全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４５(１): ８８￣９２(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０３￣０１ꎻ 修回日期: ２０１４￣１０￣０９
基金项目: 质检公益性行业科研专项项目(２０１３１００６８)ꎻ 浙江省重中之重林学一级学科开放基金项目(ＫＦ２０１３３０)ꎻ 浙江农林大学科研发
展基金项目(２０１３ＦＫ０１９)
通讯作者: 周雪平ꎬ教授ꎬ主要从事植物病毒学研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｚｚｈｏｕ＠ｚｊｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０１.０１３
研究简报
利用小 ＲＮＡ深度测序和组装技术鉴定紫藤花叶病病原
苏 秀１ꎬ２ꎬ 徐 毅１ꎬ 陈 莎１ꎬ 傅 帅１ꎬ 钱亚娟１ꎬ 张立钦２ꎬ 周雪平１∗
( １浙江大学生物技术研究所ꎬ杭州 ３１００５８ꎻ ２浙江农林大学亚热带森林培育国家重点实验室培育基地ꎬ临安 ３１１３００)
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ Ｗｉｓｔｅｒｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｂｙ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ
ｏｆ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ＳＵ Ｘｉｕ１ꎬ２ꎬ ＸＵ Ｙｉ１ꎬ ＣＨＥＮ Ｓｈａ１ꎬ ＦＵ Ｓｈｕａｉ１ꎬ ＱＩＡＮ Ｙａ￣ｊｕａｎ１ꎬＺＨＡＮＧ Ｌｉ￣ｑｉｎ２ꎬ ＺＨＯＵ
Ｘｕｅ￣ｐｉｎｇ１ ( １ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００５８ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２Ｔｈｅ Ｎｕｒｔｕｒｉｎｇ Ｓｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔａｔｅ
Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ Ｓｉｌｖｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｌｉｎ’ａｎ ３１１３００ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｐｌａｎｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｖｉｒｕｓｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ (ｓＲＮＡ) ｍｅｄｉａｔｅｄ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ.
Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｓＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｃａｎ ｂｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ｄｅ ｎｏｖｏ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｏｍｅｓ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｖｉｒｕｓ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄ Ｗｉｓｔｅｒｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｓａｍｐｌｅｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｚｉｊｉｎｇａｎｇ Ｃａｍｐｕｓ
ｏｆ Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｓＲＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ. Ａｆｔｅｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｏｔａｌ
ｓＲＮＡｓꎬ ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ Ｗ. ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｌｅａｖｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｗｉｓｔｅｒｉａ ｖｅｉｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ (ＷＶＭＶ) . Ｔｈｅ ｌｉｂｒａｒｙ
ｇｅｎｅｒａｔｅｄ １８. ９ ｍｉｌｌｉｏｎ ｓＲＮＡ ｒｅａｄｓꎬ ｏｆ ｗｈｉｃｈ ０. ３２ ｍｉｌｌｉｏｎ ｗｅｒｅ ＷＶＭＶ￣ｄｅｒｉｖｅｄ ｓＲＮＡｓ. Ｕｓｉｎｇ ｄｅ ｎｏｖｏ
ａｓｓｅｍｂｌｙꎬ ２３.３％ ｏｆ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｇｅｎｏｍｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ ＷＶＭＶ ｗａｓ
ｏｂｔａｉｎｅｄ. Ｔｏ ｃｏｎｆｉｒｍ ｔｈｅ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ＷＶＭＶ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓꎬ ＷＶＭＶ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ (ＣＰ) ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ
ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ＲＴ￣ＰＣＲꎬ ａｎｄ ｅｎｓｕｒｅｄ ｂｙ Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ. Ｔａｋｅｎ ｔｏｇｅｔｈｅｒꎬ ｔｈｅ ｄａｔａ ｓｕｇｇｅｓｔ ｔｈａｔ ｓＲＮＡ ｄｅｅｐ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｓ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｗｏｏｄｙ ｐｌａｎｔｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｓｍａｌｌ ＲＮＡꎻ Ｗｉｓｔｅｒｉａ ｖｅｉｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓꎻ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０１￣００８８￣０５
ＲＮＡ沉默(ＲＮＡ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ)是一种在真核生物
体内普遍保守的基于核酸序列特异性抑制基因表达
的调控机制[１]ꎮ ２００９年 Ｋｒｅｕｚｅ 等[２]发现病毒特异
的小 ＲＮＡ(ｓｍａｌｌ ＲＮＡꎬ ｓＲＮＡ)在序列上是重叠的ꎬ
因此推测通过深度测序技术获得的大量 ｓＲＮＡ序列
能用来组装病毒的基因组并用来鉴定和发现新病
毒ꎮ 利用 ｓＲＮＡ深度测序技术已在作物和昆虫上鉴
定发现多种病毒[３、４]ꎬ但在木本植物上还未见报道ꎮ
紫藤(Ｗｉｓｔｅｒｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ)是城市园林绿化美化
的主要植物ꎬ在公园、校园、庭院等地普遍种植ꎮ 由
紫藤花叶病毒引起的紫藤花叶病在捷克、意大利、
荷兰、美国、波兰、德国等都有发生ꎬ已成为一种世
界性的病害ꎮ 紫藤花叶病主要表现花叶、斑驳、黄
化、脉明等症状ꎬ感病紫藤开花能力明显下降ꎬ严重
影响其观赏性和经济价值ꎮ ２００６ 年 Ｆａｎ 等[５]报道
了紫藤脉花叶病毒北京分离物(ＷＶＭＶ￣ＢＪ)的全
序列ꎬ并证实 ＷＶＭＶ￣ＢＪ 是 Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ 中的一种新
病毒ꎮ 本文利用深度测序技术对采自浙江的紫藤
花叶病病原进行了鉴定ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 材料来源
表现花叶症状的紫藤病叶采自浙江大学紫金
１期 苏 秀ꎬ等:利用小 ＲＮＡ深度测序和组装技术鉴定紫藤花叶病病原
港校区校园内ꎮ 感病紫藤叶片表现褪绿、花叶、斑
驳、黄化、脉明、叶片变小、卷曲等症状ꎬ并出现小的
星状斑ꎬ褪绿部分生长较慢ꎬ致使叶片畸形(图 １)ꎮ
Ｆｉｇ. １ Ｗｉｓｔｅｒｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｌｅａｖｅｓ ｓｈｏｗｉｎｇ
ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｐｏｔｓꎬ ｂｌｏｔｃｈｅｓ ａｎｄ ｌｅａｆ
ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎ
１.２ 植物总 ＲＮＡ提取和 ｓＲＮＡ纯化
采集的样品用 Ｔｉａｎｇｅｎ ｍｉＲｃｕｔｅ ｍｉＲＮＡ 提取
分离试剂盒提取总 ＲＮＡꎬ操作步骤参照说明书进
行ꎬ然后运用醋酸锂和聚乙二醇法(ＬｉＡＣ / ＰＥＧ)分
离其中的 ｓＲＮＡꎬ经 １５％的 ＰＡＧＥ分离切割 １８~ ２８
ｎｔ 的 ｓＲＮＡꎮ
１.３ ｓＲＮＡ的 Ｓｏｌｅｘａ深度测序
上述 ｓＲＮＡ样品送至上海美吉生物医药科技
有限公司进行测序ꎮ 测序流程:运用 ＴａＫａＲａ ｓｍａｌｌ
ＲＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ (ＤＲＲ０６５) 将分离的 １８~２８ ｎｔ的
ｓＲＮＡ分别在 ３′端和 ５′端加上接头ꎻ随机引物反转
录获得 ｃＤＮＡ 第一链ꎻＰＣＲ 富集ꎻ产物回收(６％
Ｎｏｖｅｘ ＴＢＥ ＰＡＧＥ ｇｅｌꎬ１.０ ｍｍꎬ１０ ｗｅｌｌ)ꎻＴＢＳ３８０
(Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ)定量ꎬ按数据比例混合上机ꎻｃＢｏｔ 上桥
式扩增ꎬ 生成 ｃｌｕｓｔｅｒｓꎻ 运用 Ｉｌｌｕｍｉａ Ｓｏｌｅｘａ 的
Ｈｉｓｅｑ２０００测序平台ꎬ进行 １×５０ ｂｐ测序试验ꎮ
１.４ Ｓｏｌｅｘａ测序数据的预处理
运用生物信息学手段对原始数据进行处理:去
接头序列ꎬ去污染序列ꎬ去低质量碱基ꎬ去未插入 ３′
接头、５′接头的 ｒｅａｄｓꎬ获得不含接头序列的 ｓＲＮＡ序
列ꎬ在此基础上筛选出 １８~２８ ｎｔ的 ｓＲＮＡ序列ꎮ
１.５ 测序数据的序列拼接、ＢＬＡＳＴ 分析及病毒相
关序列的筛查
用 Ｖｅｌｖｅｔ软件对上述 １８~ ２８ ｎｔ ｓＲＮＡ 进行序
列拼接ꎬ得到的 ｃｏｎｔｉｇｓ 用 ＢＬＡＳＴ (Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ
Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ) 进行比对并注释ꎬ经过
ＢＬＡＳＴ同源比对筛查到与紫藤脉花叶病毒北京分
离物(ＷＶＭＶ￣ＢＪꎬＧｅｎＢａｎｋ 登录号 ＡＹ６８６８１６)同
源ꎮ 以ＷＶＭＶ￣ＢＪ 为参考基因组ꎬ应用生物信息
手段比对得到病毒来源的 ｓＲＮＡꎬ并对产生 ｓＲＮＡ
的热点区进行统计ꎮ
１.６ ＲＴ￣ＰＣＲ扩增、克隆及序列分析
提取植物总 ＲＮＡꎬ采用 ＴａＫａＲａ 公司的 ＲＮＡ
Ｒｅｖｅｒｓｅ ＰＣＲ Ｋｉｔ (ＡＭＶ) 反转录成 ｃＤＮＡꎬ以 ｃＤ￣
ＮＡ为模板ꎬ利用根据拼接到的序列设计的特异性
引物和 Ｐｈｕｓｉｏｎ 超保真 ＰＣＲ 试剂盒(ＮＥＢ公司)进
行 ＰＣＲ 扩增ꎬＰＣＲ 产物纯化后连接到 ＰＺｅｒｏＢａｃｋ
载体(Ｔｉａｎｇｅｎ)ꎬ并转化 Ｅ. ｃｏｌｉ 菌株 ＤＨ５α 感受态
细胞ꎬ涂布于含氨苄青霉素的 ＬＢ 平板上ꎬ培养过
夜后挑选单菌落ꎬ用 Ｔａｑ 酶 ＰＣＲ 扩增鉴定阳性克
隆ꎬ随机挑取 ２ 个阳性克隆送 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司进行
测序ꎬ获得的序列利用 ＢＬＡＳＴ进行比较分析ꎮ
２ 结果
２.１ 感病紫藤叶片 ｓＲＮＡｓ高通量测序结果
感病紫藤叶片经总 ＲＮＡ提取ꎬｓＲＮＡ分离、纯化
和 Ｓｏｌｅｘａ测序后得到 １８ ９０２ ０４６个 ｒｅａｄｓꎬ经过 Ｓｏｌｅｘａ
ｐｉｐｅｌｉｎｅ加工后ꎬ得到介于 １８~２８ ｎｔ 之间的 ｒｅａｄｓ 为
４ ６７３ ４４７个ꎬ占总 ｓＲＮＡ ｒｅａｄｓ数量的 ２４.７２％ꎮ
２.２ ＷＶＭＶ来源 ｓＲＮＡｓ (ｖｓｉＲＮＡｓ)数据分析
以 ＷＶＭＶ￣ＢＪ 为参考基因组ꎬ将上述经过筛
选的 ４ ６７３ ４４７个 ｒｅａｄｓ进行本地 ＢＬＡＳＴｔ分析ꎬ在
不包含重复序列的情况下ꎬ获得与参考基因组完全
匹配的 ｒｅａｄｓ共 ９ ８６８个、允许 １个错配的 ｒｅａｄｓ共
４５ ５１０个、允许 ２ 个错配的 ｒｅａｄｓ 共 １１３ ９３２ 个ꎮ
重点分析了允许 １个错配的情况ꎮ 一共有 ３１５ １２３
个 ｒｅａｄｓ(包含重复序列)与 ＷＶＭＶ￣ＢＪ 匹配ꎬ其中
２０ ~ ２４ ｎｔ ｖｓｉＲＮＡ 数量分别为 ７ ４１０、 １９５ ６９７、
９９ ５３６、２ ９５０ 和 １ ２０８ 个ꎬ其他长度的 ｖｓｉＲＮＡ 数
９８
植物病理学报 ４５卷
量为 ８ ４０２个ꎮ 有 １ ７９４ ６８１个来自正义链ꎬ１３５ ６５５
个来自负义链ꎮ
通过对不同长度的 ｖｓｉＲＮＡ 的读数百分比分
析(图 ２)ꎬ可以看出 ２１ ｎｔ和 ２２ ｎｔ大小的 ｓＲＮＡ占
主要部分ꎮ 不同长度 ｓＲＮＡ 占总数的百分比分别
为:２０ ｎｔ ２.３５％、２１ ｎｔ ６２.１０％、２２ ｎｔ ３１.５９％、２３ ｎｔ
０.９４％、２４ ｎｔ ０.３８％ꎬ其他长度占 ２.６７％ꎮ 由此可
见ꎬｖｓｉＲＮＡ以 ２１ ｎｔ和 ２２ ｎｔ大小为主ꎬ可以推测紫
藤的 ＤＣＬ４和 ＤＣＬ２在抗病毒中起了主要的作用ꎮ
Ｆｉｇ. ２ Ｓｉｚｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ＷＶＭＶ￣ｄｅｒｉｖｅｄ
ｓＲＮＡｓ
将 ｖｓｉＲＮＡｓ 根据来自 ＷＶＭＶ 的正义链还是
负义链进行分析ꎬ发现来自正义链的(５７％)略高
于来自负链的 ( ４３％)ꎮ ＷＶＭＶ 属于单链正义
ＲＮＡ病毒ꎬ其基因组正义链含量远高于互补链ꎬ而
产生的 ｓＲＮＡ比例比较接近ꎬ揭示 ＷＶＭＶ 复制过
程中产生的双链 ＲＮＡ中间体可能是 ｓＲＮＡ产生的
主要来源ꎮ
通过对ＷＶＭＶ来源 ｓＲＮＡｓ 的 ５′端起始核苷
酸碱基分析 (图 ３) 发现ꎬ总的 ＷＶＭＶ 来源的
ｓＲＮＡｓ中ꎬ５′端起始核苷酸碱基以“Ｕ”、“Ｇ”、“Ｃ”、
“Ａ”开头的比例分别是 ２８.９６％、２０.２９％、１９.０３％
和 ３１.７０％ꎬ以“Ａ”或“Ｕ”开头的 ｓＲＮＡｓ 要比以
“Ｇ”或“Ｃ”开头的多ꎬ并且在不同长度的ｓＲＮＡｓ中
也遵循这样的规律ꎮ 这与受侵染拟南芥植株中
ＴＭＶ￣Ｃｇ来源的 ２１ ｎｔ ｓＲＮＡｓ 的 ５′端起始核苷酸
碱基分布一致ꎮ 研究证实ꎬ拟南芥中不同的 ＡＧＯ
蛋白在招募内源 ｓＲＮＡ 时ꎬ对其 ５′端起始核苷酸碱
基具有不同的偏好性ꎻ然而ꎬ在紫藤与病毒的互作
过程中ꎬＡＧＯ蛋白在招募 ｓＲＮＡｓ 时是否也遵循同
样的规律还需进一步的研究ꎮ
利用基于 Ｐｅｒｌ语言脚本的程序分析了ＷＶＭＶ
来源 ｓＲＮＡ在寄主中的热点分布(图 ４)ꎮ 从紫藤
叶片分离到的来源于 ＷＶＭＶ 的 ｓＲＮＡ 特异序列
几乎覆盖了该病毒的全基因组ꎬ但在某些特定的区
域ꎬ也称为热点(ｈｏｔｓｐｏｔｓ)区ꎬ各个 ｓＲＮＡ序列出现
的频率比较集中ꎮ 在 ＷＶＭＶ 基因组的 ２ ６００ ~
２ ７００、２ ９００~３ ０５０、５ ９００ ~ ６ ０００、７ ８００ ~ ７ ９００ 以
及 ９ ２００~９ ５００ 位置 ｓＲＮＡ出现的频率较高ꎬ尤其
是在 ９ ３００~９ ３９０区域ꎬｓＲＮＡ总量达到 ４ ２３０ 个ꎬ
并且大部分来自病毒的正义链ꎬ说明该位点可能存
在典型的 ＲＮＡ双链结构ꎮ
Ｆｉｇ. ３ ＷＶＭＶ￣ｄｅｒｉｖｅｄ ｓＲＮＡｓ ５′ｔｅｒｍｉｎａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
０９
１期 苏 秀ꎬ等:利用小 ＲＮＡ深度测序和组装技术鉴定紫藤花叶病病原
Ｆｉｇ. ４ Ｐｏｌａｒｉｔｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ＷＶＭＶ￣ｄｅｒｉｖｅｄ ｓＲＮＡｓ
Ｆｉｇ. ５ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ＷＶＭＶ ｓＲＮＡ ｃｏｎｔｉｇｓ
Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｌｏｒｓ ｏｆ ｃｏｎｔｉｇｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＷＶＭＶ￣ＢＪ ｇｅｎｏｍｅ.
Ｒｅｄ ｍｅａｎｓ ｈｉｇｈｅｓｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙꎬ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｐｉｎｋ ａｎｄ ｇｒｅｅｎ.
２.３ ＷＶＭＶ的 ＲＴ￣ＰＣＲ验证
用 ｖｅｌｖｅｔ软件对 １８ ~ ２８ ｎｔ ｓＲＮＡ 进行序列组
装拼接ꎬ共得到 ８９４条 ｃｏｎｔｉｇｓꎬ共有 ２３条序列与已
知的 ＷＶＭＶ￣ＢＪ 序列匹配ꎬ总长 ２ ２５４ ｎｔꎬ占
ＷＶＭＶ￣ＢＪ基因组全长 (９ ６９５ ｎｔ)的 ２３. ３％ (图
５)ꎮ 根据拼接到的序列设计特异引物ꎬ用 ＲＴ￣ＰＣＲ
方法ꎬ从测序样品的总 ＲＮＡ中克隆到 ９７１ ｂｐ 的片
段ꎬ经测序及同源比对分析ꎬ与 ＷＶＭＶ￣ＢＪ 病毒序
列相似性为 ８７％ꎬ这段序列编码 ＷＶＭＶ 的 ＣＰ 基
因(ＧｅｎＢａｎｋ登录号 ＫＪ８３６２８２)ꎮ 根据 ＩＣＴＶ 对马
铃薯 Ｙ病毒属病毒命名的规定ꎬ此分离物与已知
的ＷＶＭＶ￣ＢＪ是同一种病毒ꎮ
３ 讨论
传统的植物病毒检测需要对病毒进行纯化和
分离ꎬ对样品纯化要求较高ꎬ且需要对病原的生物
学特性、理化特性、基因组特性、血清学特性等有预
先的了解ꎬ对于未知病原ꎬ这些检测方法的使用就
受到了极大限制ꎬ需要较长的研究周期和繁琐的研
究过程ꎮ 木本植物上的病毒往往含量比较低ꎬ且很
难通过摩擦接种的方式进行人工接种ꎬ因此ꎬ传统
方法很难检测木本植物病毒ꎬ相关的研究报道很
少ꎮ
已报道的紫藤花叶病毒北京分离物病原的鉴
定是在酶联免疫吸附试验(ＥＬＩＳＡ)基础上ꎬ通过 ７
次逆转录￣聚合酶链反应 (ＲＴ￣ＰＣＲ)ꎬ并结合 ５′
ＲＡＣＥ等方法得到的[５]ꎮ 这些试验方法工作量很
大ꎬ耗时长ꎬ较难用于紫藤等木本植物的病毒检测
与鉴定ꎮ 本文利用小 ＲＮＡ 深度测序和组装技术ꎬ
将分离自浙江的紫藤花叶病病原鉴定为 ＷＶＭＶꎮ
深度测序技术的发展开辟了大规模快速诊断植物
病毒的途径ꎬｓＲＮＡ深度测序已在许多植物的未知
病原鉴定中发挥了重要作用ꎮ 利用植物体内的
１９
植物病理学报 ４５卷
ｓＲＮＡ病毒序列ꎬ大大提高了筛查木本植物病毒的
效率ꎮ 伴随着深度测序成本的降低ꎬｓＲＮＡ 深度测
序将成为一种经济有效的可用于木本植物病毒鉴
定的方法ꎬ值得推广使用ꎮ
参考文献
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ｔｉｅｓ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｐｏｔｙｖｉｒｕｓｅｓ [ Ｊ] . Ａｒｃｈ. Ｖｉｒｏ.ꎬ ２００６ꎬ
１５１: ２３１１－２３１９.
责任编辑:于金枝
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