进行检测，RT-LAMP 与 RT-
PCR 的检测结果一致，检出率均达到 100%，阳性
如图 1 所示。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期128
样本中的质粒拷贝数均在 2×107-2×104 之间。
3 讨论
鉴于 H9 亚型 AIV 在中国地区广泛的流行性及
其重要的公共卫生意义，很有必要对其进行快速、
精准地鉴别。传统的 AIV HA 亚型鉴定方法有血凝
试验、血凝抑制试验、单抗 ELISA 等，需要针对不
同亚型病毒分别进行测试［18］。荧光 RT-PCR 的发
图 2 RT-LAMP（A，B）和 RT-PCR的灵敏度（C）
M 为 Ladder Marker, 1-8. 102-10-8 倍稀释的 H9-AIV RNA
M. Ladder Marker; 1-5 分别为 H9-AIV, H5-AIV, H7-AIV, NDV, 阴性对照
图 3 RT-LAMP的特异性 图 4 实时浊度判定 RT-LAMP反应的扩增结果
1-5. 分别为 2×104-2×108 每个稀释度的拷贝数
图 5 H9-AIV LAMP体系实时浊度标准曲线
展使 AIV 核酸检测更加快捷［19］，但需要专用的仪
器，检测成本偏高，一般的实验室难于推广。目前，
常规的 RT-PCR 仍然是较为理想的检测方法。RT-
LAMP 方法是一种新型的恒温核酸扩增技术。它通
过针对靶基因的 6 个区域设计 4 种特异引物，利用
链置换型 DNA 聚合酶，在等温条件下（60-65℃）
几十分钟就可扩增出靶序列拷贝，它的产物在琼脂
糖凝胶电泳图像上会呈现出梯状条带。另外，特殊
的荧光染料与反应体系中的 Mn+ 及反应所产生的
P2O74- 相结合，从而使阳性结果出现肉眼可判别的荧
光绿色。此外，还可以通过实时浊度监测判定扩增
结果，浊度≥0.1时即为阳性。RT-LAMP法灵敏度高、
特异性强、快速、简便，且无需开盖一步完成，避
免了气溶胶污染。若使用目视判别绿色荧光的方法，
检测过程无需特殊的仪器设备，非常适合基层研究
及现场的快速检测。若使用实时浊度检测的方法，
则可对扩增过程进行实时定量分析，为 RT-LAMP 的
进一步科研奠定基础。
2012年第8期 129但晓雅等 ：改良逆转录环介导等温扩增检测技术快速实时检测 H9 亚型禽流感病毒
4 结论
本研究针对 H9 亚型 AIV 的 HA 基因设计了 6
条特异性引物，其中 2 条环引物的加入大大加快了
反应速度。通过对 RT-LAMP 反应体系各个条件的优
化，建立了 H9 亚型 AIV 的 RT-LAMP 快速检测方法。
除常规的琼脂糖凝胶电泳外，目视检查绿色荧光及
实时浊度检测均可准确、快速甚至定量地判定扩增
结果，从而使得反应体系在 35 min 内即可完成从扩
增到鉴定的检测过程。该法操作简单，其灵敏度是
RT-PCR 的 100 倍，亦表现出很强的特异性。本研究
建立的 H9 亚型 AIV 改良 RT-LAMP 快速检测技术，
具有较强的应用价值，为 H9 亚型禽流感的检测提
供了更加快速高效的技术。
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（责任编辑 李楠）